病毒核蛋白和包含其的制剂的制作方法

1.本发明涉及医学领域，尤其是涉及先天免疫系统的免疫调节剂和激活剂试剂的领域，并且涉及其在感染性疾病、变应性疾病和癌症的预防和治疗中的用途。
现有技术
2.先天免疫系统是活有机体的第一道防线。先天免疫包含对于感染的物理和化学屏障，和还有一组专注于微生物的广谱模式识别的细胞类型。抗病毒防御中的早期阶段之一例如牵涉先天免疫系统的细胞例如天然杀伤细胞(nk)和树突细胞的刺激。表征免疫应答的一个基本原则是先天免疫系统的参与，作为对于诱导适应性免疫系统的t细胞应答来说必须的先决条件(iwasaki a和medzhitov r.nat immunol2015,16:343-53)。
3.适应性免疫(其跟随先天免疫应答)通过特异性地识别微生物抗原来消除侵入性病原体，并且建立免疫记忆。然而，t细胞的抗原特异性功能在没有先天性免疫系统的细胞的情况下无法发展(rothlin cv和ghosh s.j immunother cancer.2020年4月,8(1).pii:e000695)。
4.在感染性疾病的领域中，受试者生成先天免疫应答的能力可以因受试者不同而变化。这些差异可以决定感染是否变得没有任何症状或至少没有重大症状，或者受试者是否经历感染和其众多的相关症状。
5.已知多种与先天免疫系统相关联的受体，其的刺激将会生成具有抗病毒效应的细胞因子应答模式。toll-样受体(tlr)(尤其是tlr3、tlr7和tlr8)；以及rig-i和mda-5(其在大多数与呼吸道相关联的细胞中表达)探测核糖核酸(rna)病毒，例如冠状病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒。该探测产生导致细胞因子和干扰素生成的事件级联。从影响呼吸道的病毒(尤其是冠状病毒)的多种逃避机制的认识中确认了先天免疫在感染的发展和建立以及其演化中的重要性(kikkert m.j innate immun(2020),12:4-20)。
6.冠状病毒和其他rna病毒发展出了多种逃避策略，它们影响其被先天免疫系统的这些受体探测，这是在老年人和具有衰弱的免疫系统的人中被加强的方面。在这些组中，产生更高的死亡率水平。在他们中证实了免疫系统(和特别是先天免疫系统)衰弱的现象。在岁数较大的人的情况下，这尤其通过这些受体探测病毒的能力减小而得到解释，这解释了所述疾病的较高的发病率/死亡率和低的对于疫苗的应答(metcalf等人,aging cell(2015)14:421-432)。
7.各种各样的试剂，例如卡介菌(bcg)、病毒及其组分，以及tlr的激动剂和细胞因子，牵涉“先天免疫训练”。这个概念也在复发性呼吸和生殖泌尿系统细菌性疾病的治疗中被使用(sanchez-ramon等人,front immunol(2020),9:2936)。
8.目前认为基于先天免疫训练的疫苗开发可以代表了相对于常规疫苗的一个优势，在当常规疫苗对于产生复发性感染的病原体(例如对于作为在人中最常见的感染的呼吸和泌尿系统感染负有责任的那些)来说不可得时的特殊条件下(mizgerd等人,plos med(2006),3:e76)。
9.已在登革热病毒感染的情景下在病毒感染的治疗中成功地检定了先天免疫的刺激。在受感染猕猴模型中证明，在体内登革热病毒感染之后，tlr3、tlr7和tlr8的同时激活增加通过炎症和体液途径的抗病毒机制，这导致受感染的猴子的病毒血症减退和临床改善(sariol等人,plos one(2011):6(4):e19323)。这些结果支持在采用用黄热病毒和用委内瑞拉马脑脊髓炎病毒感染的灵长类模型的研究中的以往发现(stephen等人,j inf dis(1977)vol 136(1):122-126；stephen等人,j inf dis(1979)vol 139(3):267-272)。
10.tlr的激动剂包括脂蛋白(被tlr1、tlr2和tlr6识别)、双链rna(被tlr3识别)、脂多糖(被tlr4识别)、鞭毛蛋白(被tlr5识别)、单链rna(被tlr7和tlr8识别)和脱氧核糖核酸(dna，被tlr9识别)(kawai等人,nature immunology 2010,11:373-384)。tlr的激动剂可以用于激活肿瘤微环境中的先天免疫应答，这可以刺激针对肿瘤的适应性免疫应答。这些越来越多地在针对癌症的免疫疗法中使用。肿瘤微环境(通常是免疫抑制性的)可以从施加tlr的激动剂开始而进行修饰以恢复抗肿瘤免疫(deng等人,protein&cell 2014,5:899-911)。
11.当tlr与具有病原体相关性分子图式(pathogen-associated molecular pattern；pamp)的颗粒相互作用时tlr的信号传导被起始，并且激活了第二信使。所有tlr(除了tlr3)都与衔接蛋白myd88相互作用。tlr3的激动剂引发依赖于trif的途径。
12.bcg是一种主要刺激tlr2和tlr4的减毒活牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)的制备物。在膀胱癌细胞中tlr的刺激引发nf-κb的核易位以及il-1β、il-6和il-8的产生(ayari等人,j urol2011 185(5):1915-21)。用bcg进行的治疗导致在尿道上皮癌细胞中ii类mhc分子和共刺激分子(分别包括cd86和icam-1)的表达(bevers等人,br.j.cancer 2004,91:607-612)。用bcg刺激尿道上皮细胞癌诱导细胞死亡并且降低增殖和运动性。最近，yu等人已确认了bcg直接通过激活tlr7来诱导尿道上皮癌的细胞凋亡的能力。bcg可以直接通过激活tlr7和相关的凋亡途径来导致尿道上皮癌细胞的细胞死亡(yu等人,kaohsiung j med sci 2015,31(8):391-397)，这证明了bcg的tlr多激动剂特性。
13.bcg目前是一种对于防止非肌层侵袭性膀胱肿瘤的复发和进展来说可得的治疗。该治疗已由美国食品与药品管理局(fda)批准用于膀胱癌的免疫疗法，但是它不是最佳的并且需要更有效的免疫治疗方法。
14.目前，进行了体外和体内研究以发现对于无应答的患者的备选选项。关于用于膀胱癌治疗的tlr的激动剂的研究已显示了有希望的结果(ohadian等人,scand j immunol 2019,26:e12818)。最近发现，在膀胱肿瘤中，特别是在非肌层侵袭性肿瘤中，tlr的表达减少。
15.tlr在响应于病原体和危险信号的免疫系统的激活中，但也在抗肿瘤应答中，发挥重要作用。人尿道上皮细胞表达功能性tlr并且响应于tlr2和tlr3的激动剂。已知poly(i:c)(tlr3的激动剂)在非肌层侵袭性膀胱癌的治疗中补足bcg的潜力，并且因此补足bcg的该缺乏(ayari等人,cancer immunol immunother 2016,65(2):223-34)。poly(i:c)/bcg的组合对于在鼠类模型中减少肿瘤生长来说更加有效。该结果暗示，在多激动剂化合物中所述效应的浓度将可能意味着治疗的进步。目前，通过激动剂的组合探索了该类型的效应，因为具有诱导多种tlr(和主要是其信号转导蛋白存在于依赖于和不依赖于myd88蛋白的途径中的那些)的同时激活的能力的化合物是极其罕见的，或可能不存在。
16.tlr3的表达已被证明是在肝细胞癌(hcc)领域中的一个有价值的标志物。发现肿瘤tlr3表达的降低与肿瘤细胞的增殖、上调的血管发生和凋亡的抑制、肿瘤进展和hcc患者的差的预后相关。几位作者已证明了tlr3的表达与hcc患者的总体存活或在外科手术切除术后的无复发存活的关系(chew等人,gut 2012,61:427-438；yuan等人,bmc cancer 2015,15:245；bonnin等人,j hepatol 2019,s0168-8278(19):30351-4)。yuan等人的有关结果被归因于抑制了hcc细胞增殖、血管发生和在激活tlr3的效应下所诱导的凋亡。在分开地用每种衔接蛋白进行的分析中，这些蛋白质的表达与hcc患者的总体存活相关联，这确认了在癌症发展中tlr3的刺激的重要性。
17.在hcc患者中tlr3的下调与不利的预后并且还与对于由tlr3引发的凋亡的抵抗相关联。这是关于hcc细胞的逃逸机制，其阻止hcc细胞凋亡并且改善肿瘤的进展，与免疫应答无关。tlr3被认为是对于基于使用所述tlr的配体的疗法来说合适的靶标(bonnin等人,j hepatol 2019,s0168-8278(19):30351-4)。
18.另一方面，最近描述了包含在核蛋白hbcag中的rna的免疫调节剂特性，当在宿主大肠杆菌(escherichia coli)中以不同程度的截短产生此类核蛋白时(sominskaya等人,plos one.2013,8(9):e75938)。该技术领域中的一项非常相关的研究是在报道细胞hek293t中的乙型肝炎病毒(hbv)的衣壳的核蛋白。该研究排除了tlr3表达的刺激，而确认了强的tlr2刺激(vanlandschoot等人,j immunol 2005,175(10):6253；作者的答复6253-5)，这在以前已由其他人报道过(lee等人,j immunol 2009,182(11):6670-6681)。
19.tlr的激动剂抑制免疫系统的阻抑性细胞的功能(fridman等人,nat rev clin oncol 2017,14:717-734)。调节t细胞在维持内环境稳定中发挥必不可少的作用，而内环境稳定对于与肿瘤相关的免疫抑制做出贡献，并且其在肿瘤内的存在预示了差的预后(综述于：bourquin等人,pharmacol res 2019,2:104192)。该效应由树突细胞通过分泌il6来介导。tlr的激活不仅影响调节t细胞的功能，而且还抑制其向肿瘤的募集。
20.因此，仍然感兴趣的是，获得新的对于先天免疫受体施加多激动剂效应的实体，以将其应用于癌症、变态反应和感染性疾病。
21.发明描述
22.本发明通过提供下述技术方案而解决了上面提到的问题：包含核糖核酸(rna)和病毒来源的蛋白质的核蛋白，其中rna的含量大于20％(质量:质量)并且所述rna在病毒样结构之内被保护免于降解，并且其中所述核蛋白同时激活先天免疫受体tlr3、tlr2、tlr7、tlr8和tlr9。
23.本发明的核蛋白能够对几种先天免疫受体生成多激动剂效应，通过经由衔接蛋白myd88(受体tlr2、tlr7、tlr8和tlr9)以及经由trif和irf3(受体tlr3)同时激活信号转导。该发现的重要性可以从以前的报道中看出，所述以前的报道显现出同时激活这两条途径的tlr配体的组合对于先天免疫的激活和所得的t应答的品质具有协同效应(bagchi等人,j immunol.2007,178:1164-1171；zhu等人,proc natl acad sci u s a.2008,105(42):16260-16265；zhu等人,j clin invest.2010,120(2):607-616)。
24.在本发明的一个实施方案中，在所述核蛋白中，所述蛋白质为通过重组dna途径获得的病毒来源的衣壳，优选地乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头状瘤病毒、登革热病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒的衣壳。所述蛋白质可以进行修饰，以便它们与大于
20％的rna相联合，作为生产过程的一部分。
25.在一个优选的实施方案中，存在于所述核蛋白中的蛋白质具有已从初始序列进行了修饰并且由185个氨基酸组成的氨基酸序列。该病毒来源的衣壳的氨基酸序列在序列表中标示为seq id no:1。
26.只要保持在所述核蛋白中的大于20％(质量:质量)的rna含量，所述rna可以为外源rna、用作疫苗抗原的信使rna、干扰rna或其他rna型化合物。
27.在另一个方面，本发明揭示了包含rna和病毒来源的蛋白质的核蛋白用于制备增强抗感染、抗肿瘤或抗变应性应答的药物的用途，在所述核蛋白中rna的含量大于20％(质量:质量)，并且所述rna在病毒样结构之内被保护免于降解。这可以通过下述方式来产生：由于依赖于和不依赖于myd88的途径的同时刺激而增强抗原呈递能力，增加共刺激分子、促炎介体和促凋亡途径，以促成有利于控制、防止和逆转所述过程的先天免疫应答的增加。
28.在一个特别的实施方案中，用本发明的核蛋白制备的药物增强抗病毒类型的抗感染应答。这归因于干扰素的刺激，并且应用于治疗性和预防性情景，尤其是在慢性疾病以及随在血液和/或粘膜中的持续的病毒水平而变的急性和复发性感染的治疗中，如由(但不限于)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳头状瘤病毒、登革热病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒所产生的病毒感染的情况。在一个优选的实施方案中，所述冠状病毒为命名为sars-cov2的病毒。
29.在另一个特别的实施方案中，用本发明的核蛋白制备的药物通过激活具有肿瘤学疾病的患者的先天免疫来增强抗肿瘤应答。本发明的核蛋白的目的是激活具有肿瘤学疾病的患者的先天免疫，通过其粘膜或肠胃外施用和/或通过其肿瘤内施用，作为单一疗法或作为已建立的疗法的补充。
30.在另一个方面，揭示了本发明的核蛋白用于制备药物的用途，所述药物用于在感染或变应性过程的预防或治疗中激活和训练先天免疫。在本发明的一个实施方案中，在急性和复发性呼吸道病毒感染的预防或治疗中使用所述药物，因为其阻止恶化或促成临床症状的消除并且允许更快的恢复期。在一个特别的实施方案中，在由冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒造成的感染的预防或治疗中使用所述药物。在一个优选的实施方案中，用本发明的核蛋白进行预防或治疗的冠状病毒为命名为sars-cov2的病毒。
31.在本发明的另一个实施方案中，在胃肠道、泌尿生殖器和全身性病毒感染的预防或治疗中使用所述药物。特别地，在由登革热病毒、寨卡病毒、黄热病毒造成的感染和由媒介传播的其他病毒感染的预防或治疗中使用用本发明的核蛋白获得的药物。
32.由于其同时刺激先天免疫系统的几种受体的特性，本发明的核蛋白在制备用于在体内和体外肿瘤治疗期间在肿瘤细胞中和在肿瘤免疫环境中诱导修饰的药物中也是有用的。
33.本发明的目标还为所提及的核蛋白用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤学、变应性或感染性疾病，其中在同一个治疗的过程中与其他药物同时地或顺次地施用所述组合物。
34.在另一个方面，本发明考虑了所述核蛋白用于制备在预防性或治疗性疫苗接种策略中使用的疫苗抗原的佐剂或载体的用途。在疫苗学领域中，就其性质而言，作为本发明目标的核蛋白可以在疫苗背景下激活和/或训练先天免疫。
35.本发明还揭示了药物制剂，其包含：1)由rna和病毒来源的蛋白质组成的核蛋白，其中rna的含量大于20％(质量:质量)，并且所述rna在病毒样结构之内被保护免于降解；和2)在药学上可接受的稀释剂或赋形剂。在本发明的一个实施方案中，所述药学制剂另外还包含至少一种病毒来源的蛋白质，其中所述蛋白质可以来自同一种或另一种病毒。在一个优选的实施方案中，构成所述药学制剂的一部分的病毒来源的蛋白质为hbv的表面抗原。
36.在本发明的另一个实施方案中，所述制剂另外还包含用于粘膜施用的粘膜粘着剂，所述粘膜粘着剂优选地选自羧乙烯基聚合物和纤维素衍生物的组。还可能的是，在所述制剂中，将存在于所述核蛋白中的蛋白质与病毒来源的肽或其他抗原相缀合。
37.在另一个实施方案中，所述制剂另外还包含先天免疫受体的激动剂。在一个特别的实施方案中，所述先天免疫的激动剂为tlr的激动剂、富含cpg区域的序列、具有rig-i的激动剂效应的化合物(c-di amp)、md5-a或者其他的病原体相关性分子图式探测系统的激动剂。
38.在另一个实施方案中，包含本发明的核蛋白的制剂另外还包含下述物质的复合物：合成来源的核酸和/或信使rna类型的核苷酸化合物、dna疫苗、小基因或与所述核蛋白相关联的核苷酸性质的其他结构。
39.在另一个方面，包含本发明的核蛋白的制剂另外还包含在实体肿瘤的免疫疗法中使用的化合物。在本发明的一个实施方案中，所述在实体肿瘤的免疫疗法中使用的化合物为bcg。在与bcg相组合的情况下，确立共施用，而在与索拉非尼相组合的治疗中，确立在用索拉非尼的2至8周治疗之后用所述核蛋白进行治疗。
40.在本发明中，包含所述核蛋白的制剂可以通过肠胃外、鼻内、舌下、肿瘤内、静脉内途径和/或通过经动脉化学栓塞术来进行施用。在该最后一种情况下，在具有实体肿瘤的患者中，优选地在具有肝脏、前列腺、肺、结肠、头颈、脑、甲状腺、乳腺、胃和胰腺肿瘤的患者中使用该途径。
41.本发明还揭示了用于粘膜施用的试剂盒，其包含所述核蛋白的制剂、粘膜粘着化合物和被设计用于通过粘膜途径施用所述产品的喷雾型装置。在所述试剂盒中存在包含所述核蛋白的制剂的第一小瓶，包含所述粘膜粘着剂的第二小瓶，和保证产品通过鼻内或舌下途径以一定的粘膜粘着水平和粘度进行生物分布的喷雾型装置。
42.在一个优选的实施方案中，本发明的核蛋白用于通过刺激或调节先天免疫受体(例如tlr)来治疗hcc和其他实体肿瘤。可以与被设计用于攻击肿瘤细胞的疫苗同时地或连续地进行在肿瘤中本发明的核蛋白的施用，通过肿瘤内或静脉内注射，或者通过经动脉化学栓塞术。所述核蛋白被肿瘤细胞和专职抗原呈递细胞吸收，这导致在肿瘤细胞和专职抗原呈递细胞中在mhc分子中源自核衣壳的蛋白质组分的肽的呈递。因此，所述核蛋白可以与被设计用于诱导针对核蛋白的蛋白质组分的适应性免疫应答的治疗性疫苗同时地或连续地进行应用。在本发明的核蛋白中的增加的rna水平激活在tlr3之下的信号传导途径，并且该特性相比于不能显示出该效应的以前所描述的源自hbv衣壳的核蛋白制备物而言是独特的(vanlandschoot等人,jimmunol 2005,175(10):6253；作者的答复6253-5)。
43.类似地，在本发明的核蛋白中的核酸与蛋白质比率和由本技术所涵盖的其他那些刺激tlr7基因的表达和相应的信号传导途径(myd88)。除了探索所述核蛋白本身的免疫刺激特性外，本发明特别地涵盖了与治疗性疫苗的同时或顺次施用相组合的所述核蛋白的肿
瘤内应用。该治疗性疫苗可以在于(但不限于)通过鼻内-皮下或肠胃外途径应用核衣壳，以诱导特异于肿瘤抗原或源自核衣壳的抗原的t细胞的激活。
44.肿瘤细胞以及在肿瘤微环境中的抗原呈递细胞的原位刺激诱导促炎细胞因子的分泌。这些细胞因子激活效应细胞，即细胞毒性t细胞、nk细胞、nkt细胞，如此改善其抗肿瘤活性。同时，这些细胞因子(尤其是il6)负地调节tregs细胞和髓系来源阻抑性细胞(myeloid line-derived suppressor cells；mdsc)的免疫抑制功能。
45.增加的i和ii类hla的表达，连同共刺激信号传导分子一起，促进肿瘤细胞被特异于肿瘤特异性肽和源自所述核蛋白的蛋白质组分的肽的适应性免疫细胞识别。后一种细胞通过用所述核蛋白进行免疫接种来诱导，并且刺激识别肿瘤特异性抗原的t细胞的诱导。特异于抗原的适应性免疫细胞的返回通过趋化因子的局部分泌来进行刺激。肝细胞表达整联蛋白，其也是粘膜所专有的。因此，通过粘膜的(即，鼻内的)免疫接种促进由该疫苗所诱导的t细胞定位在肝脏中，这有益于集中于hcc，通过鼻内应用包含经由肿瘤内途径施用的相同抗原的专用疫苗。
46.本发明涵盖应用所述核蛋白以治疗与hcc不相关的癌症。已报道，几种tlr被多种肿瘤实质细胞表达。以前已证明，tlr2和tlr3的刺激引起直接的抗肿瘤效应，而tlr4的刺激增进肿瘤生长并因而是不利的(由kaczanowska等人,j leukoc biol 2013,93(6):847-63所综述的)。在与本发明的核蛋白一起进行温育后显示出的tlr3和tlr2的最强刺激是有利的，相比于作为多tlr激动剂的bcg而言。虽然bcg由于在该制剂中所包含的lps而刺激tlr4，但是本发明的核蛋白包含最小量的lps并且因此对于tlr4的信号传导具有最小效应。然而，本发明的实施方案涵盖与bcg相组合地使用所述核蛋白，以促进tlr3诱导的增加，其补足bcg的效应。
47.附图简述
48.图1.在与不同浓度的经优化的hbv衣壳核蛋白一起温育24和48小时的heparg细胞中tlr的基因表达的刺激。下列基因的表达的刺激：a)tlr2；b)tlr3；c)tlr7；d)tlr8；e)tlr9。所有比较都参照未刺激的对照，认为p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
49.图2.在与不同浓度的经优化的hbv衣壳核蛋白一起温育24和48小时的heparg细胞中tlr信号的转导蛋白或衔接蛋白的基因表达的刺激。下列基因的表达的刺激：a)myd88；b)nf-kb；c)trif；d)irf3。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
50.图3.a)在与不同浓度的hbv衣壳的np-o一起温育24和48小时的heparg细胞中hla-a基因的基因表达的刺激。b)参照gusb的表达百分比的hla a基因的表达。hla-a基因的基础表达水平与正常高的gusb表达水平相似。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
51.图4.在与不同浓度的hbv衣壳的np-o一起温育24和48小时的heparg细胞中ii类mhc基因的基因表达的刺激。a)在两个温育时间中hla drb1的基因表达的刺激；b)drb1的gusb表达百分比，其中所诱导的drb1基因的表达水平达到接近正常高的gusb表达的40％；c)在与np-o一起温育48小时后三个ii类mhc等位基因(dpb1、dqb1和drb1)的刺激。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异
(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
52.图5.在与不同浓度的hbv衣壳的np-o一起温育24和48小时的heparg细胞中bax和bcl2基因的基因表达的刺激。在图a和b中，分别呈现了bax和bcl2(作为与凋亡相关的基因)的基因表达的刺激。图c呈现了由于其对于在heparg细胞中在基因表达水平上表征np-o的凋亡效应来说的重要性而研究的bax与bcl2比率。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
53.图6.在与不同浓度的hbv衣壳的np-o一起温育24和48小时的heparg细胞中il6基因的基因表达的刺激。在图a中呈现了il6的基因表达的刺激，和图b呈现了通过使用gusb基因作为参考基因的相对表达水平。所有未刺激的对照细胞在所研究的条件下产生不可检测的基因表达水平。任意地规定0.1％的值以分析基因表达的刺激。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
54.图7.在与不同浓度的hbv衣壳的np-o一起温育24和48小时的heparg细胞中a)ifnα和b)ifnβ基因的基因表达的刺激。虽然刺激是非常轻的，但是在特殊条件下达到了统计学显著性，哪怕该效应在培养大约10小时在该细胞系中得到验证。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
55.图8.在heparg细胞系中病毒感染(由hbv)对于由hbv衣壳的np-o所诱导的在目的基因表达方面的刺激的效应。将heparg细胞与渐增剂量(直至10μg/ml)的np-o一起温育48小时。选择两个tlr基因作为不依赖于和依赖于myd88的刺激剂(分别为tlr2和tlr3)，和选择两个另外的与抗原呈递(drb1)和细胞因子的功能(il6)相关的基因。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
56.图9.在与hbv衣壳的np-o(10μg/ml)、poly-ic和恩替卡韦一起温育的heparg细胞中下列基因的基因表达的刺激：a)tlr2；b)tlr3；c)il6；d)ii类hla(drb1)。所有比较都参照未刺激的对照，p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。
57.图10.先天免疫的刺激对于hbv复制的效应。由使用经优化的hbv衣壳核蛋白的体外刺激所诱导的先天免疫应答机制的激活显著地降低在被感染的heparg细胞培养物的上清液中的hbv浓度。该效应处于对于恩替卡韦所发现的水平。
58.图11.在用包含hbv衣壳的np-o的制剂进行治疗的患者中具有受体tlr3、7和8(rna病毒的受体)的基因表达(ge)的刺激效应的患者的频率。a)刺激tlr3、7和8的ge的患者的频率。b)具有tlr3、7和8的ge的强烈刺激的患者。治疗方案：3次in施用，每周一次(0、7和14天)，和14次经sl途径的施用。统计学比较：使用卡方检验的频率分析，p《0.01，非常显著的差异(**)。
实施例
59.实施例1.经优化的核蛋白(np-o)的核酸组成的表征
60.通过illumina hiseq测序技术来进行核酸的测序。选择为了最大程度地增加其分子稳定性和其物理结构而进行优化的批次a-d的蛋白质作为病毒样颗粒。另外，在该研究中插入具有较低的缔合rna类型的核酸的能力的其他核蛋白。向该研究添加一组截短变体(其具有渐减量的rna/蛋白质单位)，以及四个核蛋白变体(其包含处于低于在批次a-d中所获得的那些的水平的rna/蛋白质比例)。
61.将总rna样品用超声波(在4℃下，2个30秒的脉冲)进行片段化。第一条链的互补脱氧核糖核酸(cdna)的合成用n6随机引物来发动。然后，将illumina truseq测序接头与cdna的5'和3'末端相连接。最后，使用校正读码酶通过聚合酶链反应(pcr)对这进行扩增。在illumina hiseq 2000系统中以100bp的读取长度对cdna的组进行测序。
62.在经优化的核蛋白中发现的rna/蛋白质比例在rna含量/蛋白质单位方面是比较高的(表1)，相比于所研究的其他核蛋白而言(变体e-j，表2)，以及相对于在现有技术中所报道的其他变体而言(riedl等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959)。批次a-d的蛋白质的稳定化过程允许同化高水平的rna/蛋白质质量(》20％ rna/蛋白质，质量:质量)(表1)。
63.相比于现有技术的其他核蛋白和截短变体而言令人惊讶的同化或缔合高水平的rna的特性为探索该新型化合物(即鉴于高的rna/蛋白质单位的比例而被认为是经修饰或经优化的新型核蛋白(np-o))的生物学特性打开了大门。该发现是完全偶然的，因为在寻找作为病毒样结构的稳定性中，185个氨基酸的未截短的变体具有增加的同化rna水平的能力，其超过20微克/100微克蛋白质(20％质量:质量)。用该类型的未截短的核蛋白进行工作的其他作者已报道了大约1％并且认为它处于痕量水平，并且虽然如此已从免疫学角度验证了相关的方面(riedl等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959)。
64.以前已经描述了关于在核蛋白的总rna中的mrna比例的免疫学特性(ep3437654a1；专利申请pct/cu2017/050001)。然而，在该情况下，它不同于以前通过定量要素所描述的蛋白质，因为其较高的rna-蛋白质比例，这超过了在现有技术中对于其他核蛋白所发现的水平。所获得的结果与所报道的相一致。
65.表1.每个批次的包含高于20％的rna/蛋白质比例的基于hbv衣壳蛋白的经优化的核蛋白(np-o)的rna-蛋白质组成
66.样品％rna/蛋白质批次a24.5％批次b23.1％批次c21.4％批次d26.0％
67.表2.核蛋白变体及其rna/蛋白质比例。a)具有较低的rna/蛋白质比例的截短变体型衣壳核蛋白变体的rna-蛋白质组成(样品e-j)；b)乙型肝炎病毒(k)、登革热病毒(l)、丙型肝炎病毒(m)和cov(n)的核蛋白的变体；和c)已进行修饰以增加rna/蛋白质比例超过20％的这四种病毒蛋白质的变体(分别为变体(np-o)-k(hep b)；(np-o)-l(登革热病毒)；(np-o)-m(hep c)；(np-o)-n(cov))。
[0068][0069]
实施例2.对应于批次a-j的经修饰/优化的核蛋白(np-o)的蛋白质的氨基酸序列的测定
[0070]
在ltq orbitrap xl设备(thermo scientific,germany)上进行maldi-ms测量。将包含5pmol的肽溶液与由在包含0.1％ tfa(v:v)的50％乙腈/水中的7.5mg/ml chca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)组成的基质溶液相混合。将该混合物通过在提供平坦的不锈钢表面的平板中暴露于空气来进行干燥，并且在正模式下对于400-4000th的m/z范围获取总质量检定。使用ft质量分析仪(orbitrap)的质量分辨力为60,000。在每个分析中使用十次激光发射，每次具有14μj的激光能量。通过使用xcalibur v3.0.63软件来处理质谱。
[0071]
低能量谱通过使用与电喷雾离子源(z-spray nanoflow)相偶联的waters qtof-2质谱仪(manchester,uk)来获取。在宽的质量范围(m/z 200-2000)内用钠盐和铯盐的混合物(sigma,usa)作为参考物来校准飞行时间(tof)分析仪。esi-ms谱在m/z 200-2000的范围内获得。质谱的获取和处理程序为masslynx,4.1版(micromass,uk)。esi-ms/ms谱通过下述方式来获得：应用在15和48ev之间的碰撞能量，以诱导包含用于所分析的肽的结构阐明的足够信息的片段化。
[0072]
在表3中显示了np-o(批次a-d)的序列，以及关于每个截短的且具有渐减的rna/蛋白质比例(质量:质量)的变体的两个批次的序列。
[0073]
表3.经优化的hbv衣壳核蛋白的序列(在批次a-d中确认的)。具有高于20％(21-26％)的rna含量/蛋白质单位(质量:质量)的不同核蛋白变体(185aa，a-d)以及分别具有渐减量的rna/蛋白质(批次e/f 7-14％；批次g/h 2-4.9％；批次i/j 0.5-0.9％)这样的rna/蛋白质比例的其截短变体(183、172和162aa，批次e-j)的批次。
[0074][0075][0076]
实施例3.使用不同病毒的和具有不同rna/蛋白质比例的经修饰/优化的核蛋白(np-o)来刺激tlr和其他与先天免疫相关的基因
[0077]
用不同的核蛋白进行的基因表达刺激研究显示了rna/蛋白质比例(rna/蛋白质比率，质量:质量)与其激活tlr类型的先天免疫受体的能力之间的直接关系。
[0078]
在所检定的核蛋白之中包括4个不同批次的np-o(在实施例1中所描述的批次a-d，其具有大于20％(在21和26％之间)的rna/蛋白质比例)。还检定了具有在0.5和15％之间的rna/蛋白质的渐减的rna/蛋白质水平的核蛋白(变体e-j)，和由不同实验室赠送的不同病毒来源的其他np变体(变体k-n)，以及为了包含相对于所述蛋白质而言高于20％的rna百分比而进行优化/修饰的其变体。
[0079]
根据在表4中所呈现的结果，所检定的具有低于20％的rna/蛋白质比例的np中没有一个以在经优化的np下所诱导的水平显示出受体tlr3的刺激效应。也未观察到对于tlr3信号转导蛋白(trif/irf3)、其他与抗原呈递相关的蛋白质(drb1；共刺激分子b7.1/b7.2(cd80/cd86))和1型干扰素的基因表达的显著效应。当核蛋白降低其rna水平至低于20％ rna/蛋白质时，il6的基因表达显著地降低(表4)。tlr2的基因表达不随rna/蛋白质比例的降低而显著地受影响，这与该受体通过与rna的组成不相关的途径被激活相一致。所述结果与在现有技术中关于该核蛋白所报道的发现(具体而言，排除了在具有低于20％的rna/蛋
白质比例的核蛋白下受体tlr3的激活的那些)相一致。然而，受体tlr3和依赖于trif( irf3)的途径均从由该受体所探测到的刺激的转导开始而受到刺激。
[0080]
表4.核蛋白变体及其对于与先天免疫应答相关的分子的基因表达的效应
[0081]
变体tlr3tlr2drb1ifnαcd80cd86il6(np-o)-a8.1(**)6.4(**)8.3(**)2.1(*)2.3(*)2.5(*)17.7(***)(np-o)-b7.9(**)5.8(**)8.5(**)2.7(*)3.8(*)2.8(*)18.3(***)(np-o)-c8.3(**)4.9(*)8.7(**)3.1(*)3.8(**)3.8(*)18.3(***)(np-o)-d8.4(**)7.1(**)8.3(**)4.1(**)2.8(**)2.4(*)18.1(***)e1.1(ns)6.3(*)2.3(ns)1.1(ns)1.3(ns)1.5(ns)3.0(*)f1.3(ns)7.8(*)2.5(ns)1.7(ns)1.1(ns)1.3(ns)4.3(*)g0.9(ns)8.0(*)1.7(ns)1.1(ns)1.2(ns)1.2(ns)2.3(*)h1.4(ns)5.1(*)1.3(ns)1.1(ns)1.4(ns)1.4(ns)2.2(*)i1.1(ns)5.4(*)1.3(ns)1.0(ns)1.3(ns)1.5(ns)1.1(ns)j1.3(ns)6.8(*)1.5(ns)1.7(ns)1.2(ns)1.0(ns)1.2(ns)k1.3(ns)6.9(*)1.7(ns)1.1(ns)1.1(ns)1.4(ns)4.6(*)l1.4(ns)7.1(*)1.3(ns)1.1(ns)1.3(ns)1.2(ns)4.5(*)m1.3(ns)6.9(*)1.7(ns)1.1(ns)1.0(ns)1.6(ns)4.2(*)n1.4(ns)6.1(*)1.3(ns)1.1(ns)1.1(ns)0.8(ns)3.9(*)(np-o)-k7.1(**)8.0(**)9.3(**)2.1(*)2.3(*)2.5(*)17.7(**)(np-o)-l7.2(**)5.1(**)8.6(**)2.7(*)3.8(*)2.8(*)15.3(**)(np-o)-m9.3(***)5.4(**)9.7(**)3.1(*)3.8(**)3.8(*)18.3(**)(np-o)-n9.4(***)6.8(**)8.5(**)4.1(**)2.8(**)2.4(*)17.1(**)
[0082]
所有比较都参照未刺激的对照，认为p《0.05为在统计学上显著的差异(*)；p《0.01为非常显著的差异(**)；p《0.001为高度显著的差异(***)。在括号中显示了平均值和统计学比较结果。
[0083]
实施例4.使用基于hbv衣壳的np-o来刺激受体tlr、其转导蛋白和其他与抗原呈递相关联的基因、凋亡、细胞因子和1型干扰素
[0084]
在经分化的heparg细胞中进行批次a-d的经优化的核蛋白对于先天免疫受体的基因表达的效应及其随后效应的研究。为了知晓np-o作为先天免疫受体的激活物的品质，研究了一组与抗病毒、抗致癌和抗变应性效应相关的基因。检定了使用处于不同浓度的np-o对于经分化的heparg系的肝细胞的体外刺激，以知晓其他目的基因是否在体外与先天免疫受体一起被刺激。
[0085]
使用批次e-j的未优化的蛋白质的我们实验室的先前试验没有显示出受体tlr3的刺激，也没有显示出通过trif和irf3的其信号传导途径，这是与使用具有低于20％的ran/蛋白质比例的hbv衣壳核蛋白的在该领域中的其他专家的结果相一致的结果(vanlandschoot等人,j immunol 2005,175(10):6253；作者的答复6253-5)。
[0086]
本研究的目标在于表征np-o对于heparg细胞的基因表达的体外刺激的效应，当所述细胞用不同浓度的核蛋白np-o进行脉冲时，其中对于这些研究不加区别地使用批次a-d的核蛋白。使用不同浓度的核蛋白(直至15μg/ml的蛋白质)并且评价两种不同的温育时间
(24和48小时)。特别地，我们认为重要的是弄清先天免疫系统的探测机制，尤其是tlr、确认向细胞核的信号传送的其衔接蛋白的激活，与凋亡相关的用于增加细胞抗原性的基因的激活，促炎效应(th1/th2)和免疫“训练”的诱导效应的标志物细胞因子的表达以及该效应在所述效应抑制能够感染该细胞系的病毒(hbv)的病毒载量的抗病毒能力方面的具体实现。特别地，研究了先天免疫系统的该类型的刺激抑制病毒复制和同时激活一组标志物(所述标志物与对于细胞抗原性、细胞因子的产生以及在向细胞核的其信号传送途径中依赖于myd88和不依赖于衔接蛋白myd88的基因的激活的效应相关)的能力，以知晓在一周多前建立的感染过程期间所述刺激效应是否得到保持。在该情况下，感染因子是不重要的，但却是一个模型，其使得能够证明先天免疫应答的激活负责可以被发现的抗病毒效应。
[0087]
抗原和制剂
[0088]
作为本发明目标的核蛋白包含在本发明的实施例2中所展示的氨基酸序列(批次a-d)，其计有总共185个氨基酸并且在细菌大肠杆菌中自组装成大小为28-32纳米的具有病毒样外观的蛋白质。从其化学性质的角度来看，其特征为存在大于20％的rna/蛋白质单位(质量:质量)和低于2％的dna/蛋白质单位(质量:质量)的比例。
[0089]
heparg细胞系和人原代肝细胞
[0090]
选择heparg细胞系，因为没有任何在实验室中通常使用的永生化肝细胞系容许被hbv感染。这允许在未感染的和还有被病毒感染的heparg细胞中研究基因表达的刺激，特别地我们使用hbv作为模型。人原代肝细胞长期是唯一的用于研究hbv的完整复制周期的系统；然而，在发现了名为heparg的人肝癌细胞系后，这个限制就被克服了。培养中的该细胞系的行为如肝祖细胞，其具有在用dmso进行处理后分化为类似于肝细胞和胆细胞的颗粒细胞的潜力(gripon等人,proc natl acad sel u s a 2002,99(24):15655-15660)。牛磺胆酸钠协同转运多肽(ntcp)(仅在分化后在heparg细胞中表达的转运蛋白之一)是特异于hbv的受体(ni等人,gastroenterology 2014,146(4):1070-1083)。
[0091]
培养中的细胞系的分化
[0092]
细胞分化过程改编自以前所报道的(gripon等人,proc natl acad sci u s a 2002,99(24):15655-15660)。简而言之，对于常规分化过程，使用两步骤的程序。首先将细胞在生长培养基中维持2周。然后，在分化培养基(相同的培养基-william e培养基，其补充有10％的fcs、100个单位/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、5μg/ml的胰岛素和5
×
10-5
m的氢化可的松半琥酯以及2％的dmso)中再维持2周。每2或3天更新培养基。
[0093]
使用经优化的核蛋白来刺激heparg细胞
[0094]
与抗原的温育通过以0、1.25、2.5、5、10和15μg/ml的hbcag蛋白(其包含在核蛋白化合物中)的浓度添加核蛋白来进行。使用三次不同的实验重复。测试两种温育时间(24和48小时)。在所有情况下，使用未刺激的细胞作为阴性对照。
[0095]
用hbv感染的heparg细胞的刺激
[0096]
如上面所描述的那样，用经纯化的hbv感染经分化的heparg细胞(500个基因组当量/细胞)。简而言之，将heparg细胞与hbv一起在补充有4％ peg 8000(sigma)的培养基中在37℃下温育过夜。在温育结束时，将细胞用pbs洗涤三次并且在1.8％的dmso和5
×
10-5
m的氢化可的松半琥酯存在下进行维持。允许感染建立一周，此后将细胞用核蛋白或恩替卡韦处理24或48小时。
[0097]
实时定量聚合酶链反应(qpcr)
[0098]
使用商业反应混合物sybr green(quantitect sybr green pcr试剂盒,qiagen,germany)，将qpcr反应调整至15μl的最终体积。该试剂盒包含hot start taq聚合酶以避免假阳性。对于每个反应，取出并且组合下列试剂的量：7.5μl的sybr green混合物(quantitect sybr green pcr试剂盒,qiagen)、1μl的2种核苷酸中的每一种(10pmol/μl)和0.5ml的水。
[0099]
按照在qpcr中所评价的样品的量用这些组成成分制备反应混合物。最后，从该混合物中取10μl用于每个pcr管(0.2ml的容量)，和然后还向pcr管中添加5μl的事先经稀释的cdna(1:10、1:40和1:500)。在阴性对照的情况下，取而代之地添加5μl的水，以补足15μl的总反应体积。
[0100]
在遗传工程与生物技术中心(centro de ingenier
í
a gen
é
tica ybiotecnolog
í
a(cigb),havana,cuba)合成特异性引物，并且以10pmol/μl进行使用。其序列从文献获得，或者备选地，在某些特殊情况下，设计引物。
[0101]
热循环在rotor gene 3000实时pcr(corbett research,australia)中进行。pcr在95℃下温育15分钟以激活聚合酶后开始，随后为94℃15秒、55℃30秒和72℃30秒的40个循环。
[0102]
统计学
[0103]
为了改善结果的精确性，将目的基因的所有qpcr定量与由用gusb引物同时扩增的来自一组未处理的细胞的cdna样品的系列稀释(典型地，1/40、1/80、1/160、1/320)制作的标准曲线进行比较。将所有样品针对相同的标准曲线进行定量，并且将结果表示为相对单位。基因表达刺激的结果以三次重复的平均值给出，其中认为关于阴性对照的平均值为1，而关于每个处理组的平均值为超过阴性对照的平均值的倍数。
[0104]
在每个处理组的三次重复的平均值和其相应的三个阴性对照(在时间上一致的未处理的细胞)的平均值之间进行统计学比较。应用双尾student t检验，其中考虑了由先前的f检验给出的同方差性的结果。将显著性水平确立在p≤0.05。认为p《0.01的值是非常显著的统计学差异，在p《0.001的情况下认为是高度显著的统计学差异。数据分析用程序microsoft excel和prism,5.0版来进行。
[0105]
toll-样受体(tlr)基因表达的核蛋白刺激
[0106]
渐增剂量的经优化的核衣壳对于刺激tlr2、tlr3和tlr7的基因表达的效应导致相对于其他tlr而言最强有力的效应(图1)。在tlr9的情况下，刺激是弱的。在tlr8的情况下，在24小时的刺激后，检测到高水平的刺激，这在48小时的培养后未发现。在几组实验中确证了tlr2/tlr3的基因表达的强的和正的刺激。其中三个仅使用经优化的核蛋白和以相同方式使用其制剂。
[0107]
总之，在两个不同时刻(24和48小时)和在未感染和用hbv感染的细胞培养物中确证了tlr2、tlr3和tlr7的刺激(图1)。在体外刺激中不同浓度的核蛋白的研究证明了这些特殊基因的基因表达的显著和剂量依赖性的增加。
[0108]
受体tlr的衔接蛋白的基因表达的刺激
[0109]
还通过评价一些其衔接蛋白(myd88、trif、irf3和nf-κb)的基因刺激而研究了tlr的基因表达的刺激。在干扰素调节因子3(irf3)的情况下，在24小时后刺激是最强的，随后
为髓样分化初级应答基因(myeloid differentiation primary response gene)88(myd88)的强度。核因子-经激活的b细胞的κ轻链增强子(nf-κb)的刺激在48小时的温育后是更大的(图2)。对于所研究的四个基因，基因表达的刺激在24小时和除了trif外还在48小时是阳性的(具有与阴性对照的显著差异)。
[0110]
主要组织相容性系统(i类和ii类mhc)分子的基因表达的刺激
[0111]
用经优化的核蛋白对heparg细胞的刺激证明了主要组织相容性复合体(i和ii类mhc)的基因的基因表达的强烈增加。在i类hla基因的情况下，基于先前对于heparg细胞的单倍型的表征选择了hla-a。使用泛单倍型寡核苷酸作为引物，并且作为pcr的结果，证明了表达水平的强烈增加，虽然hla-a的基础表达水平相比于组成性基因gusb的基因表达的基础水平而言是相似的或更高的(图3)。类似地，还研究了三个ii类mhc等位基因(drb1、dpb1和dqb1)，并且证明了基因表达的刺激(图3a-c)。ii类mhc的刺激在所述三个等位基因中得到验证。这些基因以非常低的基础水平表达。然而，在不同的所研究的条件下用np-o进行的刺激将基因表达水平增加至接近组成性地表达的对照基因gusb的水平(图4b)。
[0112]
与凋亡相关的蛋白质的基因表达的刺激
[0113]
用np-o对heparg细胞的刺激显现出bax基因的更大的表达(图5a)，并且在相对轻微的初始增加后，在用np-o刺激48小时后为以大约30％的bcl-2基因的表达抑制(图5b)。随着时间，这两个基因的行为导致在促凋亡意义上的bax/bcl-2基因表达比率的增加(图5c)。
[0114]
细胞因子和干扰素的基因表达的刺激
[0115]
用np-o对heparg细胞的刺激导致il6基因的更大的表达(图6a)。虽然il6基因刺激的最大值相对于对照基因gusb的基因表达而言为大约7％(图6b)，但是这是令人注目的，因为基因表达被强烈抑制在基础水平。所有未刺激的对照细胞在所研究的条件下产生不可检测的基因表达水平。任意地规定0.1％的值以分析基因表达的刺激。
[0116]
用np-o对heparg细胞的刺激导致在特殊条件下ifnα和ifnβ的基因表达的增加(图7a和b)。虽然该效应主要在未刺激的细胞的阴性对照的1.5和2倍之间，但是在一些情况下，该效应在所研究的条件下是在统计学上显著的。需要强调的是，在该类型的细胞系中，在温育大约10小时之时验证了对于干扰素的基因表达的效应。
[0117]
在病毒感染条件下用np-o对heparg细胞的刺激
[0118]
为了评价病毒感染(在该情况下，使用hbv感染作为模型)对于由np-o诱导的基因刺激的效应，将heparg细胞与渐增剂量(直至10μg/ml)的np-o一起温育48小时。选择两个tlr基因作为不依赖于和依赖于myd88的刺激剂(分别为tlr2和tlr3)，和选择两个另外的相关于呈递(ii类hla)和细胞因子il6的刺激方面从在未感染的刺激环境中对于hbcag刺激的最佳应答者中选择出的基因。所述四个基因证明了基因表达的刺激(图8)。
[0119]
与先天免疫应答的激活相关的抗病毒效应
[0120]
为了研究在hbv感染的背景下通过用经优化的核蛋白进行处理而诱导的先天免疫应答的抗病毒效应，用hbv感染heparg细胞并且在7天时以10微克/ml培养基的剂量用经优化的核蛋白进行刺激。作为对照组，使用poly ic，其是一种作为tlr3的激动剂的先天免疫应答的刺激性化合物，和另外，作为抗病毒效应的阳性对照，使用在hbv慢性感染治疗领域中被公认为抗病毒的恩替卡韦。如在图9中所观察到的，hbv感染不妨碍所述两条途径的tlr的基因刺激(依赖于和不依赖于myd88的；细胞因子il6和ii类hla(drb1))。
[0121]
结果显现了tlr3的激动剂的基因表达的刺激效应的优越性，当向被具有病毒样物理外观的核蛋白所保护的培养基施用时。在经脉冲而无渗透促进物质存在的培养基的条件下，在poly ic情况下的刺激效应是有限的。相反地，病毒样颗粒的特征促成经优化的核蛋白的渗透，并且几种以相同结构的激动剂的存在促成通过所述两条途径(依赖于和不依赖于myd88的)的刺激，这生成比tlr3的单一激动剂大得多的刺激，从而增加抗原呈递，细胞因子分泌，和如在图10中可以看出的，还有抗病毒效应，其程度相对于未处理的细胞而言具有显著影响并且与由恩替卡韦(因为以较低剂量用于治疗慢性乙型肝炎而具有公认声誉的抗病毒药)所生成的那种在统计学上没有差异。鉴于在培养物中不存在适应性免疫系统的其他组分，hbv复制的变化仅作为在本发明中所描述的先天免疫受体的激活和所引发的过程的结果而产生。
[0122]
实施例5.在体外和在体内对于其他病原体的抗病毒效应
[0123]
在np-o的抗病毒活性的第二个分析中，评价了在培养中的细胞系之中先天免疫的激活对于其他病毒的复制的效应。另外，还当将其添加至用冠状病毒的三个不同毒株、流感病毒和登革热病毒的不同血清型感染的不同细胞系的体外培养物时评价了用np-o进行刺激的heparg细胞的培养物上清液，其中显现了在经处理的细胞中病毒计数的显著减少，然而在未处理的细胞中未能看到任何效应。在经处理的细胞中的病毒计数与相对于的未处理的细胞之间的差异为至少1个对数的每一种所述病毒的病毒载量。这些结果，和以前所展示的那些，与在由冠状病毒和其他引起急性、慢性和复发性感染的病毒造成的病毒感染的情境中作为抗病毒药的np-o的作用相一致。
[0124]
向具有由蚊子传播的病毒性疾病(尤其是登革热、寨卡热和奇昆古尼亚热)的患者施用包含np-o的制剂允许，显著更低百分比的患者减轻疾病的临床症状，并且在用np-o进行治疗的组中进入更严重阶段的那些患者的比例降低，相对于未用包含所述np-o的制剂进行治疗的那些患者而言。不同的np-o变体的使用证明，可能的是诱导相似的结果，而不依赖于为了生成具有20％ rna/蛋白质的np-o所使用的病毒衣壳的类型。在用100名患者/组的效力研究中，仅在未接受np-o制剂的那些患者的情况下发现具有疾病加重的患者。一致地，显现了先天免疫激活标志物的增加。
[0125]
实施例6.在联合治疗背景下的核蛋白np-o
[0126]
治疗的组合可以被认为是在用作为本发明目标的化合物的治疗的临床实施中最经常使用的备选方案之一。依据物理化学技术，给批次a-d的np补充一组具有通过静电相互作用与颗粒结构相缔合的能力的化合物。在一种情景下，与补充有疫苗mrna和干扰rna的其他np相联合地使用本发明的np。在用病毒因子例如hbv、冠状病毒sars-cov2、流感病毒和登革热病毒感染的培养中的细胞的处理中，在体内和在体外不加区别地使用这些化合物。
[0127]
该类型化合物的联合保持大于20％的rna/蛋白质比例的在治疗性/疫苗制备物中的最终比例。向病毒培养物施用该类型的化合物在每种情况下以大于1个对数降低病毒计数。当用不具有高于20％(质量:质量)的rna/蛋白质水平的np进行组合时，未观察到所述效应。
[0128]
其他与np相组合或相联合地使用的化合物在核苷酸或核苷性质的化合物的组中，例如核苷或核苷酸类似物、poly ic、c-di amp化合物、核苷酸聚合物nap、刺激性寡核苷酸cpg和核苷(酸)性质的其他化合物。
[0129]
在粘膜组织的细胞中以及在血液和肝脏的细胞中，所使用的np-o制剂显现出其增加受体tlr3、tlr7、tlr8、tlr9和tlr2，从而激活依赖于和不依赖于myd88的途径的能力。
[0130]
在所有情况下都可以证明受体tlr的增加，并且该激活与由先天免疫的该刺激所介导的在登革热病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv、hpv感染的情景下的抗病毒效应相关联。在体外条件下以及在体内条件下都证实了该效应。
[0131]
实施例7.在呼吸道感染性疾病背景下的核蛋白np-o
[0132]
在动物和志愿者中施用np-o证明了先天免疫受体，尤其是与病毒病原体相关性分子图式的探测相关的那些(tlr3、7和8)的局部和全身增加。
[0133]
具体而言，在与包含hbv表面抗原的脂蛋白体相组合的制剂中应用hbv衣壳的np-o生成这些受体的刺激效应，在局部水平上在扁桃体的上皮细胞中，以及在全身水平上，从而增加了在血液中的单核细胞的呈递和激活能力。
[0134]
np-o的使用的一个实际应用在由冠状病毒sars-cov2造成的感染的背景下进行，在疑似患者中和在对所述病毒来说阳性的患者中。该类型的治疗以加速方案(阳性或疑似患者)和以先天免疫系统的“训练”方案来进行。
[0135]
在持续时间为14天的加速方案中施用包含np-o的制剂。该研究显现了疑似的以及对于cov和其他rna病毒来说阳性的患者的先天防御的激活，其中使用10至500微克的np-o的剂量，在溶液中或与其他抗原相组合地。在一些制剂中，将装置用于通过in和sl途径借助于分散进行施用，以及通过使用对于此类程序来说特有的滴管或滴注管以滴剂进行施用。
[0136]
同时地在鼻内施用(每周接种，3次)和sl施用(每日施用，14天)的临床研究中评价了受体tlr3、tlr7和tlr8的激活效应。从起始所述产品施用的第4天起开始检测到tlr3/7和8的基因表达(ge)的显著增加(图11)。
[0137]
作为应用所述产品的结果，未检测到与cov感染和其他伴随感染相关联的临床症状的加重。经治疗的患者具有令人满意的随后恢复，不依赖于所存在的基础感染。在绝大多数用np-o制剂进行治疗的患者中，可以看到作为牵涉冠状病毒探测的rna受体一起进行分析的受体tlr3、tlr7、tlr8的刺激模式(图11)。这些结果与临床前研究相一致。
[0138]
在第二个治疗方案中，在哈瓦那市老年公寓招募了一组年龄超过60岁的志愿者。所述志愿者接受了10至100微克的np-o的用量，作为单一组分或者在几种先天免疫系统激活组分的制剂中。所述产品的施用以in和/或sl途径接种方案，以每日、每三天或每周一次的频率，持续1至12个月的时间段。该先天免疫系统的“训练”过程允许，在接受包含np-o的制剂的志愿者中，证实了相对于未用所述产品进行治疗的组而言更少数目的呼吸系统疾病。同样地，被感染的那些患者的临床症状显著地减少。所述抗原的应答反映于具有以tnfα和il6的分泌增加为特征的“经训练的”免疫的标志物模式的外周血单核细胞中，而所述细胞因子在经治疗的受试者的血清中显著降低，该效应仅与外周血淋巴细胞的刺激相关联，和在用np-o进行治疗的受试者的血清中则不是这样。以这种方式，在具有年龄相关的免疫缺陷的人中在先天免疫系统的免疫训练中使用所述产品及其制剂。
[0139]
在第三个治疗方案中，将hbv和hcv衣壳的np-o用于肽与所述np-o的缀合，它们通过基因工程技术而插入在所述蛋白质的序列内，并且在一个特别的补充变化形式中，采用用干扰rna和信使rna的序列的补充，它们通过所得的病毒样颗粒而得到保护和稳定化。体外和体内结果证明，补充有这些蛋白质和疫苗rna成分的这些np-o仍然具有多于20％的
rna/蛋白质，并且同时诱导强烈的适应性和保护性应答。
[0140]
实施例8.在与实体肿瘤相关联的肿瘤学疾病的背景下使用核蛋白np-o
[0141]
研究了在肝癌的免疫治疗情景下np-o的效应。具有肝细胞癌的影像学检测和具有肝癌存在的确诊的患者通过静脉内和/或与经动脉化学栓塞术(tace)程序相关联的途径接受np-o制剂，直接应用至肿瘤。在另一个治疗备选方案中，在其中未进行tace程序的患者中评价肿瘤内和肿瘤周施用。将该产品与疫苗一起进行施用，所述疫苗通过in途径进行施用并且除了其他疫苗抗原之外尤其包含抗原np-o。局部(肿瘤内或肿瘤周)施用与in施用的组合生成免疫应答，其反映于在肿瘤微环境中mdsc的数量的明显减少，以及以肝脏肿瘤作为再循环目的地的淋巴细胞的数目的增加。作为该联合治疗的结果，可以证明在肝实质中存在的肿瘤的大小和数目的显著减少，这与相对于在该类型的免疫治疗方案中未用np-o进行治疗的患者组而言在经治疗的患者中更高的存活相关联。在源自hbv和hcv感染的肝脏肿瘤的情况下，不加区别地使用具有相似抗肿瘤效应的hbv和hcv的np-o，甚至与乙型和丙型肝炎病毒的其他表面蛋白相组合地使用所述np-o的制剂。与包含所述np-o的疫苗的联合施用对于仅通过np-o的it或tace途径施用所诱导的效应生成叠加效应。对于患者存活的效应高于其他常规疗法，例如在没有与np-o的联合疗法的情形下通过tace施用的索拉非尼或产品的情况。
[0142]
在实体肿瘤的情景下，在与以同时或连续方式施用的其他化合物相联合的疗法中施用np-o，如分别与bcg和索拉非尼的联合施用的情况。以这种方式，方便和合理地从联合治疗的施用开始来优化抗肿瘤效应。与bcg的组合促成用与提供tlr3激动剂的np-o相联合的疗法对该所建立的治疗进行补充，这是对于该疗法具有额外益处并且反映于抗肿瘤疗法的影响中的一个方面，其中所讨论的治疗的功效百分比增加。
[0143]
从np-o的静脉内施用和从树突细胞和肿瘤细胞的离体或体外治疗验证了对于非实体肿瘤的效应，其中使用np-o以便增加所述细胞的抗原性并且具有更大的抗原呈递能力，这是随共刺激信号的增加而增强的效应。
[0144]
实施例9.在用于感染性、肿瘤学和变应性疾病的预防性和治疗性疫苗接种的背景下使用核蛋白np-o
[0145]
可以验证，通过sl途径的反复施用能够改变接受了包含np-o的制剂的变应性个体的临床特性谱。从三个月的治疗开始，在具有对于螨类的变态反应的那些患者中可以观察到需要服用抗组胺药的个体的数目减少。同样地，可以验证，在免疫训练的过程中通过sl途径进行治疗的患者中变态反应发作减少了，与呼吸系统疾病的症状和频率的减少相平行地。以这种方式，np-o显现出，其可以单独地或与变应原相组合地构成抗变应性疫苗的一部分。
[0146]
同样地，np-o刺激对于来自病毒和非病毒病原体的肽和亚基蛋白质的免疫应答的能力通过检测到免疫应答的增加而得到验证，当将肽和可溶性蛋白质与np-o相缀合地进行施用时或当在溶液中进行该施用时。以这种方式验证了“载体”效应，其使得能够增加与np-o相缀合的肽抗原的免疫原性。在np-o的探测中所牵涉的先天免疫系统受体的多样性允许它们向抗原提供这样的免疫应答，其在th1抗病毒应答的数量和模式以及针对抗原的多功能t细胞的诱导方面以显著差异胜过通过在np-o不存在下施用这些肽、多肽和可溶性蛋白质抗原所生成的应答。
[0147]
取决于待使用的抗原和np-o的使用，通过粘膜途径(优选地，in和sl)以及通过sc、im和甚至肿瘤内途径来施用包含np-o的疫苗制剂。包含np-o的制剂可以在使用粘膜粘着剂的情况下通过粘膜途径来进行施用，所述粘膜粘着剂尤其是但不限于羧乙烯基聚合物以及基于或衍生自纤维素的其他聚合物，和通常允许更大的在疫苗治疗或np-o治疗效应的目标粘膜中的生物利用率的那些。
[0148]
实施例10.在流行病和大流行病的条件下使用不同的经优化的核蛋白来激活先天免疫系统
[0149]
对基于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、cov和登革热病毒的衣壳抗原的核蛋白的序列进行优化，从而取得高于20％的rna/蛋白质比例的增加。在所述实施方案中验证了相对于未修饰/优化的所述核蛋白的rna比例而言当rna比例超过20％时先天免疫的刺激效应。在所发现的效应中包括所述核蛋白在呼吸道感染的背景下刺激先天免疫应答的能力，在体内和体外模型中获得了与凋亡过程的激活和更大的肿瘤细胞的抗原性相关联的抗肿瘤应答，并且显现了由对于减少病毒感染来说特异性的抗病毒细胞因子的产生途径的恰当刺激所介导的抗病毒效应的存在和用所述核蛋白进行治疗的动物的临床症状的改善。还在生殖泌尿系统中在减轻复发性感染过程方面观察到通过in和sl途径的所述治疗的益处。这些效应通过下述方面而得到验证：用np-o进行治疗的老年受试者的更高的存活；以及从呼吸道、胃肠道和生殖泌尿系统感染的复发开始用必需抗生素的治疗的显著减少。
[0150]
通常，在肿瘤、变态反应和感染模型中使用经优化的核蛋白，这导致相比于具有低于20％的rna/蛋白质比例的核蛋白而言在其功能效力方面的明显优越性。先天免疫应答的刺激能够抑制呼吸道病毒(尤其是冠状病毒科的病毒)、具有肝向性的其他病毒的复制，并且通常与先天免疫系统的标志物的激活相关联。