一种交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体及应用其的倏逝波光纤传感器

1.本发明涉及一种交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体及应用其的超灵敏倏逝波光纤生物传感器，属于生物技术和分析测试领域。


背景技术：

2.食品中真菌毒素严重威胁人类健康，迫切需要廉价、快速、灵敏的检测方法。基于高效液相色谱与质谱的各类检测方法是目前真菌毒素检测的金标准方法，具有检测灵敏度高，特异性好的优点。但该类方法依赖于昂贵和需要专业维护的大型仪器设备，而且需要进行繁琐的样品前处理来消除样品基质对检测的干扰，因此不适合用于快速和现场检测。为了克服上述问题，近些年来基于抗体的快速检测方法快速发展起来。最常用的是基于胶体金的免疫试纸条和酶联免疫(elisa)试剂盒。其中elisa方法的灵敏度较高，基本可以满足实际需求，而且样品的前处理步骤简单，但是检测步骤依然繁琐，检测时间还需数个小时，并且价格依然较高。另外，抗体通过动物免疫产生，因此存在批次间性能不一致的问题，给定量检测带来不便。
3.核酸适配体(aptamer)是具有独特空间构型的单链dna(ssdna)或者rna分子，通常通过被称为指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,selex)的体外筛选方法获得(nature,1990,346,818-822；nature,1992,355,564-566)。核酸适配体易于化学合成和修饰，并且批次之间性能差异小，而且成本较低。近些年来，基于核酸适配体的快速检测方法备受关注，已经实现对多种常见真菌毒素的快速和灵敏检测，包括黄曲霉毒素(aflatoxin，af，包括afm1、afb1、afb2)、赭曲霉毒素(ochratoxin，ota)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)、t-2毒素和伏马菌素(fumonisin，f，包括fb1、fb2)。
4.交链孢酚单甲醚(ame)和交链孢酚(aoh)是农作物中广泛存在的低含量真菌毒素，二者分子结构仅有一个甲基的区别。由于毒理学研究较少，欧洲食品安全局尚未设定每日安全限量。但是根据报道ame和aoh均具有诱变和致癌作用，还能诱导dna双链断裂。此外，ame与aoh共存时具有协同作用，能够明显增强毒性，因此需要分别测定ame和aoh的含量，以正确评估可能的危害性。在我们前期的专利申请(专利申请号：202110189036.9)中所提及的系列aoh核酸适配体(原长核酸适配体aoh 59、截短的核酸适配体aoh 6c和aoh 6c-5-7-l，以及二价和三价核酸适配体)均对ame具有高的交叉反应，因此无法用于对ame的特异性检测。目前也没有公开报道的对ame具有高特异性的核酸适配体。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明通过对aoh的核酸适配体aoh 6c进行工程化设计，获得了对ame特异的系列核酸适配体，对aoh具有低的交叉反应。其中代表性ame核酸适配体ame-1的解离常数为723
±
104nm。基于该核酸适配体所构建的倏逝波光纤传感器实现了对ame的超
灵敏和高特异性检测，对缓冲液中ame的检出限(s/n＝3)为7.36pm。对小麦萃取中标准添加的ame的检出限(s/n＝3)为0.820ng/g，与文献报道的酶联免疫检测试剂盒的灵敏度相当(food anal.methods 2017,11,1444-1450)。
6.本发明提供一种交链孢酚单甲醚(ame)的系列核酸适配体，其为通过对交链孢酚的核酸适配体aoh 6c进行工程化设计而获得的对ame特异的系列核酸适配体，仅对交链孢酚单甲醚(ame)具有高亲和力，对交链孢酚及常见真菌毒素棒曲霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀烯醇、黄曲霉毒素afb1、afb2、afg1、afg2均具有低交叉反应，系列ame核酸适配体的长度介于18-28个核苷酸之间。
7.进一步，上述交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体，其中，代表性ame核酸适配体ame-1的解离常数为723
±
104nm。
8.进一步，上述交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体，其中，碱基序列(5'-3')为tagctaactagtgttcagctg。
9.进一步，上述交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体，其中，碱基序列(5'-3')分别为：tagcttactagtgtcaagctg、tagctactagtgtcagctg、tagcttagctagtgctcaagctg、tagcgtaactagtgttcacgctg、tagcgtagctagtgctcacgctg、tagcttaacttttgttcaagctg、tgcgtagctagtgctcacgcg、gcgtagctagtgctcacgc、tcgcatctagctagtgctcagactgcgg和gcatctagctagtgctcagactgc。
10.本发明还提供一种倏逝波光纤生物传感器，其为应用前述的交链孢酚单甲醚的系列核酸适配体的倏逝波光纤生物传感器。
11.本发明的ame系列核酸适配体及其倏逝波传感器具有如下优势：
12.1)本发明获得的ame的系列核酸适配体的长度大幅小于通过selex技术分离获得的核酸适配体的长度(一般为60-150个核苷酸)。长度过长会导致合成成本高，探针设计困难，并且与传感器和其它应用兼容性差等问题。
13.2)本发明获得的系列ame核酸适配体均对aoh具有低的交叉反应。利用该核酸适配体能够实现对ame的特异性检测。
14.3)本发明利用代表性核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感器，检测过程极为简单和快速，且无需基于酶的反应，并具有与文献报道的基于酶联免疫(elisa)方法相当的灵敏度。
15.4)本发明利用代表性核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感器，对小麦萃取液中标准添加的ame的检测，无需样品富集纯化，大幅降低了检测成本，并将检测时间缩短至1小时(含样品前处理)。
附图说明
16.图1是本发明中工程化设计的各序列对ame的荧光响应图。
17.图2是本发明中荧光变化最大的三条序列对ame和aoh的选择性。
18.图3是本发明中测定代表性ame核酸适配体ame-1解离常数的结合曲线。
19.图4是本发明基于代表性ame核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感器的制备过程及检测原理图。
20.图5是本发明中利用基于代表性ame核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感
器对缓冲液中ame进行检测的工作曲线。
21.图6是本发明基于代表性ame核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感器对缓冲液中其它真菌毒素(交链孢酚(aoh)、棒曲霉素(patulin)、玉米赤霉烯酮(zen)、赭曲霉毒素(ota)、脱氧雪腐镰刀烯醇(don)、黄曲霉毒素(afb1、afb2、afg1、afg2))的选择性测试结果。
22.图7是本发明中利用基于代表性ame核酸适配体ame-1构建的倏逝波光纤生物传感器对小麦萃取液中标准添加的ame进行检测的工作曲线。
具体实施方式
23.表1本发明所使用的dna探针
[0024][0025]
实施例1.ame核酸适配体的工程化设计
[0026]
ame与aoh具有类似的化学结构，其差别仅在于ame的苯环上的有一个甲氧基，而对应位置上aoh为酚羟基。在我们前期的专利申请(专利申请号：202110189036.9)中所提及的aoh核酸适配体aoh 6c(表1)对ame具有高的交叉反应。基于aoh 6c通过增减碱基，我们设计了一系列序列ame-1到ame-11(表1)。
[0027]
实施例2.各工程化设计序列对ame的相对亲和力测试
[0028]
ame与aoh均在紫外光的照射下能够产生微弱的荧光，当其与核酸适配体结合之
后，410nm(纳米)处的荧光发射会显著增强。因此我们基于荧光增强的特性测定各工程化序列对ame的相对亲和力。
[0029]
首先用1
×
筛选缓冲溶液(0.9mm(毫摩尔每升)氯化钙、2.685mm氯化钾、1.47mm磷酸二氢钾、0.49mm氯化镁、137mm氯化钠、8.1mm磷酸氢二钠，ph 7.4)配置2μm(微摩尔每升)的ame溶液。接着用1
×
筛选缓冲溶液分别配置4μm各条工程化设计的序列(表1)。然后将上述配置好的ame溶液与含各序列的溶液按照体积比1:1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用荧光仪进行检测。荧光激发波长260nm，扫描范围300-480nm。
[0030]
实验结果如图1所示。把ame与aoh 6c结合之后产生的荧光信号作为100％，工程化设计得到的11条短链(ame-1到ame-11)与ame混合孵育后的相对荧光信号表明，所有11条序列对ame的亲和力均显著高于aoh 6c(130％-230％)，说明各工程化设计的序列对ame具有更高的亲和力。
[0031]
实施例2.优选的工程化设计序列对ame和aoh的相对亲和力测试
[0032]
ame-1、ame-4、ame-7是在实施例1测试中对ame具有最高荧光响应的序列。对这三条序列进行下面的选择性测试。首先用1
×
筛选缓冲溶液配置浓度为4μm的dna溶液(ame-1、ame-4、ame-7)。接着用1
×
筛选缓冲溶液分别配置2μm的交链孢酚单甲醚(ame)和交链孢酚(aoh)溶液。然后将上述配置好的dna溶液与各个靶标溶液按照体积比1:1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用荧光仪进行检测。荧光激发波长260nm，扫描范围300-480nm。
[0033]
实验结果如图2所示，在同等浓度下，含ame的样品的荧光强度是含aoh样品的4.105-4.490倍，说明这三条链均对ame的亲和力显著高于aoh，对ame具有高的特异性。
[0034]
实施例3.ame特异性核酸适配体ame-1的解离常数kd测定
[0035]
首先用1
×
筛选缓冲溶液配置浓度0.4μm的ame溶液。接着在1
×
筛选缓冲溶液中分别配置浓度为0、50nm、200nm、400nm、1000nm、2000nm和4000nm(纳摩尔每升)的ame-1溶液。然后将上述ame溶液与不同浓度的ame-1溶液按照体积比1:1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用荧光仪进行检测。荧光激发波长260nm，扫描范围300-480nm。以荧光强度为纵坐标y，以ame-1的浓度为横坐标x，绘制结合曲线，并通过假定1：1的结合模式(y＝bmax*x/(kd x))，经非线性拟合得到kd。
[0036]
结果如图3所示，ame-1的解离常数为723
±
104nm，具备中等的亲和力。
[0037]
实施例4.基于ame核酸适配体ame-1构建倏逝波光纤生物传感器的过程及检测ame的原理
[0038]
如图4所示，通过光纤表面的羟基化、硅烷化、偶联、还原和封闭等步骤将氨基修饰的核酸适配体nh
2-ame-1(表1)偶联在光纤表面。具体实验条件与我们前期申请的专利(pct/cn2020/079442)基本相同。首先将光纤放入30％的氢氟酸(hf)溶液中刻蚀2-3小时，直到光纤直径约为220微米(μm)，光纤的放入深度为3.5厘米。然后用超纯水清洗光纤至中性。接下来光纤依次经过1)表面羟基化、2)表面硅烷化、3)核酸适配体在光纤上的偶联、4)光纤表面的还原与封闭(根据靶标性质不同，封闭可以省略)，完成光纤的制备过程。具体操作条件如下。
[0039]
1)光纤表面的羟基化：首先将表面处理干净的光纤在体积比为3:1的浓硫酸：30％过氧化氢混合溶液中于100-120℃下浸泡1小时，然后将光纤从混合溶液中取出，用超纯水
洗到中性，氮气吹干，在70-90℃烘箱中放置4-6小时，取出后在干燥器中冷却至室温；
[0040]
2)光纤表面的硅烷化：将上述光纤放入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的无水甲苯溶液中，在室温下浸泡反应1-2小时，取出后分别用无水甲苯，甲苯-乙醇(v/v＝1:1),乙醇冲洗三遍，氮气吹干，在180℃烘箱中放置1小时，取出后在干燥器中冷却至室温；
[0041]
3)核酸适配体在光纤表面的偶联：将硅烷化后的光纤放入含有戊二醛的10毫摩尔每升的磷酸盐缓冲溶液中(pb)，于室温反应4小时。反应结束后用超纯水清洗三次，氮气吹干，将光纤放入氨基修饰的核酸适配体的溶液中，室温下浸泡反应6-8小时，随后用超纯水清洗三次；
[0042]
4)还原及封闭：将上述光纤放入硼氢化钠(nabh4)溶液中浸泡30分钟，用1％(v/v)吐温80溶液封闭光纤界面，随后用超纯水清洗三次，放入4℃冰箱储存。
[0043]
按照上述方法制备好的光纤装入光波导传感器的反应池中即可开始靶标的测试。传感器联机安装的荧光检测器将实时记录荧光信号的变化，用于靶标浓度的定量分析。每次测试完毕后，用0.5％的sds(ph＝1.9)冲洗光纤60秒进行传感界面的再生，再次用对应的检测缓冲溶液重洗光纤后进行下一个测试。
[0044]
实施例5.基于ame核酸适配体ame-1的倏逝波光纤生物传感器进行ame的超灵敏和高特异检测
[0045]
测试样品前，用浓度为1％(v/v)的吐温80对光纤进行封闭。在1
×
筛选缓冲液中配置不同终浓度的ame标准溶液(1fm(飞摩尔每升)、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm(皮摩尔每升)、1nm、10nm和100nm)。然后将ame标准溶液分别与50nm荧光基团cy 5.5标记的ame核酸适配体的互补链(c-ame-1-cy 5.5，表1)混合。经过以下三个步骤将混合物引入倏逝波光纤传感系统。(1)泵入1
×
筛选缓冲液30秒，清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)将ame和c-ame-1-cy 5.5的混合物在30秒内泵入光纤反应池并保持180秒，使c-ame-1-cy 5.5和ame与光纤表面的核酸适配体的结合达到竞争平衡，实时测定荧光信号；(3)通入洗涤缓冲液(0.5％sds,ph＝1.9)冲洗60秒，实现光纤表面上ame和c-ame-1-cy 5.5的解离。重复(1)-(3)，其中(2)中的靶标浓度依次升高。
[0046]
对缓冲液中ame的检测结果如图5所示，荧光信号下降百分比与ame浓度的对数呈线性关系。按照3倍信噪比计算得出的检出限为7.36pm，线性动力学区间1pm到10nm(y＝11.902x 147.155,r2＝0.998)。
[0047]
实施例6.基于ame核酸适配体ame-1的倏逝波光纤生物传感器的特异性测试
[0048]
在1
×
筛选缓冲液中配置100pm的各种其它靶标(交链孢酚aoh、棒曲霉素patulin、玉米赤霉烯酮zen、赭曲霉毒素ota、脱氧雪腐镰刀烯醇don、黄曲霉毒素afb1、afb2、afg1、afg2)的溶液。代替实施例5中的ame进行测试，测试步骤与实施例5相同。
[0049]
结果如图6所示，100pm的ame比10nm的其它毒素小分子的荧光信号降低的还要多，表明该传感器对ame具有高的特异性(》100倍)。
[0050]
实施例7.基于ame核酸适配体ame-1的倏逝波光纤生物传感器对小麦萃取液中标准添加的ame进行超灵敏检测
[0051]
小麦萃取液中加标ame的样品制备过程如下:取1g小麦粉，加入5ml乙腈-水(体积比为1:1)溶液，然后加入不同浓度ame混匀，其终浓度分别为100pm，1nm，10nm，100nm，1μm，10μm，100μm(微摩尔每升)，1mm(微摩尔每升)。将ame和面粉混合液震荡萃取30分钟，超声辅
助20分钟，之后离心10分钟(10000r/min(转/分))，取1ml上清液，过膜。加入49ml 1
×
筛选缓冲液稀释至50ml(此时ame终浓度为2pm，20pm，200pm，2nm，20nm，200nm，2μm，20μm)。检测过程与实施例5相同。
[0052]
结果如图7所示，荧光信号下降百分比与ame浓度的对数呈线性关系。检出限为602.56pm，按照实验样品配制方法计算相当于0.820ng/g，线性动力学区间为1nm到1μm(y＝14.62x 137.94，r2＝0.998)，与文献报道的基于酶联免疫(elisa)方法的检出限相当(food anal.methods 2017,11,1444-1450)。
[0053]
以上实施例只为说明本发明的技术构思和特点，目的在于让本领域的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此来限制本发明的保护范围，凡是根据本发明实质所作出的等效变化或修饰均属于本发明的保护范围。