用于检测PAH基因突变的非诊断方法及探针的设计方法与流程

技术特征：
1.一种用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述方法包括：从待检测的胎儿的父母的白细胞中获取基因组dna；基于所述基因组dna形成二代测序文库；从孕妇的血浆中获取游离dna；基于所述游离dna形成游离dna全基因组文库；将所述二代测序文库和所述游离dna全基因组文库采用探针捕获杂交，形成靶序列捕获文库；对所述靶序列捕获文库进行高通量测序，得到测序原始数据；对所述测序原始数据进行处理得到clean数据；基于所述clean数据确定胎儿pah基因的基因型。2.根据权利要求1所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述基于所述基因组dna形成二代测序文库，包括：采用tell-seq平台对所述基因组dna进行标码、稳化、酶法片段化dna、清洗微珠、扩增文库、清理文库及质检和量检文库形成二代测序文库。3.根据权利要求1所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述对所述测序原始数据进行处理得到clean数据，包括：对所述测序原始数据切除接头序列、低质量碱基、过滤小片段并比对到参考基因组的相应位置，去除由于pcr扩增偏好引起的重复序列，得到clean数据。4.根据权利要求1所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述基于所述clean数据确定胎儿pah基因的基因型，包括：对所述clean数据进行分析，得到游离dna中的单核苷酸变异信息和插入缺失突变信息；对所述游离dna中的单核苷酸变异信息和插入缺失突变信息进行注释，对正常人数据库中所有的单核苷酸变异信息和插入缺失突变信息进行注释，去除游离dna中的正常人的单核苷酸变异信息和插入缺失突变信息；对剩余的单核苷酸变异信息和插入缺失突变信息对应的错义突变和剪切位点改变进行致病性预测；对所述二代测序文库中父母双方的基因信息进行比对，获取父母双方的突变信息；基于所述父母双方的突变信息和所述致病性预测结果进行分析，确定胎儿基因型。5.根据权利要求4所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述基于所述父母双方的突变信息和所述致病性预测结果进行分析，确定胎儿基因型，包括：基于所述父母双方的突变信息按照位点进行合并分类，统计单倍型区域，得到父母的单倍型信息；计算胎儿dna浓度；进行母系遗传单倍型分析：基于所述父母的单倍型信息，获取包含pah基因的单倍体区域，采用基于序贯概率比检验分类的rhdo算法获取胎儿遗传母亲的单倍型，通过获取等位基因之间的剂量平衡性，确定pah基因区域遗传的单倍型块，计算胎儿遗传单倍体块的阈值公式如下：
其中，其中，upper boundary为胎儿遗传单倍体块的上限，lower boundary为胎儿遗传单倍体块的下限，1200为优势比，q0为当胎儿遗传母亲hapⅱ时，hapⅰ等位基因占比；q1为当胎儿遗传母亲的hapi时，hapi等位基因占比；当α型snp进行rhdo分析时，q0＝0.5，q1＝0.5 f/2，其中f为胎儿dna浓度，备择假设是母亲血浆中hapi含量过多；当β型snp进行rhdo分析时，q1＝0.5，q0＝0.5 f/2；备择假设是母亲血浆中hapi含量过少；rhdo分析在目标基因突变位点所在单倍型体积累snp深度的计数，直到突变位点的单倍型被分类；进行父系遗传单倍型分析：为分析父系遗传的单倍型，提取母亲纯合父亲杂合的snp；基于所述母亲纯合父亲杂合的snp，统计母亲血浆中对应位点的突变信息，得出父亲遗传的单倍型。6.根据权利要求5所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述计算胎儿dna浓度的计算方法为基于胎儿特异性等位基因读数计算胎儿dna浓度，包括：通过统计母亲血浆中第一类点和第三类点等位基因频数，采用下式进行胎儿dna浓度的计算：其中，p为父亲遗传胎儿单倍型的等位基因计数，q为母亲与胎儿共享的等位基因计数。7.根据权利要求5所述的用于检测pah基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述计算胎儿dna浓度的计算方法为采用伽马分布模拟胎儿dna浓度，包括：提取母亲血浆vcf文件中突变频率小于0.25的低频突变；采用最大似然估计的方法，使用所有的突变频率≤0.25或≥0.75进行伽马分布拟合，确定最优的伽马分布函数，其中最大似然估计定义为：xi是突变频率值，f(.|θ)是待估计的密度分布函数—伽马密度分布函数，使用r语言来拟合伽马函数，求得伽马分布的期望值，期望值为胎儿dna浓度。8.一种用于检测pah基因突变的探针的设计方法，其特征在于，所述探针的设计方法包括：
获取pah基因全长并向上下游各延伸1mb；去除重复序列；将从第一个碱基开始的78bp的序列作为探针，向后移动n个碱基，截取78bp的序列作为探针，直至最后一个78bp。9.根据权利要求8所述的用于检测pah基因突变的探针的设计方法，其特征在于，所述探针的密度基于参考序列中gc含量进行调整，调整方法参见下式：d
gc
＝a a*10*|gc-0.5|其中，d
gc
代表gc含量下的探针密度，a代表gc含量为50％时候的探针密度，为20，gc代表gc含量。10.据权利要求8所述的用于检测pah基因突变的探针的设计方法，其特征在于，所述探针为生物素标记的探针。

技术总结
本公开提供了一种用于检测PAH基因突变的非诊断方法及探针的设计方法，涉及苯丙酮尿症早筛技术领域。该非诊断方法包括：从待检测的胎儿的父母的白细胞中获取基因组DNA；基于基因组DNA形成二代测序文库；从孕妇的血浆中获取游离DNA；基于游离DNA形成游离DNA全基因组文库；将二代测序文库和游离DNA全基因组文库采用探针捕获杂交，形成捕获文库；对捕获文库进行高通量测序，得到测序原始数据；对测序原始数据进行处理得到clean数据；基于clean数据确定胎儿PAH基因的基因型。本公开的方法采用非侵入性的仅使用孕妇及其丈夫的外周血样本来确定胎儿的PAH基因的基因型，进行苯丙酮尿症早筛，准确度高，成本低。成本低。


技术研发人员：赵洁 王海丽 韩路 姬晓雯 伍建
受保护的技术使用者：北京迈基诺基因科技股份有限公司
技术研发日：2022.12.09
技术公布日：2023/3/10