一株马胃葡萄球菌及其在鱼类养殖中应用的制作方法

1.本发明涉及一株菌株及其应用。


背景技术：

2.糖类是自然界中分布极为广泛的有机物，是鱼类饵料中最廉价的供能物质,在鱼类饵料中适当添加能起到节约饵料成本、减少蛋白质供能、提高蛋白质沉积并促进鱼类生长的作用。但是鱼类对糖的利用能力较低，饲料中糖水平超过一定限度会引发鱼类抗病力低、生长缓慢、死亡率高等症状，鱼类解除葡萄糖负荷的能力有限从而表现为对糖的利用能力低下，进而限制了糖类在鱼类饲料中的大量使用。
3.随着鱼类养殖技术的发展，关于鱼类对微量元素需求的研究日益受到重视，微量元素是一类矿物质元素，含量虽小，却是不可缺少的一类营养物质，目前已经肯定的对鱼类生长发育有重要作用的微量元素有铁、铜、锰、锌、碘和硒等。其中铁是血红素和肌红蛋白的组分，以载体的身份参与氧气和二氧化碳的运输，铁元素还参与水产动物细胞色素、过氧化物酶等体系的构建，水产动物体内呼吸和生物氧化等生理生化过程密切相关。水产动物体内存在适量的铁元素，可维持其正常的新陈代谢，提高机体防御疾病的能力。而鱼类体内缺乏铁元素，可降低机体组织造血功能，严重情况下甚至会导致贫血。目前在饲料中添加亚铁盐的方法来解决缺乏铁元素的问题，但其吸收利用率较低，极易造成饲料的浪费。


技术实现要素：

4.本发明提供了一株马胃葡萄球菌及其应用。
5.本发明所述的马胃葡萄球菌，其为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：24992。
6.本发明上述马胃葡萄球菌在鱼类养殖中的应用。
7.本发明马胃葡萄球菌加入鱼饲料中用于鱼类养殖。
8.本发明马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌落形态为球形或者椭圆形(略微不规则)，直径1-4mm左右，乳白色凸起，不透明，表面湿润、有光泽、无鞭毛，不能运动，革兰氏染色为革兰氏阳性球菌。
9.马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27接种到在cas培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，说明hl-27菌株具有较强产铁载体能力，在37℃时产铁载体的su值为48％。马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27通过高度亲和力的铁载体螯合的铁离子，并将其固定下来形成铁元素。马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27加入到鱼饲料中，可以直接为鱼类提供铁元素，便于鱼类吸收，维持鱼类正常的新陈代谢，提高机体防御疾病的能力。
10.马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27在skm培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的水解圈，hl-27的水解圈直径d为19.74mm，菌落直径d为5.40mm，d/d为3.66；在37℃时ddp-iv抑制剂产率高达55.61％，hl-27菌株具有较强的产ddp-iv抑制剂的
能力。鱼类有三种胰高血糖素和glp-1(肠促胰岛素胰高血糖数样肽-1)的来源，分别是胰腺、肠和大脑，而ddp-iv(二肽基肽酶-1)抑制剂可以通过延长glp-1的半衰期，间接达到降低鱼类血糖的目的。鱼饲料中加入马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27可以提高饲料消化利用率，升高鱼类生长性能。
11.马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌株接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶有机磷圈，hl-27的溶无机磷圈直径d为13.66mm，菌落直径d为3.29mm，d/d为4.15，说明hl-27菌株具有较强的解有机磷功能。hl-27菌株对ph和胆盐具有较高的耐受性。hl-27菌株进行溶血实验，结果为阴性，本发明所述的菌株没有人畜致病的风险，使用安全性高。
12.本发明的马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌株具有产铁载体和产ddp-iv抑制剂的能力。本发明hl-27菌株加入鱼饲料用于鱼类养殖，可以取代亚铁盐，为鱼类提供更利于吸收的铁元素，不存在浪费的问题，同时还降低鱼类血糖，提高饲料消化利用率。hl-27菌株还具有解有机磷的功能，在用于被有机磷污染的养殖环境中，能有效的消除有机磷的毒害作用。
13.本发明马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27为马胃葡萄球菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24992，保藏日期为2022年5月30日。
附图说明
14.图1为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27铁载体筛选结果；
15.图2为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27 2％脱脂奶粉培养基上的乳蛋白水解圈；
16.图3为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27构建的系统发育树；
17.图4为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27有机磷固体培养基上的解磷圈。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
20.具体实施方式一：本实施方式所述的马胃葡萄球菌，其为马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：24992，保藏日期为2022年5月30日。
21.目前对于马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)的应用主要集中在降解重金属离子，防止果蔬灰霉病和延长肉制品保质期上，具有产铁载体和产ddp-iv抑制剂的马胃
葡萄球菌(staphylococcus equorum)的报道尚属首次。
22.本发明的马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌株具有产铁载体和产ddp-iv抑制剂的能力。本发明hl-27菌株加入鱼饲料用于鱼类养殖，可以取代亚铁盐，为鱼类提供更利于吸收的铁元素，不存在浪费的问题，同时还降低鱼类血糖，提高饲料消化利用率。hl-27菌株还具有解有机磷的功能，目前有机磷农药的使用过程中容易出现通过地表渗透和田间水体流动进入地下水及河流、湖泊，最终造成水体污染。鱼类对水体中残留的有机磷农药较为敏感，有机磷农药能够引起鱼类产生很多种疾病甚至死亡，本发明的hl-27菌株具有解有机磷的功能，作为饲料进行鱼类养殖，在用于被有机磷污染的养殖环境中，能有效的消除有机磷的毒害作用，提高鱼类的产量。
23.获得本实施方式所述的马胃葡萄球菌的方法：
24.1、分离纯化菌株：2021年9月，选取辽宁省盘锦市大洼区水稻田中养殖的鲤鱼群体，随机选择3尾健康的1龄鲤(150
±
10g)，采用ms-222麻醉剂(250mg/l)麻醉，使用无水乙醇擦拭鲤的表面，在超净工作台中用灭菌后的剪刀和镊子进行解剖，取出鲤的整条肠道，轻轻挤出内含物置于含玻璃珠和50ml无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3
、10-4
、10-5
梯度取100μl涂布于lb固体培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。培养48h后，选取不同形状的菌株进行分离。
25.2、细菌产铁载体的鉴定
26.2.1将分离纯化的菌株重新活化，再将其转接到lb平板上28℃培养24h，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到铬天青s(chromeazurol s，cas)固体检测培养基，37℃倒置培养2-3d，观察菌落周围变色圈大小。
27.培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，挑选产铁载体的能力菌株，其中hl-27菌株在lb培养基中变色圈直径d为9.66mm，菌落直径d为3.47mm，d/d为2.78，菌株hl-27具有较强的产铁载体的能力(如图1所示)。
28.2.2对出现明显变色圈的菌株hl-27进一步试验：
29.(1)将活化的菌苔接种于限铁sa液体培养基中，37℃摇床培养48h，得到hl-27菌液；
30.(2)将生长48h的待测hl-27菌液转移到已灭菌的10ml离心管中，13000rpm离心15min，去沉淀留上清；
31.(3)将上清液转移到经浓盐酸处理过的试管中，加入一定量现配的cas检测液使上清液与检测液的体积比为1:1，充分混匀后室温静置1h；
32.(4)测定630nm波长处的吸光度值(a)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的sa限铁培养基与检测液混合后630nm波长处的吸光度值作为参比值(ar)，并以下式表示铁载体活性单位：
33.su≈(ar-as)/ar
×
100；
34.式中：su为铁载体含量；ar为所测未接种的sa限铁培养基与检测液上清液的od值；as为所测培养基上清液的od值。
35.铁载体活性单位小于10时，一般认为是阴性的，并且铁载体与检测液的混合物无颜色变化。
36.菌株hl-27在37℃时产铁载体的su值为48％，说明该菌株具有较强的产铁载体能
力。
37.3、产ddp-iv抑制剂菌株的鉴定以及含量测定
38.3.1将菌株hl-27接种在skm培养基上，28℃培养48h后菌落周围形成明显的水解圈，hl-27的水解圈直径d为19.74mm，菌落直径d为5.40mm，d/d为3.66(如图2所示)。hl-27菌株有产ddp-iv抑制剂的能力。
39.3.2将hl-27接种于96孔板，每孔准确滴加25μl、1.6mmol/l的甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺和25μl的cfs或cfe；在37℃下反应15min，再加入50μl、0.01u/ml的ddp-iv(二肽基肽酶iv)，在37℃继续反应1h，之后再加入100μl、1mol/l的醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.0)终止反应，使用酶标仪在405nm处检测反应溶液的吸光值，获取菌株ddp-iv抑制率。
40.其中，ddp-iv抑制率计算公式为：
[0041][0042]a待测样品
：25μl样品 25μlgly-pro-phy 50μlddp-iv 100μl醋酸钠；
[0043]a样品空白
：25μl样品 50μltris-hcl 25μlgly-pro-phy 100μl醋酸钠；
[0044]a阴性对照
：25μltris-hcl 25μlgly-pro-phy 50μlddp-iv 100μl醋酸钠；
[0045]a阴性空白
：75μltris-hcl 25μlgly-pro-phy 100μl醋酸钠。
[0046]
hl-27菌株在37℃时ddp-iv抑制剂产率高达55.61％，说明hl-27菌株具有较强的产ddp-iv抑制剂的能力。
[0047]
4、菌株hl-27的鉴定
[0048]
4.1生理生化鉴定：菌株hl-27在固体lb培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。
[0049]
hl-27在lb固体培养基上的菌落特征为：菌落形态为球形或者椭圆形(略微不规则)，直径1-4mm左右，乳白色凸起，不透明，表面湿润、有光泽、无鞭毛，不能运动，革兰氏染色为革兰氏阳性球菌。hl-27的部分生理生化指标如表1所示。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌属生理特征的描述，hl-27与马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断菌株hl-27可能为马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)。
[0050]
表1菌株hl-27生理生化结果
[0051][0052][0053]
4.2 16s rrna鉴定：选用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组dna提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株dna。采用细菌通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr扩增体系为25μl体系：10
×
缓冲液2.5μl，taq酶0.5μl，引物27f 0.5μl，引物1492r 0.5μl，dna模板1μl，ddh2o 20μl。反应程序设定为95℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环次数30次，72℃再延伸10min，4℃保存。将pcr扩增产物送往ruibiotech公司测序。通过ncbi数据库比对菌株16s rrna的测序结果，并构建系统进化树。
[0054]
对16s rrna序列进行测序后，在ncbi中进行blast比对发现hl-27菌株的16s rrna基因序列与马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)相似度为99％。系统进化树如图3所示，通过系统进化树可以看出hl-27菌株与马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)(nr_027520.1)同处最小的一个分支，进化距离较近，综合生理生化指标将hl-27菌株鉴定为马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)。
[0055]
具体实施方式二：具体实施方式一所述的马胃葡萄球菌在鱼类养殖中的应用。
[0056]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：马胃葡萄球菌加入鱼饲料中用于鱼类养殖。其他与具体实施方式二相同。
[0057]
具体实施方式四：本实施方式配制马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌液。
[0058]
马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌液培养基由1000ml质量分数为10％豆芽汁、10.48gβ-c
12h22o11
·
h2o(麦芽糖)、2.36g酪蛋白胨、1.91gnano3(硝酸钠)和0.73gfecl3(氯化铁)组成；其中黄豆芽100g加水1000ml，煮沸1h，过滤后补足水分至1l，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为10％的豆芽汁。
[0059]
以0.3％的接种量将staphylococcus equorum hl-27种子液接种于staphylococcus equorum hl-27菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，staphylococcus equorum hl-27菌液的活菌数达到1.65
×
109cfu/ml(而马胃葡萄球菌hl-27种子液的活菌数为6.51
×
108cfu/ml，马胃葡萄球菌hl-27种子液是接种在lb液体培养基中制成)。
[0060]
实施例1
[0061]
马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)hl-27用灭菌牙签分别接种于蒙金娜有机磷细菌培养基的平板上，置于28℃培养24-48h，菌落周围形成明显的溶有机磷圈，采用十字交叉法测量菌落直径d和溶有机磷圈直径d，并计算d/d；staphylococcus equorum hl-27有机磷固体培养基上的解磷圈如图4所示，hl-27的溶无机磷圈直径d为13.66mm，菌落直径d为3.29mm，d/d为4.15，hl-27菌株具有较强的解有机磷功能。
[0062]
实施例2马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27抗逆性检测
[0063]
1、耐酸性能检测：将孢子数2
×
108cfu/ml马胃葡萄球菌hl-27按2％(v/v)的接种量接种到ph为2.0、3.0和4.0的lb液体培养基中，在3h后吸取菌液涂板，37℃培养24h后，测定其活菌数，并计算菌株的存活率。
[0064]
2、耐胆盐检测：将活化好的孢子数2
×
108cfu/ml马胃葡萄球菌hl-27菌液吸取1ml稀释液放于灭菌过的平皿内，然后用含0.5％、1.0％和1.5％牛胆酸钠的lb固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的mrs固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
[0065]
由表2可知，ph为3.0和4.0时对马胃葡萄球菌hl-27孢子数的影响较小，当ph为2.0时hl-27孢子数发生较为明显的下降；而当胆盐浓度的提升时，马胃葡萄球菌hl-27孢子数变化较小。马胃葡萄球菌hl-27对ph和胆盐具有较高的耐受性。
[0066]
表2马胃葡萄球菌hl-27耐酸性和耐胆盐能力检测
[0067][0068]
3、溶血实验：溶血分为α溶血(不完全性溶血，产生草绿色溶血环)、β溶血(完全性溶血，呈界限分明、无色透明的溶血环)以及不溶血。
[0069]
在每个新鲜的血平板上划线接种马胃葡萄球菌hl-27，30℃培养48h后观察。马胃葡萄球菌hl-27实验结果显示为阴性，说明马胃葡萄球菌hl-27没有人畜致病的风险。
[0070]
实施例3
[0071]
1、配制马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌液
[0072]
以0.3％的接种量将马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27种子液接种于马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，马胃葡萄球菌hl-27菌液的活菌数达到1.65
×
109cfu/ml(而马胃葡萄球菌hl-27种子液活菌数为6.51
×
108cfu/ml，马胃葡萄球菌hl-27种子液是接种在lb液体培养基中制成)。其中所述的马胃葡萄球菌staphylococcus equorum hl-27菌液培养基由1000ml质量分数为10％豆芽汁(黄豆芽100g加水1000ml，煮沸1h，过滤后补足水分至1l，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为10％的豆芽汁)、10.48gβ-c
12h22o11
·
h2o(麦芽糖)、2.36g酪蛋白胨、1.91gnano3(硝酸钠)和0.73gfecl3(氯化铁)组成。
[0073]
2、鲤(cyprinus carpio)养殖试验在中国水产科学院黑龙江水产研究所实验室循环水池内进行，试验所用的鲤购于辽宁省丹东市景波养殖场。选取当年繁殖的初始体重为66g左右的鲤200尾，于4.3m
×
1.5m
×
1.2m的水泥池中暂养1周以适应试验环境，暂养期间投喂对照组饲料(通威饲料181)。暂养后选取体重相近、活力较好、体表无伤的鲤120尾，随机分为2组(对照组和试验组)，每组3个平行，每个平行20尾置于6个1.3m
×
0.8m
×
0.7m的循环水饲养箱中，水体覆盖饲养箱80％以上，以曝气24h以上的自来水作为试验水体，试验期间采用气石24h充气，每日08：00和16：00投喂，试验组投喂混有马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)hl-27菌液的对照组饲料(料液比为1:0.18)，对照组投喂对照组饲料；投喂每日2次，表观饱食，每日吸底1次、换水1次，换水量约为1/2，试验期间水温(23
±
1)℃，溶氧为(6
±
0.5)mg/l，ph为(7.1
±
0.5)，养殖周期为6周(42天)。取样前，试验鱼停食24h，放入冰水中冷休克，称重测量体长、体重，剥离内脏和肠系膜脂肪并称重，计算其生长指标。
[0074]
增重率(wgr，％)＝100
×
(平均终末体质量-平均初始体质量)/平均初始体质量饲料系数(fcr)＝平均投饵量/(终末平均体质量-初始平均体质量)
[0075]
肥满度(cf，g/cm3)＝100
×
终末体质量/体长3[0076]
成活率(sr，％)＝100
×
(终末个体数/初始个体数)
[0077]
肠脂比(isi，％)＝100
×
肠脂质量/体质量
[0078]
脏体比(vsi，％)＝100
×
内脏团质量/体质量
[0079]
由表3可知，鲤的成活率在各组间均无显著差异(p》0.05)。试验组饲料系数明显低于对照组，处理组增重率显著高于对照组，其余各项指标均有一定程度的升高，说明hl-27可以显著提升饲料的利用率。
[0080]
表3hl-27对鲤生长性能的影响
[0081][0082]