一种提高米曲霉产量的方法及纳米复合物

1.本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是涉及了一种提高米曲霉产量的方法及纳米复合物。


背景技术：

2.米曲霉是曲霉属中常见的一种具有高分泌酶能力的真菌，属于半知菌亚门，具有高蛋白质分解以及淀粉分解能力，在食品行业具有广阔的应用领域。同时，米曲霉又是公认的食品安全生产菌株，通过固态发酵，米曲霉能产生大量的酶制剂（如：蛋白酶及淀粉酶等）和有机酸，这些产物除了在传统发酵工业中被用于生产酱油、豆豉产品外，还常用于生产初级、次级代谢产物及酶类产品，同时也是基因表达和蛋白分泌研究的理想对象。因此，关于提高米曲霉产量的研究备受重视，是扩大米曲霉推广应用的关键技术难点之一。
3.如中国发明专利cn106867910a公开了一种用于米曲霉的培养基，该培养基包括以下重量份的成分：蛋白胨8份，鱼粉6份，红薯粉2份，丝氨酸1份，黄芩1份，白芷1份，果胶1份；在此基础上还可以进一步添加特定量的浙贝母、硫酸镁或辣蓼草。该配方在培养基常用物料的基础上添加了一定的中药材成分，意外获得了突出的培养效果，尤其适用于米曲霉的培养，应用前景良好。
4.又如中国发明专利cn102382772a公开了一种发酵用米曲霉菌种的工业化生产方法，它是将沪酿3.042米曲霉菌种进行活化培养后再进行三角瓶扩大培养后再在培养室进行培养，即把三角瓶菌种在培养室中进一步扩大培养，采用麸皮∶豆粕=4∶6，每100斤麸皮和豆粕的混合料中加48-52斤水的培养基配方，将培养基料在蒸料桶中用蒸汽蒸制30min，取出来后晾凉，温度降至35-40℃之间后即进行接种，接种比例为0.3%，将接种后的曲料放置在曲簸中置于培养室进行培养，曲料厚度为2.5-3cm，培养时间为7d。利用该方法可大批量的生产产酶活力高，能快速发酵黄豆酱、豆豉和酱油所用的米曲霉菌种。
5.再如中国发明专利cn103923872b公开了一种沪酿3.042米曲霉活力强化剂及其培养方法，该强化剂按培养基重量的添加量为0.1
‰
～2
‰
的魔芋低聚糖、0.05
‰
～2
‰
的牛磺酸、0.02
‰
～0.05
‰
的硫酸亚铁、0.002
‰
～0.005
‰
的亚硒酸钠。经过发酵培养72h可使发酵曲料中的米曲霉蛋白酶活达20ku/g，比不添加复合强化剂及单个强化剂的曲料酶活都大福度提高。
6.但是，在培养基中添加纳米复合物来提高米曲霉生长速度尚未见报道。


技术实现要素：

7.为了更好地促进米曲霉的生长，本发明提供一种提高米曲霉产量的方法及纳米复合物。
8.第一方面，本发明提供了一种提高米曲霉产量的方法，所述方法是通过加入zno/zif-8纳米复合物至培养基中来提高米曲霉的生长速度。
9.在本发明中，所述zno/zif-8纳米复合物在培养基中的浓度大75μg/ml以上。
10.在本发明中，所述zno/zif-8纳米复合物中的所述zno与zif-8的质量比为（1~4）：（1~4）。
11.在本发明中，所述zno/zif-8纳米复合物通过以下方法制备得到：按照zno与zif-8的质量比比例，称取相应的重量，放入研钵中，加入乙醇，研磨，最后干燥，得到zno/zif-8纳米复合物。
12.在本发明中，所述zno通过以下方法制备得到：将zn(ch3coo)2•
2h2o和naoh分别溶于水中，室温下将两种溶液混合到一起并搅拌；再将其分别用水离心、乙醇离心后，放入干燥箱内干燥；取出后研磨，再放入烘箱内干燥，最终得到zno。
13.在本发明中，所述zif-8通过以下方法制备得到：将zn(no3)2•
6h2o溶于甲醇中，超声溶解；将2-甲基咪唑溶于甲醇中，超声溶解；室温下将2-甲基咪唑溶液缓慢滴入zn(no3)2•
6h2o溶液中，并磁力搅拌，静置，用乙醇离心，最终干燥得到zif-8。
14.在本发明中，所述滴入的速度为1滴/2s。
15.第二方面，一种提高米曲霉产量的纳米复合物，所述纳米复合物为zno/zif-8纳米复合物。
16.在本发明中，所述zno/zif-8纳米复合物中的zno与zif-8的质量比为（1~4）：（1~4）。
17.在本发明中，所述zno/zif-8纳米复合物通过以下方法制备得到：（1）将zn(ch3coo)2•
2h2o和naoh分别溶于水中，室温下将两种溶液混合到一起并搅拌；再将其分别用水离心、乙醇离心后，放入干燥箱内干燥；取出后研磨，再放入烘箱内干燥，最终得到zno；（2）所述zif-8通过以下方法制备得到：将zn(no3)2•
6h2o溶于甲醇中，超声溶解；将2-甲基咪唑溶于甲醇中，超声溶解；室温下将2-甲基咪唑溶液缓慢滴入zn(no3)2•
6h2o溶液中，并磁力搅拌，静置，用乙醇离心，最终干燥得到zif-8；（3）按照zno与zif-8的质量比比例，称取相应的重量，放入研钵中，加入乙醇，研磨，最后干燥，得到zno/zif-8纳米复合物。
18.综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明通过利用zno和zif-8材料的协同作用，zno/zif-8纳米复合物对米曲霉生长的促进作用，更加明显；该方法具有工艺简单、所需设备常见且价格低廉、效率高的优点，可扩宽米曲霉在生物领域中的应用。
附图说明
19.图1为本发明制备的zno、zif-8与zno/zif-8纳米复合物的x射线衍射图；图2a和图2b分别为本发明制备的样品（zno和zif-8）和（zno/zif-8纳米复合物）的红外光谱图；图3为本发明制备的不同浓度zno/zif-8纳米复合物影响下的米曲霉表型图：（a）100ml水，（b）90ml水 10ml zno/zif-8溶液，（c）80ml水 20ml zno/zif-8溶液，（d）70ml水 30ml zno/zif-8溶液，（e）60ml水 40ml zno/zif-8溶液，（f）50ml水 50ml zno/zif-8溶液。
具体实施方式
20.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
21.如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
22.本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
23.在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本技术引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
24.本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
26.制备zns/zif-8纳米复合物zns/zif-8纳米复合物的制备方法按以下步骤进行：（1）将2.7246g（0.0124mol）的zn(ch3coo)2•
2h2o和0.5120g（0.0128mol）的naoh分别溶于100ml水中，室温下将两种溶液混合到一起并搅拌30min；再将其用水离心1遍、乙醇离心2遍后放入干燥箱内60℃干燥5-8h；取出后研磨，再放入200℃烘箱内干燥1h，最终得到zno；（2）将1.7846g的zn(no3)2•
6h2o溶于60ml甲醇中，超声溶解；将1.968g的2-甲基咪唑溶于20ml甲醇中，超声溶解；室温下将2-甲基咪唑溶液缓慢滴入（1滴/2s）zn(no3)2•
6h2o溶液中，并磁力搅拌30min，静置24h后，用乙醇离心3次，最终60℃干燥5-8h得到zif-8；（3）将（1）中得到的zno和（2）中获得的zif-8，分别按照zno与zif-8的质量比为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的比例，称取相应的重量，放入研钵中，加入20ml乙醇，研磨20min，最后在60℃下干燥5-8h，得到zno/zif-8纳米复合物，相应的样品编号见表1。
27.表1 样品的编号与成分样品编号zno(g)zif-8(g)m(zno):m(zif-8)实施例1c10.40.14:1实施例2c20.30.13:1实施例3c30.40.22:1实施例4c40.20.21:1实施例5c50.20.41:2实施例6c60.10.31:3实施例7c70.10.41:4如图1所示，由图1的x射线衍射（xrd）图谱可以明显观察到：经过对比，zno和zif-8的衍射峰与标准衍射峰相匹配，且无其他杂峰。c1~c7样品，在2θ约为31.72
°
、34.34
°
、36.2
°
、47.48
°
、56.50
°
、62.8
°
、66.16
°
、67.84
°
、69.02
°
和76.88
°
处分别显示出zno的衍射峰，在22.1
°
、24.48
°
、25.48
°
、26.62
°
处出现了新的峰，与zif-8的峰相吻合，这证明实施例1
~7样品中不仅有zno的峰，还呈现了zif-8的峰，这表明合成的样品（c1~c7）是一种由zif-8和zno组成的纳米复合物。
28.如图2a所示，zno的红外光谱（ir）中，位于约500、3417、1400和1552cm-1
的吸收峰分别来自于zn-o的伸缩振动、水分子和羟基或化学吸附水。zif-8的ir图中，位于约3135、2929和1587cm-1
处的吸收峰依次归因于咪唑环上芳香族c-h的拉伸振动、甲基上脂肪族c-h的拉伸振动和c=n的拉伸振动，1434和1311cm-1
处的峰对应于整个环的拉伸振动，位于1145cm-1
的峰来源于芳香c-n拉伸振动，在993和766cm-1
处的吸收峰源自于咪唑环的弯曲信号；同样，在686cm-1
处的峰是由2-甲基咪唑环的平面外弯曲得到的；在500cm-1
左右检测到zn-n振动，这是由于zif-8中锌离子通过氮原子与连接剂配位所致。如图2b所示，合成的样品（c1~c7）在516cm-1
的峰，与zno中zn-o在500cm-1
处的拉伸振动一致，证实了zno的存在。在685~1587cm-1
范围内的吸收峰对应于zif-8，表明zif-8的结构也在纳米复合物中得到了保存，这也与xrd图谱（图1）中得出的结论一致。
29.提高米曲霉产量的方法提高米曲霉产量的方法具体是通过加入上述的zno/zif-8纳米复合物至培养基中来提高米曲霉的生长速度。
30.锌是所有生命形式的基本元素，因为它在许多细胞功能中起着重要的作用，如：催化剂、辅助因子和蛋白质结构稳定剂。在众多的zn基纳米材料中，氧化锌(zno)纳米粒子格外引人注目，这是因为：（1）zno的激子束缚能高达60mev，室温下的禁带宽度一般为3.37ev，使其从理论上具备了从紫外至可见光稳定的发射本领；（2）该材料具有优良的化学稳定性及很强的抗辐射损伤能力；（3）在多种哺乳动物和真菌酶中，锌是一种重要的辅助因子，可调控核酸合成和多种代谢途径；（4）不含任何有毒元素，制备方法简单，原料价格低廉、丰富易得。而zif-8材料具有以下优势：（1）不但具有比表面积大、孔径可调、结构多样的特点，还具有配位不饱和的金属活性中心，从而赋予了多孔zif-8材料具有优越的吸附性能；（2）zif-8材料表面具有丰富的微孔结构，便于与活性物质和反应物结合，是一种理想的吸附-催化材料；（3）具有较高的水热和化学稳定性。本发明人意外发现，利用zif-8与zno纳米复合物的协同作用，能够明显扩大纳米复合物与米曲霉的有效接触面从而促进米曲霉的生长。
31.将实施例1~7的zno/zif-8纳米复合物分别配制成浓度为75ug/ml的水溶液备用，再将米曲霉（3.042）放入纯水和含有不同量的zno/zif-8纳米复合物溶液中培养72h，然后观察米曲霉的表型。如图3所示，图3给出了未添加和添加了不同浓度的实施例1的米曲霉的表型图，可以看到：与未添加zno/zif-8纳米复合物的培养基（图3a）相比，添加zno/zif-8纳米复合物（图3b~f），明显促进了米曲霉菌体的生长，且zno/zif-8纳米复合物的添加量越大，米曲霉的生长速度越快。当其添加量不超过30ml时，培养72h后，米曲霉呈黄色，表明米曲霉已成熟。添加量超过30ml后，米曲霉生长速度进一步加快，生物量明显进一步增多，培养72h后，米曲霉的颜色仍为白色，尚未成熟，有进一步生长的趋势。可见：zno/zif-8纳米复合物能显著提高米曲霉的生物量，促进米曲霉菌体的生长。
32.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。