一种瞬时转化提高苹果砧木绿枝扦插生根的方法与流程

1.本发明属于苹果砧木绿枝扦插生根技术领域，特别是涉及一种瞬时转化提高苹果砧木绿枝扦插生根的方法。


背景技术：

2.我国苹果栽培面积232.38万公顷，产量4388.23万吨，分别占世界的48％和54％，种植规模居世界之首，矮化密植集约化生产是苹果产业发展的重要趋势，也是现代苹果栽培制度和模式的主要改革方向，自根砧矮化苗木繁育成为苹果矮化密植产业亟待解决的技术问题，自根砧矮化苗木分为实生自根砧和营养系自根砧苗木，实生自根砧苗木后代严重分离，苗木整齐度、矮化性难以保证，而营养系自根砧苗木可保持母株的优良性状，矮化性整齐一致，适合机械化作业，剪枝管理相对容易，是高标准建园的首选矮化苗木类型，因此，自根砧苗木的繁育技术对于苹果矮化密植产业意义重大。现有方法无法瞬时转化苹果成龄期砧木小金海棠当年生新捎茎皮，提高其绿枝扦插生根率，同时苗木的成活率低。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种瞬时转化提高苹果砧木绿枝扦插生根的方法，以解决了现有的问题：现有方法无法瞬时转化苹果成龄期砧木小金海棠当年生新捎茎皮，提高其绿枝扦插生根率。
4.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明为一种瞬时转化提高苹果砧木绿枝扦插生根的方法，所述瞬时转化提高苹果砧木扦插生根的方法包括以下步骤：
6.(1)构建35s:mdmir156a6过表达载体，转化农杆菌(gv3101)；
7.(2)苹果绿枝插穗的选取制作及预侵染的培养液；
8.(3)设置od600浓度为0.4；
9.(4)把目标基因转入苹果绿枝插穗组织，向(3)中的溶液中施加压强进行真空环境作业，抽真空压强为0.8mpa，时间为5min；
10.(5)缓慢释放真空，使包含有目标基因的农杆菌(gv3101)细胞渗透苹果绿枝插穗中；
11.(6)苹果绿枝插穗侵染后的进行共培养，实现目标基因的瞬时过量表达；
12.(7)绿枝扦插(2g/l)iba处理1min。
13.进一步地，所述步骤(2)中苹果绿枝插穗母株的年龄采用成龄期阶段的植株，苹果绿枝插穗携带mir156基因。
14.进一步地，苹果绿枝插穗需要洗净去除污物,用50％的乙醇溶液进行消毒1min，再在次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3次。
15.进一步地，所述步骤(4)的溶液中施加压强为0.8mpa的真空环境，时间控制为5min。
16.进一步地，所述步骤(3)中od600的最佳浓度控制在0.6。
17.进一步地，所述步骤(5)的渗透过程需要持续一段时间。
18.进一步地，所述步骤(6)中的共培养需要保持2d，其中培养条件为23℃，湿度相对保持在85％。
19.进一步地，所述步骤(7)绿枝扦插时，用0.01％的阿司匹林溶液浸泡插条，能显著提高发芽率。
20.进一步地，所述步骤(7)绿枝扦插时，用0.05％的阿司匹林溶液浸泡移栽苗木，能大幅缩短缓苗期，防止苗木干枯，提高苗木的成活率。
21.本发明具有以下有益效果：
22.1、本发明通过以农杆菌(gv3101菌株)携带35s:mdmir156a6表达载体通过抽真空的方式，实现了瞬时转化苹果成龄期砧木小金海棠当年生新捎茎皮，从而提高其绿枝扦插生根率。
23.2、本发明通过使用阿司匹林溶液的浸泡，实现了对绿枝扦插的发芽率提高，从而能够能大幅缩短缓苗期，防止苗木干枯，提高苗木的成活率。
24.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对方法描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些方法，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1本发明的方法步骤示意图；
27.图2瞬时转化后mir156表达水平检测。
具体实施方式
28.下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的方法仅仅是本发明一部分，而不是全部的方法。基于本发明中的方法，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它方法，都属于本发明保护的范围。
29.请参阅图1-2所示，本发明为一种瞬时转化提高苹果砧木绿枝扦插生根的方法，瞬时转化提高苹果砧木扦插生根的方法包括以下步骤：
30.(1)构建35s:mdmir156a6过表达载体，转化农杆菌(gv3101)；
31.(2)苹果绿枝插穗的选取制作及预侵染的培养液，步骤(2)中苹果绿枝插穗母株的年龄采用童期阶段的植株，木本植物随着节位升高童性逐渐下降，桉树第五节位以下视为童期，插穗扦插生根率70％，显著高于第十五节位以上成龄期插穗的生根率15％，苹果绿枝插穗携带mir156基因，苹果绿枝插穗需要洗净去除污物,用50％的乙醇溶液进行消毒1min，再在次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3次。
32.(3)设置od600浓度为0.4、0.6和0.8，步骤(3)中od600的最佳浓度控制在0.6；
33.(4)把目标基因转入苹果绿枝插穗组织，向(3)中的溶液中施加压强进行真空环境作业，步骤(4)的溶液中施加压强为0.8mpa的真空环境，时间控制为5min；
34.(5)缓慢释放真空，使包含有目标基因的农杆菌(gv3101)细胞渗透苹果绿枝插穗中，渗透过程需要持续一段时间；
35.(6)苹果绿枝插穗侵染后的进行共培养，实现目标基因的瞬时过量表达，步骤(6)中的共培养需要保持2d，其中培养条件为23℃，湿度相对保持在85％；
36.(7)绿枝扦插(2g/l)iba处理1min，以农杆菌(gv3101菌株)携带35s:mdmir156a6表达载体通过抽真空的方式瞬时转化苹果成龄期砧木小金海棠当年生新捎茎皮，提高其绿枝扦插生根率,相关实验数据见下表1。
37.表1
38.[0039][0040][0041]
步骤(7)绿枝扦插时，用0.01％的阿司匹林溶液浸泡插条，能显著提高发芽率，用0.05％的阿司匹林溶液浸泡移栽苗木，能大幅缩短缓苗期，防止苗木干枯，提高苗木的成活率。
[0042]
本实施例的一个具体应用为：瞬时转化提高苹果砧木扦插生根的方法包括以下步骤：构建35s:mdmir156a6过表达载体，转化农杆菌(gv3101)，进行苹果绿枝插穗的选取制作及预侵染的培养液，设置od600浓度为0.4，把目标基因转入苹果绿枝插穗组织，向(3)中的
溶液中施加压强进行真空环境作业，同时缓慢释放真空，使包含有目标基因的农杆菌(gv3101)细胞渗透苹果绿枝插穗中，苹果绿枝插穗侵染后的进行共培养，实现目标基因的瞬时过量表达，最后进行绿枝扦插(2g/l)iba处理1min，实现了瞬时转化苹果成龄期砧木小金海棠当年生新捎茎皮，从而提高其绿枝扦插生根率；同时在绿枝扦插时，用0.01％的阿司匹林溶液浸泡插条，和用0.05％的阿司匹林溶液进行浸泡移栽苗木，实现了对绿枝扦插的发芽率提高，从而能够能大幅缩短缓苗期，防止苗木干枯，提高苗木的成活率。
[0043]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0044]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。