GhELF3基因在调控植物开花时间中的应用

ghelf3基因在调控植物开花时间中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种ghelf3基因在调控植物开花时间中的应用。


背景技术：

2.棉花是一种重要的经济作物，其纤维作为重要的天然纤维，是纺织工业重要的原材料。棉花机械化程度低、生育期长，极大阻碍了棉花种植面积和纤维产量的提高。早熟棉生育期短、吐絮期集中的特性使其不仅可以在黄河流域和长江流域棉区种植进行早熟棉麦(油)后直播，还可以在无霜期短，积温不足的西北内陆棉区提高霜前花率。早熟棉新品种的培育有赖于调控棉花早熟性的关键基因的克隆和功能分析。
3.花芽分化早和开花早是决定早熟棉早熟的关键因素，花芽分化和开花受到多个途径的复杂调控，包括光周期途径、春化途径、赤霉素途径、年龄途径、自主途径等。季节性的日长变化(光周期)是调控植物开花时间的最为保守和重要的外界环境信号。内源生物钟和外源光信号共同参与了对光周期依赖的植物开花时间的调控。生物钟控制光周期途径中的关键调控基因在一天中的固定时间表达，这些基因的表达时相与外界光信号的同步关系最终影响了开花整合因子flowering locus t(ft)在叶片韧皮部的表达。
4.外界光信号对生物钟核心振荡器的输入使得受生物钟控制的内在生理过程与环境周期变化相同步，保证植物在适宜的时间开始生殖生长等发育阶段。在棉花中，光信号对生物钟的输入机制尚不清楚，鉴定出棉花中参与该机制的基因以及研究他们在调控棉花开花时间中的作用有助于早熟棉新品种的培育。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。
6.本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物开花时间、抽薹时间和/或莲座叶数量中的应用；
7.1)蛋白ghelf3；
8.2)编码蛋白ghelf3的核酸分子；
9.3)含有编码蛋白ghelf3的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；
10.所述蛋白ghelf3为如下(1)或(2)或(3)：
11.(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
12.(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；
13.(3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。
14.上述应用中，所述编码蛋白ghelf3的核酸分子是如下1)-3)中任一种的dna分子：
15.1)编码区为序列表中序列1所示的dna分子；
16.2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
17.3)与1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
18.上述应用中，所述调控植物开花时间为延长植物开花时间；
19.所述调控植物抽薹时间为延长植物抽薹时间；
20.所述调控植物莲座叶数量为增加植物莲座叶数量。
21.上述物质在培育晚熟植物中的应用也是本发明保护的范围；晚熟植物具体表型：晚花、晚抽薹和/或莲座叶数量的植物。
22.或，上述物质在培育晚花植物、晚抽薹植物或莲座叶数量增加的植物中的应用也是本发明保护的范围。
23.上述物质在培养开花时间延长、抽薹时间延长和/或莲座叶数量增加的植物中的应用也是本发明保护的范围。
24.本发明另一个目的是提供一种培育开花时间延长、抽薹时间延长和/或莲座叶数量增加的转基因植物的方法。
25.本发明提供的方法为如下1)或2)：
26.1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中蛋白ghelf3的含量和/或活性，得到转基因植物；
27.2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白ghelf3的核酸分子的表达，得到转基因植物；
28.所述转基因植物的开花时间晚于所述目的植物；
29.或，所述转基因植物的抽薹时间晚于所述目的植物；
30.或，所述转基因植物的莲座叶数量多于所述目的植物；
31.所述蛋白ghelf3为如下(1)或(2)或(3)：
32.(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
33.(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；
34.(3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。
35.上述方法中，所述提高目的植物中蛋白ghelf3的含量和/或活性，或，所述提高目的植物中编码蛋白ghelf3的核酸分子的表达，均是将所述编码蛋白ghelf3的核酸分子导入所述目的植物中。
36.上述中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
37.本研究从陆地棉中克隆出棉花生物钟基因ghelf3，其与拟南芥atelf3为直系同源基因，ghelf3在一天之内表现出振荡表达模式，并且在晚开花棉花品种中的表达量显著高于在早开花棉花品种中的表达量；构建该基因的过表达载体，蘸花法转化拟南芥，发现过表达ghelf3的转基因拟南芥的开花时间明显晚于野生型拟南芥。
附图说明
38.图1为ghelf3在中棉所50(ccri50)和国欣11(gx11)中的昼夜表达模式。
39.图2为ghelf3的pcr扩增产物。
40.图3为35s::ghelf3阳性植株pcr鉴定。
41.图4为野生型拟南芥(wt)和3个35s::ghelf3过表达株系的表型观察和数据统计。
具体实施方式
42.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
43.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.本实验选取的棉花材料为陆地棉品种tm-1、中棉所50、国欣11(记载在如下文献中：genomic analyses reveal the genetic basis of early maturity andidentification of loci and candidate genes in upland cotton(gossypium hirsutum l.)，plant biotechnology journal，2020，19(1)，109-123)，种植于中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室的植物光照培养室(16小时光照/8小时黑暗，25℃)。
45.下述实施例中试剂与耗材如下：
46.1、酶及试剂盒：gxl dna polymerase高保真酶、胶回收试剂盒购自takara公司；rna反转录试剂盒、kod fx neo酶(code.no.kfx-201)购自toyobo公司；ultra one step cloning kit试剂盒购自vazyme公司；质粒少量提取试剂盒购自magen公司；限制性内切酶(xba i、sac i)购自neb公司；dna marker、植物总rna提取试剂盒购自tiangen公司；荧光定量transstart top green qpcr supermix购自transgen公司。
47.2、其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、蔗糖、silwet l-77、间苯三酚等为国产分析纯，卡纳霉素、硫酸链霉素、氨苄青霉素等购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态细胞trans5α购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌感受态细胞lba4404购自上海唯地生物技术有限公司。
48.3、培养基：lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉(agar)15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。本文中提到的但未列出的各种试剂溶液均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。
49.4、主要仪器：pcr扩增仪(eppendorf)、高速离心机(eppendorf 5427r)、电泳设备(北京六一)、凝胶成像系统(bio-rad)、荧光定量pcr仪(abi7500)、荧光显微镜(olympus bx43)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)等。
50.实施例1、ghelf3基因的发现和克隆
51.一、ghelf3在不同开花时间陆地棉品种中的昼夜表达模式分析
52.1、采集样品
53.试验材料陆地棉早开花品种中棉所50(ccri50)和晚开花品种国欣11种植于棉花生物学国家重点实验室的植物光照培养室(16小时光照/8小时黑暗，25℃)。所取样品为第5真叶展平期24小时内每隔4小时的叶片，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。
54.2、荧光定量检测
55.取上述不同材料的叶片样品，使用tiangen公司试剂盒提取样品总rna，使用toyobo的反转录试剂盒fsq-201反转录总rna获得cdna，对不同材料中的ghelf3基因进行荧光定量来测定其表达量。
56.(1)rna的提取步骤为：
57.1)匀浆处理：取适量纤维样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μlsl(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀；
58.2)12,000rpm离心2min；
59.3)将上清液转移至过滤柱cs上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片；
60.4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱cr3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
61.5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
62.6)dnasei工作液：取10μldnasei储存液和70μlrdd溶液轻柔混匀；
63.7)向cr3中加入80μl的dnasei工作液，室温静止15min；
64.8)静置完后，向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
65.9)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；
66.10)重复步骤9；
67.11)12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，得到rna溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna样品请在-70℃中保存。如果预期rna得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的rna溶液再加入吸附柱cr3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，得到rna溶液。
68.(2)cdna的合成。将500ng rna反转录为cdna，采用toyobo的反转录试剂盒fsq-201，反转录体系为：
69.按下列组份配制rt反应液(反应液配制在冰上进行)：
70.表1为反转录体系
[0071][0072]
反转录反应条件如下：
[0073]
37℃15min(反转录反应)，
[0074]
98℃5s(反转录酶的失活反应)；
[0075]
(3)实时荧光定量pcr。将反转录产物cdna溶液稀释4倍作为qrt-pcr反应模板。
[0076]
用ghactin作为内参基因，根据cottongen上ghelf3和ghactin的参考cds序列设计荧光定量pcr的引物如下：
[0077]
表2荧光定量pcr引物
[0078][0079][0080]
冰上配制qrt-pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应。
[0081]
qrt-pcr反应体系为：
[0082]
表3为荧光定量pcr反应体系
[0083][0084]
qrt-pcr反应程序：
[0085]
表4为荧光定量pcr反应程序
[0086][0087]
qrt-pcr的结果如图1所示，可以看出，ghelf3在一天之内表现出振荡表达模式，并且晚开花品种gx11中ghelf3的表达量显著高于早开花品种中棉所50中ghelf3的表达量，说明ghelf3可能是一个具有抑制棉花开花作用的生物钟基因。
[0088]
二、棉花ghelf3基因的克隆
[0089]
根据cottongen上ghelf3的参考cds序列设计基因克隆引物，
[0090]
引物序列：
[0091]
ghelf3-oe-f:5
′‑
cacgggggactctagaatgaagagaggaaaagatgat-3
′
[0092]
ghelf3-oe-r:5
′‑
gatcggggaaattcgagctctcatcttagtcccgttgctc-3
′
[0093]
具体克隆基因的过程为：
[0094]
(1)试验材料陆地棉品种tm-1种植于棉花生物学国家重点实验室的植物光照培养室(16小时光照/8小时黑暗，25℃)。所取样品为第5真叶展平期的叶片，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。使用tiangen公司试剂盒提取样品总rna，使用toyobo的反转录试剂盒fsq-201反转录总rna获得cdna。
[0095]
(2)pcr扩增目的基因
[0096]
将上述反转录产物cdna溶液稀释4倍作为pcr反应模板。在冰上配制以下体系，根据takara gxl dna polymerase高保真酶说明书，pcr反应体系如下：
[0097]
表5为gxl高保真酶pcr扩增反应体系
[0098][0099]
pcr扩增程序为：
[0100]
表6为高保真酶pcr扩增程序
[0101][0102]
反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测。
[0103]
结果如图2所示，m泳道为marker，第1、2、3泳道为ghelf3的pcr目的片段，可以看出，得到大小为2160bp的条带，符合预期。
[0104]
将上述pcr产物送去测序，结果该pcr产物具有序列表中序列1所示的ghelf3基因。ghelf3蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。其开放阅读框为2121bp，编码706个氨基酸，蛋
白的相对分子量为76.36kda，等电点为8.84。
[0105]
实施例2、ghelf3基因在促进植物开花中的应用
[0106]
一、重组载体的制备
[0107]
将实施例1的pcr产物使用ultra one step cloning kit试剂盒连接到xbai和saci双酶切后的pbi121载体(武汉淼灵生物科技有限公司p0274)，得到重组载体pbi121-ghelf3。
[0108]
重组载体pbi121-ghelf3为将序列表中序列1所示的ghelf3基因替换pbi121载体的xbai和saci酶切位点间的片段，得到的载体。
[0109]
二、重组菌的制备
[0110]
利用冻融法转化根癌农杆菌lba4404感受态细胞，具体转化过程如下：
[0111]
(1)向上海唯地生物的根癌农杆菌lba4404感受态细胞100μl中加入上述一制备的重组载体pbi121-ghelf3 1μg(2-10μl)，混匀后冰浴30min；液氮速冻2-3min，37℃热激90s；
[0112]
(2)冰浴5min，再加入800μl lb液体培养基；
[0113]
(3)190rpm，28℃，培养4h后,4000rpm离心5分钟，吸去上清液至剩余400-500μl，反复吸打混匀后取200μl菌液涂在含有卡那霉素、硫酸链霉素和利福平的三抗筛选培养基上，28℃培养大约36-48h，抗性菌落可见；
[0114]
(4)挑取单菌落在1ml的含有三抗的lb液体培养基中培养16h左右，直至浑浊；
[0115]
(5)菌落pcr(引物为ghelf3-oe-f和ghelf3-oe-r，得到2160bp的为阳性)和酶切(采用xbai和saci双酶切，得到2130bp的为阳性)鉴定，筛选出阳性农杆菌株，20％甘油菌液于-80℃保存。
[0116]
阳性农杆菌株命名为重组菌lba4404/pbi121-ghelf3。
[0117]
三、转ghelf3拟南芥
[0118]
1、采用花序浸染法转化拟南芥
[0119]
(1)将-80℃保存的重组菌lba4404/pbi121-ghelf3菌液20μl接种到1ml lb液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到20ml lb液体培养基28℃、180rpm振荡培养；
[0120]
(2)待菌液od值约为1.2-1.6时，3000rpm离心菌液收集菌体；
[0121]
(3)转化介质配方为：5％蔗糖，0.03％silwet l-77(steven j,1998)；
[0122]
(4)用上述转化介质悬浮菌体，调od
600
＝0.8开始浸染；
[0123]
(5)将野生型拟南芥col-0(北京华越洋生物科技有限公司nrr00220)花序置于转化介质中30-50s,浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24h后置于正常条件下培养，待成熟后收获种子。
[0124]
2、转基因拟南芥植株的鉴定与检测
[0125]
1)抗性筛选
[0126]
将上述1收获的种子后用0.1％hgcl溶液对种子进行消毒，然后在4℃条件下纯化4天后，种植于含卡那霉素的1/2ms上(琼脂浓度0.6％)，10天左右会观察到阳性、阴性植株区别，能够正常生长的可能为阳性株，移栽能够正常生长的拟南芥到培养室，为抗性阳性植株。
[0127]
2)分子鉴定
[0128]
对于转基因植株筛选所用的酶为kod fx neo的pcr酶，该酶的最大特点是不用提取抗性阳性植株的dna，可以直接用活体叶片进行pcr。鉴定时用ghelf3的农杆菌菌液lba4404/pbi121-ghelf3作为阳性对照，野生型拟南芥为阴性对照。检测时所用引物为：
[0129]
上游引物f1 5
’‑
gacgcacaatcccactatcc-3’[0130]
下游引物r1 5
’‑
ctcatcttagtcccgttgctc-3’[0131]
pcr的反应体系：
[0132]
表7为kod fx neo酶pcr扩增反应体系
[0133]
试剂名称试剂用量2
×
pcr buffer for kod fx neo25μl2mm dntps10μlf1(10μm)1μlr1(10μm)1μlkod fx neo(1u/μl)1μl2mm正方形叶片适量灭菌蒸馏水up to 50μl
[0134]
pcr的扩增程序：
[0135]
表8为kod fx neo酶pcr扩增程序
[0136][0137]
将上述1)鉴定的抗性阳性株叶片作为模板，用上游引物f1和下游引物r1进行pcr扩增。
[0138]
分别取适量扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果如图3所示，m泳道为marker，1-3泳道为抗性阳性株，4、5泳道为阳性对照(pbi121-ghelf3质粒)和阴性对照(野生型拟南芥)，可以看出，抗性阳性株可以得到约2270bp的条带，说明ghelf3基因已整合到拟南芥基因组中。
[0139]
上述分子鉴定得到2270bp条带的株系命名为t0代35s::ghelf3阳性株系，共3个，收获t1代种子。
[0140]
3、35s::ghelf3阳性株系鉴定
[0141]
1)表型鉴定
[0142]
将收获的t1代35s::ghelf3种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2ms上，进行4℃春化3天后，转移到人工气候培养箱中，10天左右阳性植株生长正常，而阴性植株子叶变黄，不再生长。
[0143]
2)pcr鉴定
[0144]
将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取叶片dna再用pcr进
行检测。
[0145]
方法与上述2中的分子鉴定一致，得到2270bp的条带的为阳性t1代35s::ghelf3。
[0146]
3)纯合转基因拟南芥株系
[0147]
将阳性t1代35s::ghelf3收获种子，重复上述步骤，直至繁殖至t3代，每一代的植株都要进行上述表型鉴定和pcr鉴定，得到阳性t3代35s::ghelf3，即为纯合转基因拟南芥株系。
[0148]
四、转ghelf3植株的表型观察
[0149]
将阳性t3代35s::ghelf3种子播种，种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2ms上，统计开花时间和抽薹时间。以野生型拟南芥为对照。每个株系24个种子，结果取平均值。
[0150]
在播种后28天观察不同各株系表型，结果如图4a所示，ghelf3-oe line1、ghelf3-oe line2、ghelf3-oe line3分别为阳性t3代35s::ghelf3不同植株，wt为野生型拟南芥，可以看出，播种后28天，三个阳性t3代35s::ghelf3株系正在抽薹时，wt已经开花。
[0151]
统计不同各株系抽薹时间，结果如图4b所示，line1、line2、line3分别为阳性t3代35s::ghelf3不同植株，wt为野生型拟南芥，可以看出，35s::ghelf3过表达株系比野生型拟南芥有更晚的抽薹时间；
[0152]
统计不同各株系的开花时间，结果如图4d所示，line1、line2、line3分别为阳性t3代35s::ghelf3不同植株，wt为野生型拟南芥，可以看出，35s::ghelf3过表达株系比野生型拟南芥平均晚开花4-4.9天。
[0153]
播种后32天统计不同各株系的莲座叶数量，结果如图4c所示，line1、line2、line3分别为阳性t3代35s::ghelf3不同植株，wt为野生型拟南芥，可以看出，35s::ghelf3过表达株系比野生型拟南芥有更多的莲座叶数量。
[0154]
因此，上述结果表明，ghelf3具有延迟拟南芥抽薹和/或开花的作用。