可制备双交联纤维蛋白粘合剂的原料组合物及方法

1.本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及用于意外创伤或手术出血止血的双交联纤维蛋白粘合剂制备的原料组合物及制备方法。


背景技术：

2.创伤后或手术期间发生的无法控制的出血是全球死亡的主要原因，每年造成超过200万人死亡。手术和创伤环境中不受控制的出血通常会致并发症和不良的结果。因此，控制出血量是降低并发症和死亡率、改善患者预后的重要措施。
3.目前已经开发了一些局部止血材料来辅助控制手术过程中的出血。市面上常用的外科手术密封剂包括纤维蛋白胶和合成组织粘合剂。纤维蛋白胶是最广泛使用的止血剂，具有较好的生物相容性，可辅助各种外科手术中的止血，模拟凝血级联反应，在出血部位原位形成纤维蛋白凝块，封堵出血。然而纤维蛋白胶的黏附强度会受到持续的组织张力和血液的影响而下降，易被血流冲走，不利于发挥其止血性能，且因在湿态组织上的粘附差而限制了其止血效果。另一方面，合成的组织粘合剂如氰基丙烯酸酯粘合剂，尽管具有较好的粘合能力，但因其高细胞毒性和难去除性而限制了其应用。
4.为了突破当前生物黏合剂在潮湿组织表面低粘附的应用瓶颈。现有技术中，有研究采用甲基丙烯酰化明胶作为止血凝胶材料，这类双键改性的明胶通过甲基丙烯酸酐将明胶的游离氨基官能化为甲基丙烯酰胺基团而获得，在特定波长的光照条件下，材料中的光引发剂吸收光能产生自由基，进而使甲基丙烯酰化明胶分子间成键形成固相凝胶。甲基丙烯酰化明胶具有良好的生物相容性，同时兼具较好的机械性能和粘附力。但甲基丙烯酰化明胶不具有促凝血功能，一定程度上限制了其止血能力；甲基丙烯酰化明胶的光固化时间为5～10秒，光固化时间长，光固化过程中易被血流冲走；在严重出血中，大量的血液削弱了其粘附能力。为了弥补该缺陷，luo等人的研究将具有凝血功能的蛇毒血凝酶引入甲基丙烯酰化明胶，构建的止血胶提高了止血效果(guo y,wang y,zhao x,et al.snake extract-laden hemostatic bioadhesive gel cross-linked by visible light.sci adv.2021.7(29).)。但该研究构建的承载蛇毒血凝酶的甲基丙烯酰化明胶，只有在凝胶表面的极少量的蛇毒血凝酶才能与血液接触，且血液中纤维蛋白原的浓度低(2～4g/l)，形成的纤维蛋白交联不足以封堵伤口；同时在甲基丙烯酰化明胶完成光固化之前，其对伤口的封堵效果较弱，这些均很大程度上限制了其止血效果。wang等人于2020年构建了针对糖尿病伤口多阶段愈合的凝血酶-甲基丙烯酰化明胶水凝胶，通过将游离凝血酶和负载凝血酶的脂质体掺入到甲基丙烯酰化明胶中，以实现最初的凝血酶释放来促进止血和持续的凝血酶释放来调节糖尿病伤口后期愈合(chongyang w,tianyi w,guangwang l,et al.promoting coagulation and activating smad3 phosphorylation in wound healing via a dual-release thrombin-hydrogel.chemical engineering journal.2020.397(c).)。该研究构建凝胶的缺点与luo等人的研究类似，凝胶释放出的凝血酶量少，且与血液中纤维蛋白原的接触少，无法形成纤维蛋白交联，因对伤口的封堵作用弱而降低了止血效果。
5.此外，现有技术中还有采用其他光固化材料制备止血材料的报道，例如，中国专利文献cn 111116973a公开了一种具有主动止血功能的聚乙烯醇止血多孔材料，通过将壳聚糖或(和)凝血酶等这些具有主动止血功能的聚合物添加到改性聚乙烯醇经光催化交联得到的海绵里，赋予海绵主动止血的功效。但是该论文中报道的止血时间为90s～100s，止血时间长，这必然致止血效果差。这是因为，1)预先形成的海绵无法与湿组织充分接触，致封堵效果差于原位形成的凝胶；2)干态状态下海绵中的凝血酶不易游离，从而限制其促凝血功能；3)血液中的纤维蛋白原浓度低(2～4g/l)，形成的纤维蛋白交联不足以封堵伤口。因此难以满足手术中大量出血时的快速止血需求；且在面对脏器或身体表面的伤口出血时，其膨胀压迫伤口的作用效果被局限，一定程度上削弱了止血效果；同时在去除该海绵时，可因其粘连在止血部位而对伤口造成二次损伤。
6.理想的止血材料应该不依赖于机体凝血机制，甚至当机体凝血障碍时亦可发挥止血作用，同时兼具较好的湿润组织粘附能力和理想的凝血止血速度。因此，发明一种新的方法，能制备出一种可以解决现有止血材料所存在的湿态组织黏附差和止血效果局限的新型止血材料显得尤为重要。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中存在的上述缺点，本发明的首要目的在于：提供一种可制备快速止血、快速凝胶化、具有高粘附性的粘合剂的原料，及利用所述原料制备快速止血用粘合剂的方法，以期用于外伤或手术创口的快速止血。
8.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种用于制备双交联纤维蛋白粘合剂的原料组合物，包括组合物a和组合物b；按重量份计，所述的组合物a包括10～200份光敏材料、1～3份光引发剂、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的组合物b包括5～100份光敏材料、1～2份光引发剂和30～50份纤维蛋白原；所述的组合物a与所述的组合物b质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。
10.本发明优选的方案中，所述的组合物a中光敏材料重量份大于组合物b中光敏材料重量份。所述的组合物a与组合物b光敏材料的重量份，有利于组合物a中酶与组合物b中纤维蛋白原进行酶反应，形成稳定的纤维蛋白网络结构。
11.本发明所述的原料组合物中，所述的纤维蛋白原可以在所述酶的作用下通过酶交联反应形成纤维蛋白网络，所述的光敏材料可以在所述光引发剂作用下通过光交联反应形成光敏凝胶。因此，将本发明所述原料组合物中的组合物a和组合物b按所述质量比混合后，通过光照，即可以制备得到一种双交联纤维蛋白粘合剂。该粘合剂是一种固态水凝胶，其结构中会同时存在三维立体的纤维蛋白网络和三维立体的光敏凝胶网络；每个所述的光敏凝胶网络孔道内部都有一组所述的纤维蛋白网络，且每一组所述的纤维蛋白网络整体具有连续性；整体上，所述的三维立体的纤维蛋白网络无序地遍布所述固态水凝胶表面和内部。这种固态水凝胶形成于正在出血的伤口部位时，可瞬间(1s左右)在伤口表面形成纤维蛋白凝块，起到初步封堵伤口的作用，阻挡血液流出；同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化为凝块，起到高效促凝血功能；进一步的，光激发下，光敏材料在5～10s内能够形成光固化凝胶；光固化凝胶具有较强的粘附力，可以抵挡血流的冲击并保护纤维蛋白交
联免被血液冲走。总之，本发明所述的原料组合物中，所述的组合物a和组合物b混合后可瞬间先形成纤维蛋白网络以起到支架作用，稍后光敏凝胶也会迅速形成，后面形成的光敏凝胶包裹在纤维蛋白网络中的纤维上。
12.本发明通过实验发现，所述的原料组合物中，所述的组合物a与组合物b的质量比与双交联纤维蛋白粘合剂的初步封堵伤口效果和粘附强度有关：当组合物a与组合物b质量比在1.4:10～1.4:1的范围内时，随着组合物a的比例升高，双交联纤维蛋白粘合剂的促凝血功能提高，初步封堵伤口效果升高，且粘附强度增大；当组合物a与组合物b质量比在1.4:1～14:1的范围内时，随着组合物a的比例升高，双交联纤维蛋白粘合剂的促凝血功能、初步封堵伤口效果及粘附强度并未进一步升高。这意味着当组合物a与组合物b质量比为1.4:1时，可取得最佳止血效果，并达到材料最佳利用率。该比例下，交联产生的两种网络的体积比可以达到1:1左右，能够为制得的凝胶带来最优的促凝血功能和粘附强度。
13.本发明优选的所述原料组合物中，按重量份计，所述的组合物a包括80～200份光敏材料、1～3份光引发剂、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的组合物b包括30～100份光敏材料、1～2份光引发剂和30～50份纤维蛋白原。
14.本发明更优选的所述原料组合物中，按重量份计，所述的组合物a包括100～200份光敏材料、1～3份光引发剂、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的组合物b包括30～50份光敏材料、1～2份光引发剂和30～50份纤维蛋白原。
15.本发明最优选的所述原料组合物中，按重量份计，所述的组合物a包括100～150份光敏材料、1～3份光引发剂、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的组合物b包括30～50份光敏材料、1～2份光引发剂和30～50份纤维蛋白原。
16.本发明所述的原料组合物中，所述的光敏材料是光敏性的生物水凝胶材料，可以是现有的多种可发生光固化的高分子材料；所述的光引发剂是在特定波长的光照条件下，吸收光能后可产生自由基的物质。所述的光引发剂吸收光能后可产生自由基，可使所述的光敏材料分子间成键，因此快速形成固相凝胶。理想的光敏材料应具有良好的生物相容性和可降解性，同时兼具较好的机械性能和粘附性能。
17.本发明优选的原料组合物中，所述的光敏材料可以是甲基丙烯酰化的高分子聚合物或其衍生物、聚丙烯酸酯类的高分子聚合物或其衍生物、或包含它们的高分子复合材料体系。
18.进一步地，以上所述的甲基丙烯酰化的高分子聚合物或其衍生物可以选自以下任意一种或两种以上的混合物：甲基丙烯酰化明胶或其衍生物、甲基丙烯酰化透明质酸或其衍生物、甲基丙烯酰化海藻酸钠或其衍生物、甲基丙烯酰化丝素蛋白或其衍生物、甲基丙烯酰化壳聚糖或其衍生物、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖或其衍生物。以上所述的聚丙烯酸酯类的高分子聚合物或其衍生物可以选自聚醚二丙烯酸酯或其衍生物、或聚乙二醇二丙烯酸酯或其衍生物。本发明最优选的光敏材料是甲基丙烯酰化明胶或其衍生物、或甲基丙烯酰化丝素蛋白或其衍生物。
19.进一步地，以上所述的甲基丙烯酰化的高分子聚合物的衍生物包括对其一种或多种官能团修饰后的聚合物。所述的甲基丙烯酰化明胶的可修饰官能团包括氨基、羧基、巯基、羟基或胍基中的任意一种或两种以上；所述的甲基丙烯酰化透明质酸的衍生物包括对其一种或多种官能团修饰后的聚合物，其中可修饰官能团包括羟基、羧基、乙酰氨基或羟甲
基中的任意一种或两种以上；所述的甲基丙烯酰化海藻酸钠的衍生物包括对其一种或多种官能团修饰后的聚合物，其中可修饰官能团包括羧基、羟基中的任意一种或两种；所述的甲基丙烯酰化丝素蛋白的衍生物包括对其一种或多种官能团修饰后的聚合物，其中可修饰官能团包括氨基、羧基、巯基、羟基或胍基中的任意一种或两种以上；所述的甲基丙烯酰化壳聚糖的衍生物包括对其一种或多种官能团修饰后的聚合物或发生多种化学反应后的聚合物，其中可修饰官能团包括氨基或羟基中的任意一种或两种，可发生的多种化学反应包括烷基化、酰基化、羧甲基化、水解、氧化、还原化学反应中的任意一种或两种以上。
20.以上所述的甲基丙烯酰化的高分子聚合物或其衍生物的分子量范围为5～400kda，以上所述的聚丙烯酸酯类的高分子聚合物或其衍生物的分子量范围为700～1000kda。
21.进一步地，以上所述的包含甲基丙烯酰化的高分子聚合物或其衍生物的高分子复合材料体系包括：甲基丙烯酰化明胶-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化明胶-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化明胶-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化明胶-纤维素体系、甲基丙烯酰化透明质酸-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化透明质酸-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化透明质酸-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化透明质酸-纤维素体系、甲基丙烯酰化海藻酸钠-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化海藻酸钠-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化海藻酸钠-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化海藻酸钠-纤维素体系、甲基丙烯酰化丝素蛋白-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化丝素蛋白-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化丝素蛋白-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化丝素蛋白-纤维素体系、甲基丙烯酰化壳聚糖-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化壳聚糖-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化壳聚糖-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化壳聚糖-纤维素体系、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖-聚乙烯醇体系、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖-聚氨酯体系、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖-聚乳酸体系、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖-纤维素体系中的任意一种或两种以上。
22.本发明优选的所述原料组合物中，所述的光引发剂可选自以下任意一种或两种以上的组合物：苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸乙酯、2-甲基-1-[4-甲硫基苯基]-2-吗啉基-1-丙酮、邻苯甲酰苯甲酸甲酯、2-苯基苄-2-二甲基胺-1-(4-吗啉苄苯基)丁酮或2,2-偶氮(2-甲基-n-(2-羟基乙基)丙酰胺)；最优选苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
[0023]
本发明优选的原料组合物中，所述的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。
[0024]
本发明优选的原料组合物中，所述的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。
[0025]
本发明优选的所述的原料组合物中，所述的水溶性无机钙盐优选氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。
[0026]
本发明所述的原料组合物，可以是制药或临床上可接受的多种具体形式，例如可以是冻干粉剂、注射剂、海绵或颗粒。
[0027]
第二方面，本发明还提供制备所述的原料组合物的方法，包括：制备溶剂中溶解有光敏材料和光引发剂的混合溶液，将所述的混合溶液与含有凝血酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，控制所述第一前体溶液中光敏材料、光引发剂、酶和钙离子的浓度比为10～200:1～3:0.14～0.28:1.11～8.88；将所述的混合溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得
到第二前体溶液，控制所述第二前体溶液中光敏材料、光引发剂和纤维蛋白原的浓度比为5～100:1～2:30～50；由此可得到一种包含第一前体溶液和第二前体溶液的液体原料组合物；还可以将所述的液体原料组合物进一步按照常规方法处理得到固态的原料组合物，例如冻干粉剂、海绵或颗粒。
[0028]
本发明所述的制备方法中，为了保持第一前体溶液中光敏材料的活性，控制第一前体溶液在室温环境中放置的时间少于30分钟。
[0029]
本发明所述的制备方法中，为了兼顾纤维蛋白原分散的均匀性和光敏材料完成光交联的速度，优选控制所述第一前体溶液中的光敏材料浓度大于0.5％(w/v)，且所述第二前体溶液中的光敏材料浓度低于所述第一前体溶液中的光敏材料浓度。由此，纤维蛋白原溶液在光敏材料浓度相对较低的第二前体溶液中更容易实现均匀分散，在两种前体溶液混合后能够迅速充分地接触到酶，瞬间发生完全地酶交联形成均匀分布的纤维蛋白网络；同时第一前体溶液中较高的光敏材料浓度又可以提升两种前体溶液混合后的整体光敏材料浓度，使其达到较理想的胶凝所需浓度，有利于缩短光交联时间、增加凝胶粘附力和强度。
[0030]
本发明所述的制备方法中，所述第一前体溶液和第二前体溶液制备时，优选控制所述混合溶液的温度不高于37℃。
[0031]
本发明进一步优选的一种制备所述的原料组合物注射剂的方法，具体包括以下步骤：
[0032]
1)制备溶剂中溶解有光敏材料和光引发剂的第一混合溶液，控制其中光敏材料和光引发剂的浓度比为10～200:1～3，且光敏材料的浓度在0.5％～30％(w/v)；
[0033]
2)制备溶剂中溶解有光敏材料和光引发剂的第二混合溶液，控制其中光敏材料和光引发剂的浓度比为5～100:1～2，且光敏材料的浓度低于1)所述的第一混合溶液；
[0034]
3)将1)制备的第一混合溶液与含有酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，控制其中光敏材料、光引发剂、酶和钙离子的浓度比为10～200:1～3:0.14～0.28:1.11～8.88；
[0035]
4)将2)制备的第二混合溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得到第二前体溶液，控制其中光敏材料、光引发剂和纤维蛋白原的浓度比为5～100:1～2:30～50。
[0036]
本发明所述的制备方法中，所述的含有酶和钙离子的溶液，优选按照以下方法制备：将溶剂和水溶性无机钙盐溶液加入酶中，完全溶解后得到含ca
2
的酶溶液，控制所得溶液中酶活力为500iu～2000iu/ml、ca
2
浓度为60～100mmol/l。
[0037]
本发明所述的制备方法中，所述的含有纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白原的浓度优选为5％～10％(w/v)。
[0038]
本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中光敏材料浓度在1％～30％(w/v)，进一步优选在8％～30％(w/v)，更优选10％-20％。
[0039]
本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中酶活力不低于200iu/ml，优选不低于500iu/ml；更优选不低于1000iu/ml。
[0040]
本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中钙离子浓度不低于20mmol/l，优选不低于30mmol/l，更优选不低于40mmol/l。
[0041]
本发明优选的制备方法中，控制所述的第二前体溶液中光敏材料浓度不低于0.5％(w/v)且不高于所述的第一前体溶液中光敏材料浓度，进一步优选不低于1％(w/v)且
不高于所述的第一前体溶液中光敏材料浓度，更优选1％-10％(w/v)且不高于所述的第一前体溶液中光敏材料浓度。
[0042]
本发明优选的制备方法中，控制所述的第二前体溶液中纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，更优选3％-5％(w/v)。
[0043]
第三方面，本发明还提供一种利用本发明所述原料组合物在出血伤口制备快速止血用粘合剂的方法，包括：将所述的原料组合物中的组合物a和组合物b分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血部位，并用290～480nm波段的光照射10～60s，可在出血部位原位快速形成固态水凝胶。
[0044]
所述的出血伤口包括由于意外创伤导致或手术中发生的器官出血；所述的器官可以是肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、心脏或皮肤。
[0045]
相对于现有技术，本发明所述的原料组合物的优点在于：混合后可完成快速凝胶化、固化速度快、强湿组织粘附力、止血效果佳：
[0046]
(1)本发明的原料组合物混合后可即刻(1s左右)发生纤维蛋白交联，起到初步封堵作用，阻挡血流冲击。
[0047]
(2)本发明的原料组合物中的酶可将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白交联，具有高效促凝血能力。
[0048]
(3)本发明的原料组合物混合后在紫外光或可见光激发下，可在5-10秒内发生光交联反应，形成光固化凝胶，提供强湿组织粘附力，可保护纤维蛋白交联免被血流冲走；
[0049]
正是由于本发明提供的原料组合物具有很好的促凝血功能、固化速度、湿组织粘附力和快速止血效果，因此可用于意外创伤或手术中的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胃肠和皮肤出血的止血应用。
附图说明
[0050]
图1是对比例1的纤维蛋白交联的sem图。
[0051]
图2是对比例2的前体溶液甲基丙烯酰化明胶光交联的sem图。
[0052]
图3是实施例1方法制备的双交联纤维蛋白粘合剂的sem图。
[0053]
图4体现了实施例4及对比例1～6在止血时间上的比较。
[0054]
图5体现了实施例4及对比例1～6在失血量上的比较。
具体实施方式
[0055]
下面结合具体实施例对本发明要解决的技术问题、技术方案和有益效果进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前体下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0056]
本发明提供一种用于制备双交联纤维蛋白粘合剂的原料组合物，包括组合物a和组合物b；按重量份计，所述的组合物a包括10～200份光敏材料、1～3份光引发剂、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的组合物b包括5～100份光敏材料、1～2份光引发剂和30～50份纤维蛋白原；所述的组合物a与所述的组合物b质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。
[0057]
本发明所述的原料组合物中，所述的光敏材料可以在所述光引发剂作用下通过光交联反应形成光敏凝胶，所述的纤维蛋白原可以在所述酶的作用下通过酶交联反应形成纤维蛋白网络。
[0058]
所述的双交联纤维蛋白粘合剂原料组合物可按照以下方法制备得到：
[0059]
(1)组合物a溶液的制备：将含钙离子的酶溶液加入溶解有光敏材料和光引发剂的混合溶液中，均匀混合后，得到组合物a溶液，包含光敏材料、光引发剂和酶；控制所得组合物a溶液中光敏材料浓度不低于1％(w/v)，优选不低于3％(w/v)，更优选3％-20％(w/v)；同时控制酶活力不低于200iu/ml，优选不低于500iu/ml，更优选不低于1000iu/ml。
[0060]
(2)组合物b溶液的制备：将纤维蛋白原溶液加入溶解有光敏材料和光引发剂的混合溶液中，均匀混合后，得到组合物b溶液：包含光敏材料、光引发剂和纤维蛋白原。控制所得组合物b溶液中光敏材料浓度不低于0.5％(w/v)，优选1％-10％(w/v)；同时控制纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，优选3％-5％(w/v)。
[0061]
(3)储存方法：将得到的组合物a溶液和组合物b溶液按体积比为1：10～10：1分别进行冷冻干燥，成为海绵状后进行储存。
[0062]
所述的双交联纤维蛋白粘合剂原料组合物应用方法如下：
[0063]
使用上述冻干海绵制备双交联纤维蛋白粘合剂：将海绵状a组分和海绵状b组分分别溶于溶剂中，得到可注射溶液状a组分和b组分。将等体积的a组分溶液和b组分溶液均匀的注射/喷涂于出血部位，并用蓝光或紫外光照射10～60s，可在原位快速形成固态水凝胶。作为优选方案，所述的可注射溶液在使用时的注射工具为双联注射器、注射器、巴氏吸管。
[0064]
上述制备方案中，所述的溶剂可选为磷酸缓冲盐溶液、hepes生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液或去离子水中任意一种或几种的组合，且其使用量没有特别限制，可以根据实际需要浓度进行配制。
[0065]
基于上述实施方式，本发明进一步列举以下实施例予以说明。
[0066]
实施例1
[0067]
制备一种双交联纤维蛋白粘合剂，具体原料及步骤如下：
[0068]
(1)甲基丙烯酰化明胶-苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液的制备：向粉末状苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐中加入所需体积的0.9％氯化钠溶液，水浴中加热溶解，得到两种浓度的苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液：0.25％(w/v)、0.5％(w/v)；取所需重量的固体甲基丙烯酰化明胶，分别向其中加入所需浓度的苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液，水浴加热溶解，得到两种质量体积百分比(w/v)的甲基丙烯酰化明胶-苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液：20％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.5％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、10％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；
[0069]
(2)凝血酶溶液的制备：将所需体积和所需浓度的氯化钙溶液注射入凝血酶中，完全溶解后，得到凝血酶活力为2000iu/ml的凝血酶溶液，其中ca
2
浓度为80mmol/l；
[0070]
(3)纤维蛋白原溶液的制备：取所需重量的纤维蛋白原，缓慢置于预热的0.9％氯化钠溶液中，完全溶解后，得到质量体积百分比(w/v)为10％(w/v)的纤维蛋白原溶液。
[0071]
(4)a组分溶液的制备：将步骤(2)得到的凝血酶溶液加入步骤(1)得到的20％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.5％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液中，均
匀混合后，得到a组分溶液：10％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液；
[0072]
(5)b组分溶液的制备：将步骤(3)得到的纤维蛋白原溶液加入步骤(1)得到的10％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液中，均匀混合后，得到b组分溶液：5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液；
[0073]
(6)储存：将得到的a组分溶液和b组分溶液按照体积比为1:1的比例分别进行冷冻干燥，以海绵状进行储存；
[0074]
(7)使用方法：将海绵状a组分和b组分按照1:1的体积份额比例分别溶于含有0.9％氯化钠溶液中，得到可注射溶液状的a组分和b组分。将a组分溶液和b组分溶液等体积的装入双联注射器，a组分溶液和b组分溶液通过喷头注射/喷涂在出血部位，随后用蓝光照射10～60s，可原位转变为固态水凝胶。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与光交联的体积比例为1:1。
[0075]
(8)所述的固态水凝胶结构如图3所示：它是由三维立体的纤维蛋白网络和三维立体的光敏凝胶网络共同构成的固态水凝胶；每个所述的光敏凝胶网络孔道内部都有一组所述的纤维蛋白网络，且每一组所述的纤维蛋白网络整体具有连续性；整体上，所述的三维立体的纤维蛋白网络无序地遍布所述固态水凝胶表面和内部。
[0076]
实施例2
[0077]
制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处仅在于：将步骤(4)制备得到的a组分溶液的甲基丙烯酰化明胶浓度为5％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与光交联的体积比例为2:1。
[0078]
实施例3
[0079]
制备浓度为13％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-250iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处仅在于：将步骤(4)制备得到的a组分溶液中甲基丙烯酰化明胶浓度调整为13％(w/v)，且将其中凝血酶活力调整为250iu/ml。
[0080]
实施例4
[0081]
制备浓度为13％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例3大体相同，不同之处仅在于：将a组分溶液的凝血酶活力调整为1000iu/ml。
[0082]
实施例5
[0083]
制备浓度为8％(w/v)甲基丙烯酰化透明质酸-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯
甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化透明质酸-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：
①
本实施例a和b组分中的光敏材料为甲基丙烯酰化透明质酸，且a组分溶液中的甲基丙烯酰化透明质酸浓度为8％(w/v)；
②
b组分溶液的甲基丙烯酰化透明质酸浓度为5％(w/v)；
③
甲基丙烯酰化透明质酸-苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液的制备过程不需要加热，可在室温下进行。
[0084]
实施例6
[0085]
制备浓度为8％(w/v)甲基丙烯酰化透明质酸-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-500iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化透明质酸-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例5大体相同，不同之处在于：将a组分溶液的凝血酶活力调整为500iu/ml。
[0086]
实施例7
[0087]
制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：本实施例a和b组分中的光敏材料为甲基丙烯酰化海藻酸钠，且a组分溶液中的甲基丙烯酰化海藻酸钠浓度为5％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和光交联的体积比为2:1。
[0088]
实施例8
[0089]
制备浓度为8％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-500iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处仅在于：调整a组分溶液中的甲基丙烯酰化海藻酸钠浓度为8％(w/v)且调整其中凝血酶活力为500iu/ml。
[0090]
实施例9
[0091]
制备浓度为8％(w/v)甲基丙烯酰化丝素蛋白-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化丝素蛋白-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例5大体相同，不同之处在于：本实施例中a和b组分中的光敏材料为甲基丙烯酰化丝素蛋白。
[0092]
实施例10
[0093]
制备浓度为10％(w/v)甲基丙烯酰化丝素蛋白-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-500iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为5％(w/v)甲基丙烯酰化丝素蛋白-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例9大体相同，不
同之处仅在于：调整a组分溶液中的甲基丙烯酰化丝素蛋白浓度为10％(w/v)且凝血酶活力为500iu/ml。
[0094]
实施例11
[0095]
制备浓度为2％(w/v)甲基丙烯酰化壳聚糖-0.1％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为1％(w/v)甲基丙烯酰化壳聚糖-0.1％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：选用的光敏材料种类和浓度不同，光引发剂浓度不同。此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和光交联的体积比为1:1。
[0096]
实施例12
[0097]
制备浓度为3％(w/v)甲基丙烯酰化壳聚糖-0.1％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-500iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为1％(w/v)甲基丙烯酰化壳聚糖-0.1％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例11大体相同，不同之处仅在于：调整a组分溶液中的甲基丙烯酰化壳聚糖浓度为3％(w/v)且凝血酶活力为500iu/ml。
[0098]
实施例13
[0099]
制备浓度为15％(w/v)聚醚f127二丙烯酸酯-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为10％(w/v)聚醚f127二丙烯酸酯-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：本实施例中a和b组分中的光敏材料为聚醚f127二丙烯酸酯，且a组分溶液中的聚醚f127二丙烯酸酯浓度为15％(w/v)，b组分溶液中聚醚f127二丙烯酸酯浓度为10％(w/v)。
[0100]
实施例14
[0101]
制备浓度为20％(w/v)聚醚f127二丙烯酸酯-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-500iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为10％(w/v)聚醚f127二丙烯酸酯-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其组成、制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处仅在于：调整a组分溶液中的聚醚f127二丙烯酸酯浓度为20％(w/v)且凝血酶活力为500iu/ml。
[0102]
对比例1
[0103]
外用冻干纤维蛋白粘合剂(护固莱士，购于上海莱士)，包括酶试剂和纤维蛋白原试剂。将酶试剂和纤维蛋白原试剂按其说明书分别配制成溶液，混合后约1s完成酶交联得到纤维蛋白粘合剂，该粘合剂微观结构如图1所示。
[0104]
对比例2
[0105]
制备9％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐前体溶液，其制备方法与实施例2的a组分溶液大体相同，不同之处仅在于：溶液中不添加凝血酶。
[0106]
对比例3
[0107]
制备133％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶混合溶液，组分和制备方法与实施例2的a组分溶液相同。
[0108]
对比例4
[0109]
制备5％(w/v)甲基丙烯酰化明胶-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液，组分和制备方法与实施例1的步骤(5)相同。
[0110]
对比例5
[0111]
制备浓度为30％(w/v)甲基丙烯酰化丝胶蛋白-0.5％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为20％(w/v)甲基丙烯酰化丝胶蛋白-0.5％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法与实施例9大体相同，不同之处在于：本对比例中的a和b组分中的光敏材料为甲基丙烯酰化丝胶蛋白，且a组分溶液中的甲基丙烯酰化丝胶蛋白浓度为30％(w/v)，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐浓度为0.5％(w/v)，b组分溶液中的甲基丙烯酰化丝胶蛋白浓度为20％(w/v)，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐浓度为0.5％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和光交联的体积比为1:1。
[0112]
对比例6
[0113]
制备浓度为10％(w/v)甲基丙烯酰化葡聚糖-0.25％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-1000iu/ml凝血酶的混合溶液作为a组分溶液，制备浓度为10％(w/v)甲基丙烯酰化葡聚糖-0.125％(w/v)苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为b组分溶液。其制备方法与实施例9大体相同，不同之处在于：本对比例中的a和b组分中的光敏材料为甲基丙烯酰化葡聚糖，且a组分溶液中的甲基丙烯酰化葡聚糖浓度为10％(w/v)，b组分溶液中的甲基丙烯酰化葡聚糖浓度为5％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和光交联的体积比为1:1。
[0114]
性能测试
[0115]
为验证实施例1～14得到的双交联纤维蛋白粘合剂及对比例1～6水凝胶的性能，下面分别对其进行胶凝时间性能测试、粘附强度测试和动物止血实验。
[0116]
胶凝时间测试
[0117]
检测对象：
[0118]
前述的实施例1～14，以及对比例1-6；
[0119]
检测方法：
[0120]
对实施例1～14及对比例1～6进行流变学分析，来比较其胶凝时间，其结果见表1。具体操作方法：使用具有平行板(p20 til，20-mm直径)几何结构的haake rs6000光流变仪在37℃下进行动态流变实验。实施例1～14和对比例1～6水凝胶的时间扫描振荡测试在5％应变、1hz频率下进行300秒。对预凝胶溶液进行应变扫描以验证线性响应。凝胶点在扭转模量(g’)超过损耗模量(g”)时确定。
[0121]
粘附强度测试
[0122]
前述的实施例1～14，以及对比例1～6；
[0123]
检测方法：
[0124]
具体操作：将猪皮切成40毫米
×
20毫米的长方形，两片猪皮间用500μl的实施例1～14及对比例1～6进行粘合，对实施例1～14的a组分和b组分的混合溶液及对比例2～6的
前体溶液进行相同波段蓝光的光照60s。之后以1mm/min的应变速率进行粘合强度的测试。对比例2的前体溶液光照交联后形成的凝胶微观结构如图2所示；实施例1混合溶液光照交联后形成的凝胶微观结构如图3所示。记录凝胶从猪皮脱落时的读数，即为粘附强度(kpa)。检测结果见表1。
[0125]
止血效果测试
[0126]
检测对象：
[0127]
前述的实施例4，以及对比例1～6；
[0128]
检测方法：
[0129]
兔肝表面1cm切口出血模型：将新西兰大白兔麻醉后，暴露腹部，固定在手术台，腹部正中切口，暴露肝脏，在肝脏上造1cm*0.5cm的出血模型；分别用已称重的滤纸、实施例4的a组分和b组分按照实施例1步骤(7)所述的注射方法注射得到的混合溶液、以及对比例1～6的前体溶液作为止血材料覆盖在出血部位(其中实施例4和对比例2-6均在覆盖同时使用相同波段蓝光光照处理)，直至出血停止，记录出血时间和失血量，其结果见表1、图4和图5。
[0130]
表1
[0131][0132]
止血时间和失血量的数值用(均值
±
标准差)来表示。
[0133]
结果分析：
[0134]
由图1可知，对比例1的纤维蛋白胶粘合剂原料只能获得纤维蛋白交联呈网状结构。由图2可知，对比例2前体溶液光照后仅有甲基丙烯酰化明胶光交联呈多孔结构。由图3可知，本发明实施例1的a、b组分混合溶液光照后可同时具有纤维蛋白交联的网状结构和甲基丙烯酰化明胶交联的多孔结构，且形成的甲基丙烯酰化明胶交联多孔结构的孔道内都分布有整体连续的三维立体纤维蛋白网络结构。
[0135]
由表1可知，实施例1～14的粘合剂胶凝时间范围为1～3s，在光敏材料相同的情况
下，粘合剂的胶凝时间会随着光交联比例的提高而延长，但实施例1～14所选择的所有种类的光敏材料在特定的双交联比例下的胶凝时间均显著低于对比例2-4粘合剂的胶凝时间(对比例2的胶凝时间为8s，对比例3的胶凝时间为9s，对比例4的胶凝时间为14s)。
[0136]
由表1可知，实施例1～14的粘合剂粘附强度范围为82～132kpa，在光敏材料相同的情况下，凝胶的粘附强度随着光敏材料浓度的降低而减小，但实施例1～14所选择的所有种类的光敏材料在特定的双交联比例下的粘附强度均高于各对比例粘合剂的粘附强度(对比例1的粘附强度为6kpa，对比例2的粘附强度为80kpa，对比例3的粘附强度为76kpa，对比例4的粘附强度为70kpa，对比例5的粘附强度为29kpa，对比例6的粘附强度为45kpa)。
[0137]
由表1和图4、图5可知，本发明实施例4的粘合剂止血时间为4～8s，均显著低于对比例1～6粘合剂的40s以上的止血时间。实施例4的粘合剂的平均失血量仅为12mg，均显著低于对比例1～6粘合剂的90mg以上的平均失血量。
[0138]
总之，本发明的制备双交联纤维蛋白粘合剂的原料组合物，应用在出血伤口时，可即刻(1s左右)形成纤维蛋白凝块，起到“初步”封堵伤口作用，阻挡血液流出；同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化凝块，起到高效的促凝血效果；进一步的，光敏材料在光激发下，形成光敏凝胶，光敏凝胶具有强湿组织粘附力，起到“强”封闭伤口效果。纤维蛋白交联和光交联结构相互作用，兼具初步封堵伤口和强组织粘附功能，从而达到优异的止血效果。
[0139]
以上对本发明的具体实施例进行了详细介绍。需要理解的是，本发明并不局限于特定实施方式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何变形或修改、等同替换和改进等，并不影响本发明的实质内容，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。