一株增加水稻产量的菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种菌株及其应用。


背景技术：

2.稻渔综合种养是当前我国生态循环农业经济的主要模式之一，也是加快推进渔业绿色高质量发展最具活力、潜力和特色的朝阳产业之一。我国稻田养鱼产业经过新一轮高效发展，传统的稻田养鱼逐渐发展成为新型稻渔综合种养，种养面积、产量快速攀升，发展水平和质量显著提高，规模稳步提高，2020年全国稻渔综合种养面积突破253.33万hm2、水产品产量达325万t。2020年农业农村部一号文件和全国渔业改革创新高质量发展推进会提出了发展稻渔综合种养的工作意见，在很多内陆省份，在培育地方经济增长、促进农业增效和农民增收中发挥着越来越重要的作用。微生物作为稻渔综合种养中营养循环的重要媒介，一方面在营养元素循环、土壤肥力的形成和保持、生态环境改善方面起着重要作用，筛选和分离具有促进水稻生长的微生物是农业微生物学研究重要工作之一。


技术实现要素：

3.本发明提供了一株增加水稻产量的菌株及其应用。所述菌株兼具产iaa能力、解有机磷、产铁载体以及具有较强的抗逆性，本发明所述的不动杆菌在不动杆菌属的研究中尚属首次。
4.本发明一株增加水稻产量的菌株为不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25357。
5.上述增加水稻产量的菌株不动杆菌acinetobacter sp hl-18在水稻种植中的应用。
6.上述增加水稻产量的菌株不动杆菌acinetobacter sp hl-18在稻田养鱼中的应用。
7.本发明不动杆菌acinetobacter sp hl-18菌落圆形，边缘整齐，光滑，湿润，乳白色。挑取典型菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜的油镜下观察，该菌为革兰氏阴性菌，形态为球杆状，呈双排列。该菌在伊红美兰琼脂培养基上长出蓝色带金属光泽菌落；在血琼脂培养基上呈灰白色，未出现溶血情况；在麦康凯琼脂培养基上长出灰白色菌落。
8.本发明不动杆菌acinetobacter sp hl-18菌液滴加salkowski比色液后，室温避光条件下1ml玻璃瓶中颜色变成深红色，说明不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18具有产生长素的能力，对不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18的产iaa能力进行定量检测，每毫升hl-18菌液中含有88.39μg iaa，说明不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18的iaa分泌能力较强，对植物具有较强的促生作用。
9.本发明不动杆菌acinetobacter sphl-18菌株接种在cas培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，hl-18的变色圈直径d为5.79mm，菌落直径d为1.24mm，d/d为4.67，不动杆菌acinetobacter sp hl-18在37℃时产铁载体的su值为61％，说明该菌株具
有很强的产铁载体能力。
10.本发明不动杆菌acinetobacter sp hl-18接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶有机磷圈，不动杆菌acinetobacter sp hl-18的溶无机磷圈直径d为8.49mm，菌落直径d为3.20mm，d/d为2.65，说明不动杆菌acinetobacter sp hl-18具有较强的解有机磷功能。
11.本发明不动杆菌acinetobacter sp hl-18具有优异的耐酸性和耐胆盐性。
12.吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，iaa)是一种重要的植物生长激素，对植物的新陈代谢、生长发育都起着重要作用，不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18具有良好的产iaa能力，可以通过产生促生长的活性物质来影响新陈代谢，刺激农作物生长；不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18具有解有机磷的能力，可以把土壤中难以利用的磷酸盐分解为农作物能吸收的有效磷的微生物；不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18产铁载体可螯合环境中的铁离子形成铁元素，参与叶绿体蛋白和叶绿素的合成，维持叶绿体的稳定，有利于农作物的生长发育。本发明不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18兼具产iaa能力、解有机磷、产铁载体以及具有较强的抗逆性，本发明的不动杆菌hl-18促进农作物的生长和增加农作物产量，特别适合水稻种植的应用。
13.本发明不动杆菌acinetobacter sp hl-18保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.25357，保藏日期为2022年7月20日。
附图说明
14.图1为不动杆菌acinetobacter sp hl-18进行salkowski比色法测定iaa能力的结果图；
15.图2为不动杆菌acinetobacter sp hl-18铁载体筛选结果；
16.图3为不动杆菌acinetobacter sp hl-18有机磷固体培养基上的解磷圈；
17.图4为不动杆菌acinetobacter sp hl-18构建的系统发育树；
18.图5为不动杆菌acinetobacter sp hl-18水培盒试验结果。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
21.具体实施方式一：本实施方式不动杆菌acinetobacter sp hl-18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25357。
22.一、获得不动杆菌acinetobacter sp hl-18
23.1、实验材料
24.2021年9月，选取辽宁省盘锦市大洼区水稻田中养殖的鲤鱼群体，随机选择3尾健
康的1龄鲤(150
±
10g)，采用ms-222麻醉剂(250mg/l)麻醉，使用无水乙醇擦拭鲤的表面，在超净工作台中用灭菌后的剪刀和镊子进行解剖，取出鲤的整条肠道，轻轻挤出内含物置于含玻璃珠和50ml无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3
、10-4
、10-5
梯度取100μl涂布于lb固体培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。培养48h后，选取不同形状的菌株进行分离。
25.2、吲哚-3-乙酸(iaa)产生菌的筛选以及定量测定
26.将从鲤肠道内容物中分离出的菌株分别接种到含有l-色氨酸的r2a液体培养基中，置于28℃恒温摇床180r/min震荡培养4d。吸取500μl菌液于2ml玻璃瓶中，加入500μl的salkowski比色液。同时用500mg/l的iaa加入salkowski比色液作为阳性对照。将2ml玻璃瓶置于室温避光条件下保存30min，观察颜色变化。菌株hl-18颜色变红，表示该菌株具有产生iaa的功能。
27.如图1所示，筛选出的菌株hl-18的菌液滴加salkowski比色液后，室温避光条件下1ml玻璃瓶中颜色变成深红色，将该菌株具有产生长素的能力，对植物具有较强的促生作用。
28.对菌株hl-18的iaa能力进行定量检测：
29.精确称取iaa 10mg，先用少量的无水乙醇溶解，然后加入蒸馏水定容至100ml，配置成浓度为100μg/ml的iaa溶液作为贮备液，然后将贮备液稀释配置成浓度分别为0(空白)、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/ml的系列标准液，作为工作液。分别取上述工作液2ml按顺序加入到8支试管中，加入2倍体积的salkowski比色液，置于40℃避光条件下保温30min，然后测在波长530nm处的吸光值。以od
530
为横坐标，iaa浓度为纵坐标，绘制iaa标准曲线。在与初筛相同的培养条件下对菌株hl-18产iaa能力进行定量测定。首先用分光光度法测定波长600nm处的菌液的od值，然后取菌液以10000r/min的转速离心10min，取上清液加入等体积salkowski比色液，在40℃条件下避光放置30min使其显色，测定波长530nm处的od值。计算od
600
值为1时，单位体积菌液中iaa的浓度。(菌液浓度较高时可适当稀释)
30.对菌株hl-18的产iaa能力进行定量检测中，用含l色氨酸的lb液体培养基，接种菌株hl-18，30℃，180rpm培养24h后，菌株hl-18每毫升菌液中产88.39μg iaa，说明菌株hl-18iaa分泌能力较强。
31.3、菌株hl-18产铁载体的鉴定
32.将菌株hl-18重新活化转接到lb平板上培养24h，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到铬天青s(chromeazurol s，cas)固体检测培养基，37℃倒置培养2-3d，观察菌落周围变色圈大小。培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，如图2所示，菌株hl-18的变色圈直径d为5.79mm，菌落直径d为1.24mm，d/d为4.67，说明菌株hl-18具有产铁载体能力。
33.对出现明显变色圈的菌株hl-18进一步试验：
34.(1)将活化的菌株hl-18菌苔接种于限铁sa液体培养基中，37℃摇床培养48h得到hl-18的菌液；
35.(2)将生长48h的待测hl-18菌液转移到已灭菌的10ml离心管中，13000rpm离心15min，去沉淀留上清；
36.(3)将上清液转移到经浓盐酸处理过的试管中，加入一定量现配的cas检测液使上清液与检测液的体积比为1:1，充分混匀后室温静置1h；
37.(4)测定630nm波长处的吸光度值(a)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的sa限铁培养基与检测液混合后630nm波长处的吸光度值作为参比值(ar)，并以下式表示铁载体活性单位：
38.su≈(ar-as)/ar
×
100；
39.式中：su为铁载体含量；ar为所测未接种的sa限铁培养基与检测液上清液的od值；as为所测培养基上清液的od值。
40.铁载体活性单位小于10时，一般认为是阴性的，并且铁载体与检测液的混合物无颜色变化。
41.实验结果显示，菌株hl-18在37℃时产铁载体的su值为61％，说明该菌株具有很强的产铁载体能力。
42.4、具有解有机磷能力菌株的鉴定
43.将菌株hl-18用灭菌牙签分别接种于蒙金娜有机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。菌株hl-18接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌株hl-18周围形成明显的溶有机磷圈，采用十字交叉法测量，如图3所示，菌株hl-18的溶无机磷圈直径d为8.49mm，菌落直径d为3.20mm，d/d为2.65，说明菌株hl-18具有较强的解有机磷功能。
44.二、菌株hl-18的鉴定
45.1、生理生化鉴定：将保藏后的菌株在固体lb培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。
46.鉴定结果：菌株hl-18菌落圆形，边缘整齐，光滑，湿润，乳白色。挑取典型菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜的油镜下观察，该菌为革兰氏阴性菌，形态为球杆状，呈双排列。该菌在伊红美兰琼脂培养基上长出蓝色带金属光泽菌落；在血琼脂培养基上呈灰白色，未出现溶血情况；在麦康凯琼脂培养基上长出灰白色菌落。菌株hl-18的部分生理生化指标如表1所示。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌属生理特征的描述，菌株hl-18与不动杆菌(acinetobacter sp)模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断hl-18菌株可能为不动杆菌(acinetobacter sp)。
47.表1菌株hl-18生理生化结果
[0048][0049]
2、16s rrna鉴定：选用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组dna提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株dna。采用细菌通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr扩增体系为25μl体系：10
×
缓冲液2.5μl，taq酶0.5μl，引物27f 0.5μl，引物1492r 0.5μl，dna模板1μl，ddh2o 20μl。反应程序设定为95℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环次数30次，72℃再延伸10min，4℃保存。将pcr扩增产物送往ruibiotech公司测序。通过ncbi数据库比对菌株16s rrna的测序结果，并构建系统进化树。
[0050]
鉴定结果：对16s rrna序列进行测序后，在ncbi中进行blast比对发现菌株hl-18的16s rrna基因序列与不动杆菌(acinetobacter sp)相似度为99％。由下图，菌株hl-18的系统发育树(如图4所示)可以看出菌株hl-18与acinetobacter sp(mk682317.1)同处最小的一个分支，进化距离较近，综合生理生化指标将菌株hl-18鉴定为不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18。
[0051]
三、不动杆菌acinetobacter sp hl-18抗逆性检测
[0052]
1、耐酸性能检测：将不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18接种到ph为2.0、3.0、4.0的lb液体培养基中，始孢子数为2
×
108cfu/ml，在3h吸取菌液涂板，37℃培养24h后，测定其活菌数，并计算存活率。
[0053]
不动杆菌acinetobacter sp hl-18耐酸性如表2所示，说明不动杆菌acinetobacter sp hl-18具有优异的耐酸性。
[0054]
耐胆盐检测：将不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18吸取1ml菌液(始孢子数为2
×
108cfu/ml)放于灭菌过的平皿内，然后用含0.5％、1.0％和1.5％牛胆酸钠的lb固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的mrs固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
[0055]
不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18耐胆盐能力如表2所示，说明不动杆菌acinetobacter sp hl-18具有优异的耐胆盐能力。
[0056]
表2不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18耐酸性和耐胆盐能力检测
[0057][0058]
具体实施方式二：本实施方式配制不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18菌液。
[0059]
黄豆芽100g加水1000ml，煮沸1h，过滤后补足水分至1l，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为10％的豆芽汁。
[0060]
不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18菌液培养基由1000ml质量分数为10％豆芽汁、10.28g半乳糖、1.98g小麦蛋白胨、1.57g磷酸二氢铵和1.10g硫酸镁组成。
[0061]
以0.2％的接种量将不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18种子液接种于不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18菌液的活菌数达到1.34
×
109cfu/ml(不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18种子液活菌数为5.22
×
108cfu/ml，不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18种子液是接种在lb液体培养基中制成)。
[0062]
实施例1水稻萌发实验
[0063]
按照具体实施方式二的方法制备不动杆菌hl-18菌液用无菌水将分别稀释至菌体浓度为1.0
×
104cfu/ml和1.0
×
105cfu/ml，作为菌液，备用。
[0064]
使用水稻lj31作为供试水稻。各处理组分别选取形态饱满、大小一致的水稻种子，用70％乙醇浸没种子消毒15min，再用无菌水冲洗三次去除乙醇残留。消毒后的水稻种子置于100ml锥形瓶中，加入相应的浸种溶液50ml，置于28
±
0.5℃培养箱中浸种2天，再催芽2天后，将发芽一致的种子置于水培盒中，放入植物光照培养箱进行28℃常温培养14天。
[0065]
设置3组处理：
[0066]
对照组：浸种溶液为无菌水；
[0067]
104组：浸种溶液为菌体浓度1.0
×
104cfu/ml不动杆菌hl-18菌液；
[0068]
105组：浸种溶液为菌体浓度1.0
×
105cfu/ml不动杆菌hl-18菌液；
[0069]
其中，昼/夜光照时长12h/12h，光强12000lx，植物光照培养箱内湿度设置为60％。
[0070]
结果与分析：在水培盒培养条件下各处理的生长情况如图5所示，不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18对水稻具有较为明显的促生长作用，并且促生长效果与不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18的浓度呈正相关关系。从表3可以看出，105组根长较104组和对照组分别提升10.18％和18.54％；105组地上部较104组和对照组分别提升9.52％和25.40％；105组鲜重较104组和对照组分别提升11.21％和24.19％；105组干重较104组和对照组分别提升11.68％和32.72％，进而说明不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18能大幅度提升水稻幼苗的地上部、根长、鲜重和干重，有利于水稻植株的萌发。
[0071]
表3不动杆菌(acinetobacter sp)hl-18对水稻幼苗生长的影响，n＝20
[0072][0073]
本实施例中的不动杆菌acinetobacter sp hl-18兼具产iaa能力、解有机磷、产铁载体以及具有较强的抗逆性，对水稻的生长发育有促进作用。
[0074]
不动杆菌acinetobacter sphl-18兼具产iaa能力、解有机磷、产铁载体以及具有较强的抗逆性，hl-18菌株良好的iaa能力能够促进农作物的生长，同时具有的解有机磷能力能够将土壤中难以利用的磷酸盐分解为植物能吸收的有效磷的微生物，改善农作物的生长环境；而产铁载体的hl-18菌株可以螯合环境中的铁离子，维持叶绿体的稳定，有利于农作物的生长发育。因此，不动杆菌hl-18促进农作物的生长和增加农作物产量，特别适合水稻种植的应用。