一种高效诱导真菌产木质纤维素酶的诱导剂及生产纤维素酶的方法与流程

1.本发明属于生物发酵领域，具体涉及产纤维素酶里氏木霉的诱导培养。


背景技术：

2.生物质是植物以二氧化碳和水为原料利用太阳能合成的有机质，全球年产千亿吨，是可再生资源。通过生物技术和高分子材料技术将生物质转化成为先进制造和环保新材料，称为新材料生物炼制，是一个新兴产业；产品可广泛应用于航空航天、交通运输、医疗设备和新能源装置等高端制造业，以及可降解塑料如聚乳酸等生态环保产业，有助于消除石化塑料对土壤等环境造成的“白色污染”问题。农作物秸秆是生物质原料最有代表性的原料，利用秸秆等农林废弃物生产新材料产品，变废为宝，部分取代化石原料如石油、煤炭和天然气，不仅具有原料可再生、生产和应用过程生态环保的优势，而且秸秆原料的生成吸收了二氧化碳，废弃后降解为二氧化碳，整个过程无排放。
3.农作物秸秆等生物质转化成新材料，首先需要复合木质纤维素酶对其进行有效降解。目前，工业常用于产纤维素酶的菌株是里氏木霉，常用的诱导剂为槐糖或者微晶纤维素等，价格昂贵，虽然有研究公开使用非可溶性碳源如秸秆、麸皮等作为初始碳源，但在后续补料发酵过程中也均需要额外补充添加槐糖等高价可溶性糖，致使纤维素酶的生产成本一直居高不下；此外，使用微晶纤维素或者可溶性糖诱导产生的纤维素酶酶系单一，虽然可用于饲料、纺织等行业，但此类纤维素酶对结构组分更为复杂的木质纤维素生物质的降解能力有限，酶解出的糖浓度低，无法满足下游产品的发酵生产及加工，对新材料生物炼制产业的发展造成极大的阻碍。


技术实现要素：

4.为克服现有技术存在的上述的缺陷，提供如下的技术方案：
5.本发明第一个方面是提供一种可以高效诱导真菌产木质纤维素酶的诱导剂，所述的诱导剂分为长效诱导剂和长效短效混合诱导剂，其中长效诱导剂为固体培养基组分，具体为1～3％汽爆秸秆；长效短效混野诱导剂为15～30％的汽爆秸秆酶解液；优选的，所述的汽爆秸秆为蒸汽爆破预处理玉米秸秆，还优选的，汽爆秸秆的蒸汽爆破预处理强度所导致的毒性物质含量需满足：甲酸含量0.8-1.2g/l，乙酸含量1-1.5g/l，糠醛含量0.5-1g/l。或者优选的，所使用的蒸汽爆破预处理强度为180～220℃，10～20min；或者优选的，所述的汽爆秸秆酶解液的制备方法为汽爆秸秆浓度为15～30％，木质纤维素酶液添加量25～40％，余量为水，45～55℃160～200rpm的条件下酶解15～25h；或者优选的，其中酶解液组分为：葡萄糖含量15-25g/l，纤维二糖含量15-20g/l，木糖含量10-15g/l，阿拉伯糖含量5-10g/l，半乳糖含量2.5-5g/l，甘露糖含量2.5-5g/l，槐糖含量2.5-5g/l。
6.本发明的第二个方面是提供一种诱导真菌发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述的真菌为霉菌，优选的为里氏木霉；所述的方法包括如下步骤：1)孢子培养；2)种子
培养；3)发酵培养；4)酶活测定；其中发酵培养中使用本发明第一个方面所述的诱导剂进行诱导，所述的诱导是在补料中添加诱导剂；优选的，所述的补料从发酵第48～72小时开始补料，共补5～8次，且补料的时间点均是无法继续通过降低转速来维持do的点，开始补入固体补料培养基及液体补料培养基；优选的，所述的补入固体补料培养基操作为补入：1～3％汽爆秸秆，补料量依次递增，分别为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％；优选的，所述的补料液体补料培养基为：10～30％的汽爆秸秆酶解液(长效短效混合诱导剂)、2％磷酸二氢钾、1％硫酸铵、1％硫酸镁，补料量依次递增，分别为2％、3％、4％、5％、6％。
7.本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的诱导剂在促进里氏木霉高效生产纤维素酶中的应用,优选的，所述的应用为工业化生产应用，其中发酵罐溶剂为50l～500l。
8.本发明第四个方面是提供本发明第二个方面所述的方法在促进里氏木霉高效生产纤维素酶中的应用，优选的，所述的应用为工业化生产应用，其中发酵罐溶剂为50l～500l。
9.本发明的有益效果
10.1.本发明开发了一种低成本的产木质纤维素酶的诱导剂，并对制备诱导剂原料特性以及获得诱导剂的组分进行了限定，使其具备最佳的诱导效果。
11.2.利用可溶性碳源和非可溶性碳源协同诱导里氏木霉生产纤维素酶，长效诱导剂和短效诱导剂协同作用，保证了诱导效果，同时缩短了发酵周期，显著提高了纤维素酶产量和产率，降低了纤维素酶生产成本，同时也提高了其对于木质纤维素材料的降解能力。
附图说明
12.图1里氏木霉在长效和长效短效混合诱导剂诱导条件下产生的滤纸酶活性；
13.图2酶解总糖色谱峰图，其中，葡萄糖含量56.1g/l，纤维二糖含量3.1g/l，木糖含量20g/l；
14.图3本发明开发的诱导剂(a)与微晶纤维素(b)、槐糖(c)，以及汽爆秸秆纯固体材料(d)的诱导效果的色谱峰图；
15.图4本发明的补料方式(c)与常规间隔(a：12小时，b：24小时)补料色谱峰图；
16.图5利用长效和长效短效混合诱导剂诱导里氏木霉的滤纸酶活性。
具体实施方式
17.以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
18.实施例1里氏木霉高产木质纤维素的培养方法
19.1)孢子培养
20.将孢子液涂布至孢子培养基，于30℃培养7天，直至孢子长满整个培养基，之后用无菌水将孢子刮下储存于4℃冰箱待用。
21.其中，里氏木霉孢子培养基组分如下：2％无水葡萄糖，4％产酶大量元素营养盐
浓，0.04％产酶微量元素，0.2％玉米浆，2％吐温-80，2％琼脂。配好以后于121℃，0.1mpa条件下灭菌25min。
22.产酶大量元素组分为：7％kh2po4，9.8％(nh4)2so4，2.1％mgso4；产酶微量元素组分为：3.5％feso4·
7h2o，1.09％mnso4·
h2o，0.98％znso4·
7h2o，1.4％cocl2·
6h2o。
23.2)种子培养
24.取孢子悬浮液接种于种子培养基，体系1l，接种量为1
×
109个/l，于30℃，1vvm条件下培养30h左右，直至种子液的吸光度(optical density，od)为7-8。
25.其中，里氏木霉种子培养基组分如下：1％葡萄糖，1.4％种子大量元素营养盐浓缩液，0.14％种子微量元素浓缩液，0.07％玉米浆。配好以后于121℃，0.1mpa条件下灭菌25min。
26.种子大量元素组分为：14％kh2po4，9.8％(nh4)2so4，2.1％mgso4；种子微量元素组分为：3.5％feso4·
7h2o，1.09％mnso4·
h2o，0.98％znso4·
7h2o，1.4％cocl2·
6h2o。
27.3)发酵培养
28.a.发酵培养
29.将种子液移种至发酵培养基，体系10l，移种量为10％，于30℃，1vvm，180-450rpm条件下培养。通过补料，使溶氧(dissolved oxygen，do)维持在30-40％，通过补氨水使ph维持在4.8左右。发酵过程中每隔一小时记录温度、转速、ph和溶氧(dissolved oxygen，do)等参数，并从发酵第三天开始取样测定滤纸酶活，直至发酵第七天，下罐。
30.其中，里氏木霉发酵培养基组分如下：30％的汽爆秸秆酶解液，1％葡萄糖，4％产酶大量元素，0.04％产酶微量元素，0.2％玉米浆，其余用水补齐体系9l。配好以后于121℃，0.1mpa条件下灭菌25min。
31.b.补料设计
32.从发酵第48小时开始补料，共补5次，且补料的时间点均是无法继续通过降低转速来维持do的点，即当转速180rpm，do开始回升至40％以上时，开始补入固体补料培养基及液体补料培养基。
33.其中，固体补料培养基：2％汽爆秸秆，补料量依次递增，分别为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％；
34.液体补料培养基：20％的汽爆秸秆酶解液、2％磷酸二氢钾、1％硫酸铵、1％硫酸镁，补料量依次递增，分别为2％、3％、4％、5％、6％。
35.其中，步骤a与b中的汽爆秸秆酶解液制备：汽爆秸秆浓度为20％，木质纤维素酶液添加量30％，余量为水，在50℃，180rpm的条件下酶解20h左右，直至检测到的酶解液组分为：葡萄糖含量15-25g/l，纤维二糖含量15-20g/l，木糖含量10-15g/l，阿拉伯糖含量5-10g/l，半乳糖含量2.5-5g/l，甘露糖含量2.5-5g/l，槐糖含量2.5-5g/l。本发明所使用的酶解时间参数为20h，酶解液中除含有这些可溶性糖类，还另外含有未被完全酶解的秸秆固体。
36.其中，以上所使用的秸秆的蒸汽爆破预处理强度所导致的毒性物质含量需满足：甲酸含量0.8-1.2g/l，乙酸含量1-1.5g/l，糠醛含量0.5-1g/l。本发明所使用的蒸汽爆破预处理强度为200℃，15min。
37.4)酶活测定
38.滤纸酶活力(fpa)测定按照iupac推荐的国际标准方法测定。一个滤纸酶活力国际单位(iu)等于标准酶促反应条件下每分钟生成1.0μmol葡萄糖(以还原糖计)所需的酶量，用iu/ml表示。
39.最终，发酵第7天获得最高25.5u/ml的滤纸酶活，滤纸酶活随发酵天数的变化趋势如图1.
40.秸秆酶解总糖测定及秸秆酶解率计算
41.以汽爆秸秆为底物，取发酵第七天的酶液对其进行酶解总糖测定。
42.测定程序如下：酶解体系100毫升，酶解汽爆秸秆底物浓度15％，木质纤维素酶添加量40％，用2m氢氧化钠调节ph至4.8-5.0，在55℃、120rpm条件下酶解24h；之后离心，收集上清用hplc测定葡萄糖、纤维二糖、木糖浓度(测定糖样品时色谱柱的温度为80℃，流动相为超纯水，流速0.6ml/min)。
43.本发明最终获得79.2g/l酶解总糖，其中，葡萄糖含量56.1g/l，纤维二糖含量3.1g/l，木糖含量20g/l，酶解的色谱峰图见图2。经过计算得知，在此酶解体系下，对于汽爆秸秆纤维素的酶解效率为71.5％，对于汽爆秸秆半纤维素的酶解效率为78.2％.
44.计算方法如下，
45.秸秆纤维素酶解效率＝[(c1 c2/0.9)*0.9*v/m*100％/r1]*100％
[0046]
其中，
[0047]
c1：液相所测得的葡萄糖浓度；
[0048]
c2：液相所测得的纤维二糖浓度；
[0049]
0.9：葡萄糖脱水聚合成葡聚糖的系数；
[0050]
v：酶解反应体系(单位:l)；
[0051]
m：酶液体系中汽爆秸秆的添加量(单位:g)；
[0052]
r1：汽爆秸秆原始的纤维素含量，本发明测得为50％。
[0053]
秸秆半纤维素酶解效率＝[c3*0.88*v/m*100％/r2]*100％
[0054]
其中，
[0055]
c3：液相所测得的木糖浓度；
[0056]
0.88：木糖脱水聚合成木聚糖的系数；
[0057]
v：酶解反应体系(单位:l)；
[0058]
m：酶液体系中汽爆秸秆的添加量(单位:g)；
[0059]
r2：汽爆秸秆原始的半纤维素含量，本发明测得为15％。
[0060]
实施例的对比试验1
[0061]
为了验证本发明开发的诱导剂的诱导效果，将其与工业常用的高价格诱导剂微晶纤维素、槐糖，以及低价汽爆秸秆纯固体材料的诱导效果进行对比，此组一共做了四组对比试验,比对结果如表1，色谱峰图见图3。结果显示，本发明开发的混合诱导剂，具备最佳的滤纸酶活和酶解汽爆秸秆的能力。
[0062]
表1
[0063][0064]
实施例的对比试验2
[0065]
为了验证本发明开发的补料方式(依据溶氧值的递增补料方式)的优势，将本发明的补料方式与常规间隔补料作为单一变量，进行相比，此组一共做了三组对比试验。比对结果如表2，色谱峰图见图4。结果显示，本发明开发的补料方式，同样具备最佳的诱导优势。
[0066]
表2
[0067][0068]
实施例2
[0069]
将本发明开发的诱导剂及诱导方法，用于大体系中试发酵，种子体系50l，发酵体系500l，其余方法同以上技术方案所述。滤纸酶活测定获得最高26.6u/ml的滤纸酶活(图5)。测得的酶解总糖有81g/l，其中，葡萄糖含量56.9g/l，纤维二糖含量2.1g/l，木糖含量22g/l。经过计算得知，在此酶解体系下，对于汽爆秸秆纤维素的酶解效率为71％，对于汽爆秸秆半纤维素的酶解效率为86％。各方面数据显示效果优异，能用于工厂生产。
[0070]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。