牛樟芝萃取物在制备用于降低血管紧张素转化酶2的表达及治疗其相关疾病的产品中的用途的制作方法

牛樟芝萃取物在制备用于降低血管紧张素转化酶2的表达及治疗其相关疾病的产品中的用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年4月28日提交的美国临时申请编号63/016,665的权益。发明背景
2.牛樟芝(antrodia cinnamomea)(又称台湾牛樟芝(taiwanofungus camphoratus))是一种带有橘红/红色子实体的地方性多孔药用真菌。它仅生长于属于樟科的地方性树种牛樟树(cinnamomum kanehira hayata)的内腔上。蕈类一般在民间传统用药中用于治疗癌症、高血压、宿醉、食物和药物中毒。
3.据之前的科学研究报告显示，牛樟芝萃取物和纯化的化合物具有多种生物活性，包括抗癌、抗炎症、保肝、抗氧化、神经保护和免疫调节等等。牛樟芝的萃取物含有各种代谢产物，包括萜类化合物、苯环类化合物、木脂素、琥珀酸和马来酸衍生物以及多糖。其中三萜类化合物是子实体的主要成分，而其有效抗癌、抗炎症、免疫调节和抗糖尿病特性，使得牛樟芝引起大众关注。
4.血管紧张素转化酶2(ace-2)是一种单羧肽酶，已知可裂解肾素-血管紧张素系统中多种肽和其他底物，如apelin。该酶几乎不存在于循环系统中，但广泛表达于器官中，例如在肾脏和胃肠道中，肺脏中的表达水平则相对低。


技术实现要素：

5.本文公开内容至少部分地基于牛樟芝萃取物(ant-ex)或其馏分物三号(ae-f03)的开发，显示出其在减少血管紧张素转化酶2(ace-2)表达方面的有效活性，从而用于对ace-2相关状态进行治疗、降低其风险、预防或缓解。
6.因此，本文公开内容的一个方面涉及对受试者的血管紧张素转化酶2(ace-2)相关状态进行治疗、降低其风险、预防或缓解的方法，包括向受试者施用治疗有效量的牛樟芝萃取物(ant-ex)或其馏分物三号(ae-f03)。
7.在另一方面，本文提供了牛樟芝萃取物(ant-ex)或其馏分物三号(ae-f03)在制备药物或营养补充剂中的用途，所述药物或营养补充剂用于对血管紧张素转化酶2(ace-2)相关状态进行治疗、降低其风险、预防或缓解。
8.此外，本文公开内容提供了牛樟芝萃取物(ant-ex)或其馏分物三号(ae-f03)在降低血管紧张素转化酶2(ace-)2表达中的用途。
9.在某些具体方案中，受试者为哺乳动物，优选地人。
10.本文所公开的ace-2相关状态可以是血压相关疾病或病症。优选地，所述ace-2相关状态选自以下：慢性心力衰竭、左心室肥大、急性心力衰竭和心肌病。所述ace-2相关状态也可以是充血性心力衰竭，动脉高血压或心肌梗塞。
11.本文所公开的ace-2相关状态可以是细胞增生病症。示例性的细胞增生病症包括，但不限于平滑细胞增生病症，优选地血管狭窄。
12.本文所公开的ace-2相关状态可以是肾脏疾病或病症，或运动升压素相关病症。示
例性的运动升压素相关病症包括，但不限于异常的血管通透性、局部和全身性过敏反应、湿疹、哮喘和过敏性休克。
13.本文所公开的ace-2相关状态可以是炎症。示例性的炎症包括，但不限于全身性炎症反应综合征(sirs)、多发性创伤，炎症性肠病、急慢性疼痛、类风湿性和骨关节炎中的骨质破坏、牙周病、痛经、早产、局部损伤后的脑水肿、弥漫性轴索损伤、过敏性病症、伤口愈合或疤痕形成。
14.本文所公开的ace-2相关状态可以是病毒感染，优选地冠状病毒感染。示例性的冠状病毒感染包括，但不限于严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)感染、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)感染或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染。
15.在本文所公开的任何方法和用途中，牛樟芝萃取物通过以下方法获得：以95％的(v/v)乙醇萃取牛樟芝的干燥子实体并且包括其馏分物三号(ae-f03)。
16.在本文所公开的任何方法中，受试者已经或正接受疾病的其他治疗。
17.本专利发明一种或多种实施方案的细节在如下说明书中所示。本发明的其他特征或优点将从下文附图及几个实施方案的详细描述，以及从所附权利要求中变得清晰。附图简单说明
18.图1显示了牛樟芝萃取物(ant-ex)降低血管紧张素转化酶2(ace-2)蛋白质表达。以50ug/ml ant-ex孵育人肺癌cl1-5细胞以24小时，通过wstern印迹分析ace-2蛋白质表达水平。ace-2抗体购自proteintech(目录编号：21115-1-ap)
19.图2显示了ant-ex以时间依赖性方式降低ace-2蛋白质表达。以50ug/ml ant-ex孵育人肺癌cl1-5细胞以0～24小时，通过wstern印迹分析ace-2蛋白质表达水平。ace-2抗体购自proteintech(目录编号：21115-1-ap)
20.图3显示了ant-ex以剂量依赖性方式降低ace-2蛋白质表达。以12.5～50ug/ml ant-ex孵育人肺癌cl1-5细胞以24小时，通过wstern印迹分析ace-2蛋白质表达水平。ace-2抗体购自proteintech(目录编号：21115-1-ap)
21.图4显示了ant-ex以剂量依赖性方式降低ace-2蛋白质表达。以12.5～50ug/ml ant-ex孵育人肺癌cl1-5细胞以24小时，箭头指示ace-2蛋白质条带。也检测来自同一细胞的gapdh作为蛋白质定量对照。
22.图5显示了ant-ex降低ace-2mrna表达。以50ug/ml ant-ex孵育人肺癌cl1-5细胞以1、2或3小时，通过rt-qpcr分析ace-2mrna表达水平。
23.图6显示了ant-ex对ace-2的酶活性的抑制。(a)ace-2活性测定法的原理。(b)ant-ex(1、5、10mg/ml)可降低酶活性约(约40％)，并且抑制作用如柱状图所示。(c)对不同浓度的ant-ex(40um、200um和400um)进行ace-2酶活性测定法，并且结果显示ant-ex的ki为约590.9um。
24.图7显示了通过图7(a)中所述的测定法系统，ant-ex中各种成分对ace-2的酶活性的抑制。测试的成份为樟芝酸(antcin)a、樟芝酸b、樟芝酸c、樟芝酸h、樟芝酸k、dsa(去氢硫色多孔菌酸)和dea(去氢齿孔酸)。测定以20μg/ml的每种成分，并且它们的抑制能力见柱状图。其中除樟芝酸b外，所有这些测试的化合物均具有对ace-2酶活性的抑制能力。在测试的化合物中，显示dsa、樟芝酸a和樟芝酸k有较强的抑制活性。
25.图8显示了ant-ex对sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)与ace-2受体相互作用的细胞抑
制测定法。(a)该细胞测定法系统的原理和流程图。该系统包含具有sars-cov-2s蛋白并携带荧光素酶报告基因的伪病毒和可在细胞表面上过表达ace-2蛋白的293t细胞。(b)ant-ex(0-50μg/ml)可抑制刺突蛋白与ace-2受体的相互作用，在50μg/ml时为约80％抑制(p《0.05)。
26.图9显示了ant-ex对感染sars-cov-2的vero-e6的抑制测定法。(a)vero-e6细胞在37℃用指定浓度的ant-ex预处理1小时，然后用100pfu(moi＝0.01)的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)在37℃吸附1小时。去除病毒，将含有指定浓度化合物的新鲜培养基加入细胞孵育1天。将细胞固定并用抗sars-cov-2n蛋白抗体加抗人igg-488抗体进行免疫染色。对于细胞存活测试，vero-e6细胞在37℃用指定浓度的ant-ex处理1天。由细胞计数试剂盒-8(cck-8)确定细胞存活。荧光信号通过高内涵成像进行定量，并且将未经化合物处理的感染率设定为100％。通过prism软件计算ic50和cc50。(b)对于ace-2表达测试，vero-e6细胞在37℃用指定浓度的化合物处理24小时。将细胞固定并用抗hace-2抗体(gtx01160)加抗兔子igg-568进行免疫染色。荧光信号通过高内涵成像进行定量，并且将未经化合物处理的表达水平设定为100％。
27.图10显示了(a)ae-f03降低ace-2蛋白质表达(约36％，且无显著的细胞毒性。用12.5～50ug/ml ae-f03或不用ae-f03孵育人肺癌cl1-5细胞以24小时。也检测来自同一细胞的gapdh作为蛋白质定量对照。(b)ae-f03抑制ace-2蛋白质的酶活性。用100μg/ml或不用ae-f03处理ace-2蛋白质30分钟，然后用含有荧光生成基团的底物再处理10分钟。如果有抑制作用，则荧光强度降低。该酶活性测定法的原理如图7(a)所述。ae-f03处理后，ace-2的酶活性被抑制约10％。(c)通过执行抑制测定法(用20μg/ml每种化合物或不用作为对照)，ae-f03的主要成分，樟芝酸k、dsa和dea也具有抑制ace-2的能力。dsa是最强的抑制试剂，具有超过30％抑制。(d)vero-e6细胞在37℃用指定浓度的ae-f03预处理1小时，然后在37℃用100pfu(moi＝0.01)的sars-cov-2吸附1小时。去除病毒，并将含有指定浓度化合物的新鲜培养基加入细胞孵育1天。将细胞固定并用抗sars-cov-2n蛋白质抗体加抗人igg-488进行免疫染色。对于细胞存活测试，vero-e6细胞在37℃用指定浓度的化合物处理1天。由细胞计数试剂盒-8(cck-8)确定细胞存活。荧光信号通过高内涵成像进行定量，并且将未经化合物处理的感染率设定为100％。通过prism软件计算ic50和cc50。
28.图11显示了(a)ant-ex的hplc层析图谱和(b)在ant-ex中化合物的滞留时间(rt)、面积、高度和名称。
29.图12显示了从ant-ex分馏出ae-f03的流程图。
30.图13显示了(a)ae-f03的hplc层析图谱和(b)在ae-f03中化合物的滞留时间(rt)、面积、高度和名称。发明详述
31.本技术涉及对受试者的血管紧张素转化酶2(ace-2)相关状态进行治疗、降低其风险、预防或缓解的方法，包括向受试者施用治疗有效量的牛樟芝萃取物(ant-ex)或其馏分物三号(ae-f03)，以治疗ace-2相关状态。其中，ae-f03包含樟芝酸k、dsa、dea和3β,15α-二羟基羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-油酸(dlto)。在一个实施方案中，从牛樟芝或任何其他已知来源中萃取和分馏出ae-f03。可替代地，ae-f03可以是至少混合上述组分的组合物。在一个实施方案中，本文所描述的ant-ex和/或ae-f03可用于治疗ace-2介导的病症，所述病
症如本文所使用的是指与ace-2的升高水平或ace-2的升高敏感性相关的任何医学病况。
32.词语“ace-2相关状态”包括与ace-2、ace-2底物或其代谢途径的产物相关的那些状态。在一个实施方案中，ace-2相关状态包括其特征在于异常的ace-2活性水平、ace-2底物水平和/或ace-2代谢产物的病症。ace-2相关状态可以包括例如高血压、高血压相关疾病和病症、对病毒感染(例如冠状病毒)的高敏感性和/或动脉高血压。
33.在实施方案中，高血压相关疾病和病症包括：例如充血性心力衰竭(chf)、慢性心力衰竭、左心室肥大、急性心力衰竭、心肌梗塞和/或心肌病。
34.在实施方案中，ace-2相关状态也包括失调细胞增生，例如平滑细胞增生。肌肉内动脉内膜中的平滑肌细胞增生是导致动脉粥状硬化、血管外科手术后和冠状动脉手术后血管狭窄的主要原因。几项动物研究已经显示，肾素-血管紧张素系统在对损伤的这种血管应答中扮演着十分重要的角色。
35.在实施方案中，ace-2相关状态包括肾脏疾病或病症，例如肾衰竭。因此，至少部分地基于ace-2在肾脏中表达并且与血管紧张素转化酶同源的事实，ace-2调节化合物可以单独或与已知的血管紧张素转化酶抑制剂组合，用于治疗和预防肾脏疾病或病症。
36.在实施方案中，ace-2相关状态包括交感神经兴奋状态，例如急性心肌梗塞(ami)和一些心室性心律不齐。已知ace-2从运动升压素中切割c端氨基酸(亮氨酸)。运动升压素是具有seq id no：23的9个氨基酸的肽(参见美国专利号09/163,648)，已报道其诱导从肥大细胞的组织胺的剂量依赖性释放，以及当皮下注射到大鼠体内时，诱导血管通透性的剂量依赖性增加。因此，调节运动升压素的血浆和/或组织水平，例如通过调节来自运动升压素的c端氨基酸的水解，对于治疗异常运动升压素水平引起的或由其促成的病况是有帮助的。所述病况包括由肥大细胞的异常组织胺释放和/或异常血管通透性引起的或由其促成的那些。因为过量的组织胺释放与局部或全身性过敏反应相关，包括湿疹、哮喘、过敏性休克，这些病况都包括在“与ace-2相关状况”中。
37.在实施方案中，ace-2相关状态包括例如全身性炎症反应综合征(sirs)、败血症、多发性创伤、炎症性肠病、急慢性疼痛、类风湿性和骨关节炎中的骨质破坏，及牙周病、痛经、早产、局部损伤后的脑水肿、弥漫性轴索损伤、中风、蜘蛛膜下腔出血后的再灌注损伤和脑血管痉挛、过敏性病症(包括哮喘)、成人呼吸窘迫综合征、伤口愈合和疤痕形成等。
38.术语“治疗”包括治愈或缓解状态、疾病或病症的至少一种症状。
39.术语“缓解”未必要求治愈的结果。如本文所使用，“延缓”靶疾病或病症的发展是指疾病的延迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或延迟进展。这种延缓的时间长度可以有所不同，取决于病史和/或在治疗的个体。“延缓”或缓解疾病的发展，或延缓疾病的发生的方法，是与未使用该方法相比，在一定的时间范围内减少发生疾病的一种或多种症状发生的可能性和/或在一定的时间范围内降低症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以产生统计学显著结果的受试者数量。
40.术语“施用”包括施用的途径，允许ant-ex或ae-f03执行其预期功能，例如降低ace-2的表达、抑制ace-2的功能和/或治疗ace-2相关状态。施用途径的示例包括胃肠外(例如，皮下注射、静脉内注射和肌内注射)、腹膜内注射、肠道内、吸入、透皮等，这取决于在治疗的状态，例如待治疗疾病或感染的严重程度。在实施方案中，注射可以是团注或连续输注。
41.ant-ex或ae-f03可使用有效降低病毒的感染性的任何量和任何施用途径进行施用，所述病毒例如严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)或其他任何冠状病毒株。因此，本文所使用的术语“有效量”是指不具毒性但足以提供病毒感染所需治疗的抗病毒剂的量。需要的精确量将因受试者而异，取决于受试者的性别、年龄以及一般状况，感染的严重程度，特定的抗病毒剂及其施用模式等。
42.尽管可以将ant-ex或ae-f03施用给对病毒感染，优选地冠状病毒感染敏感的任何患者，但ant-ex或ae-f03旨在用于治疗哺乳动物宿主，尤其是人。
43.鉴于ant-ex或ae-f03产生的抑制作用，预测这些组合物不仅可用于感染的治疗性处理，也可用于预防。无论是用于治疗或预防病毒感染，优选地冠状病毒感染，上述剂量基本上应该相同。
44.根据施用途径，将ant-ex或ae-f03以所选材料进行包覆或放置于所选材料中，以保护其免受可能对其执行其预期功能的能力产生不良结果的自然条件的影响。可将ant-ex或ae-f03单独或与药理学上可接受的载体一起施用。此外，ae-f03也可以混合物的形式施用，其可以与药理学上可接受的载体一起共施用。ant-ex或ae-f03可以在ace-2介导的状态发作前或ace-2介导的状态发作后施用。ant-ex或ae-f03也可作为前体药物施用，其在体内转化为另一种形式。
45.为了易于施用并使剂量均一，将化合物优选地配制成剂量单位形式。本文所使用的剂量单位形式是指适合于待治疗患者的试剂的物理上离散单位。每个剂量应包含经计算可本身或与所选的药理学上可接受的载体结合以产生所需治疗效果的活性物质的量。ant-ex或ae-f03可以制成各种施用形式，包括片剂、囊片、丸剂或糖衣锭，或可以装在适当的容器中，例如胶囊，或者在悬液剂的情况下装到瓶子中。
46.如本文所述，“药理学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬液助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，适用于所需的特定剂型。换句话说，本文施用的“药理学上可接受的载体”表示药理学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料，涉及在受试者内或向受试者运送或转运ant-ex或ae-f03使得其可以执行其预期功能。remington's pharmaceutical sciences，第十五版，e
·w·
马丁(伊斯顿
·
麦克出版社1975)公开了用于配制药物组合物的各种载体及其制造的已知技术。
47.除非任何常规载体介质与ant-ex或ae-f03不相容，例如产生不良的生物学效应或另外以有害的方式与ant-ex或ae-f03的任何其他组分相互作用，否则载体的使用在本文公开的范围内。在本发明的药物组合物中，基于包含载体介质和/或助剂的组合物的总重量，活性剂以至少0.5％并不超过99％的量存在。优选地，活性剂例如ant-ex或ae-f03的比例以组合物重量的5％-70％之间变化。适用于肠内或肠胃外施用的药理学有机或无机、固体或液体载体介质可用于组成组合物。作为药理学上可接受的载体的材料的一些示例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；
and m.p.calos,eds.,1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel,et al.,eds.,1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis,et al.,eds.,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan et al.,eds.,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway and p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.,ed.,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd and c.dean,eds.,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow and d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti and j.d.capra,eds.,harwood academic publishers,1995)。
54.无需进一步阐述，相信本领域的技术人员可根据以上描述，最大程度地运用本发明。因此以下具体实施方案仅作为说明，且不以任何方式限于本文所公开其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物通过引用并入本文。
实施例
56.提供以下实施例以更详细描述本发明。以下实施例不是限制性的并仅代表本发明的各个方面和技术特征。
57.全长形式的ace-2是膜结合酶而其较短的(可溶)形式于血液中以非常低的水平循环(renhong et al.,2020)。体内测量膜结合的ace-2在技术上有挑战性，而大多数来自人的发表文章报告了在血液中的ace-2活性水平，反映出可溶性ace-2蛋白质以非常低的水平循环(ramchand et al.,2020)。有些观察和实验结果显示各种病理学病况(如心肌梗塞、动脉粥样硬化、肾脏病、肝硬化、糖尿病和炎症性肺损伤)中增强的ace-2的有益保护作用(tikellis和thomas，2012)。
58.然而，先前对引起sars的冠状病毒的研究揭示该病毒通过其表面刺突蛋白与肺泡中的ace-2结合，然后引起肺部损伤甚至肺功能衰竭(kuba et al.,2005)。近期研究也证实，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)进入取决于膜结合的(全长)ace-2，其作为sars-cov-2刺突蛋白的受体起作用。刺突蛋白与ace-2的结合，及跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)对ace-2的蛋白水解切割，有助于病毒进入细胞、病毒复制和细胞间传播，同样地，在细胞融合系统中，在没有外源性蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)的情况下，sars-cov-2蛋白质可有效介导导效应细胞与靶细胞之间合胞体的形成，而sars-cov-2s蛋白质不能(shyam xia et al.,2020)。已知ace-2在口腔粘膜上皮、肺的ii型肺泡(at2)、复层上皮、回肠和结肠的肠上皮细胞、胆管细胞、心肌、近端肾小管和膀胱尿道上皮细胞中的表达和分布较高。这些报告显示，那些具有高ace-2表达细胞的器官可能是sars-cov-2感染的潜在靶标。
59.在正常的人体肺组织中，ace-2在i型和ii型肺泡上皮细胞中表达。此外，病毒受体ace-2的表达集中在少量的ii型肺泡(at2)细胞中，使得这些at2细胞很可能成为sars-cov-2的靶细胞。有趣的是，在0.64％的人肺细胞表达ace-2，而超过80％的总ace-2表达再at2细胞中。
60.实施例1：牛樟芝的萃取和分馏
61.(i)牛樟芝的萃取(ant-ex)
62.获得ant-ex的方法：牛樟芝的子实体经中国台湾地区“中央研究院”生物化学研究所的陈水田(shui-tein chen)教授证实。将牛樟芝子实体的干燥(45℃，48小时)和研磨的粉末(50g)用2-20体积(v/w)的95％乙醇在37℃(搅拌7小时)；和水，100℃(搅拌5小时)两者进行萃取。然后将萃取液合并在一起作为萃取物。
63.倾析出萃取物，并通过whatman一号滤纸过滤，并在45℃使用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。最后将产物冷冻干燥以得到粗萃取物ant-ex粉末(16g，32％，w/w)。为了分离出负责所观察到的ace-2抑制的化合物，ant-ex的初步hplc分析揭示萃取物中存在一些已知化合物(图11)。接着将ant-ex用不同的溶剂进一步分馏，其中ae-f03是主要馏分。
64.(ii)牛樟芝的分馏(ae-f03)
65.获得ae-f03的方法：从上述牛樟芝的萃取物(ant-ex)中，首先用正己烷200ml洗涤样品，搅拌2小时，3次，并保留残余物。然后，将样品依次分别用20％的乙醇洗涤1次(搅拌2小时)；30％的乙醇洗涤8次；和35％的乙醇洗涤1次。保留洗涤后的残留物(图12)。
66.将萃取物进一步倾析并通过whatman一号滤纸过滤，在45℃使用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。最后将产物冷冻干燥以得到ae-f03粉末。
67.经由hplc测定ae-f03的含量(图13)。峰的滞留时间似乎与建立的具有相同多重性的标准化合物一致。
68.实施例2：牛樟芝萃取物(ant-ex)降低血管紧张素转化酶2(ace-2)蛋白质和mrna表达
69.(i)ant-ex降低ace-2蛋白质表达
70.将人肺癌cl1-5和cl1-0细胞与12.5-50μg/ml的ant-ex孵育0-24小时。通过western印迹分析ace-2蛋白质表达水平。ace-2抗体购自proteintech(目录号：21115-1-ap)。也检测来自同一细胞的肌动蛋白和gapdh作为蛋白质定量对照。
71.在本文公开中，将人肺癌细胞cl1-5和cl1-0用作模式细胞以检测ant-ex或ae-f03对ace-2表达的影响。首先在cl1-5细胞中分析ant-ex对ace-2表达的影响。如图1所示，ace-2在cl1-5细胞中组成型表达。然而，如通过western印迹确定的，以50μg/ml的ant-ex处理24小时显著地降低了ace-2蛋白质表达。另外，如通过western印迹确定的，以12.5-50μg/ml的ae-f03处理也降低了cl1-5细胞中的ace-2蛋白质表达(图10(a))。
72.随后，检查ant-ex对ace-2的时间依赖降低的影响。结果显示，如通过western印迹确定的，50μg/ml的ant-ex以时间依赖方式降低ace-2蛋白质表达(图2)。
73.接着，将cl1-5和cl1-0细胞暴露于不同浓度的ant-ex以24小时，然后使用western印迹评估ace-2的蛋白质表达。如图3和图4所示，ant-ex处理以剂量依赖方式降低cl1-5和cl1-0细胞两者中的ace-2蛋白质表达。
74.对包含纯化的三萜的ae-f03测定在cl1-5细胞中的其ace-2抑制潜能。结果显示出ae-f03以剂量依赖方式降低ace-2表达(图9(b))。
75.(ii)ant-ex降低ace-2mrna表达。
76.将人肺癌cl1-5细胞与50μg/ml的ant-ex或媒介物孵育1-3小时，并通过rt-qpcr分析ace-2mrna表达水平。
77.已知主要在小肠、结肠、十二指肠、肾脏、睾丸和胆囊中检测到ace-2mrna。正常情
况下，在肺中的ace-2mrna表达水平低。但在某些条件下，可以观察到所选细胞中上调的ace-2表达。接着检测cl1-5细胞中ant-ex对ace-2mrna表达的影响。结果显示50μg/ml的ant-ex降低了ace-2mrna表达(图5)。值得注意的是，在3小时处理后，ace-2mrna表达降至约77％(表1-2和图5)，显示出ace-2mrna表达水平与ace-2蛋白质表达水平呈现出一致性。结果发现，以ant-ex处理肺癌细胞，ace-2的mrna和蛋白质表达都降低。
78.表1
79.表2表2
80.这些结果证实ant-ex和ae-f03两者都观察到在mrna或蛋白质水平具有对ace-2的抑制潜力。
81.实施例3：ant-ex和ae-f03抑制ace-2的酶活性
82.测试各种浓度的ant-ex，ae-f03、樟芝酸a、樟芝酸b、樟芝酸c、樟芝酸h、樟芝酸k、去氢硫色多孔菌酸(dsa)和去氢齿孔酸(dea)，以观测它们是否影响ace-2的酶活性。该测定
法利用活性ace2切割基于合成的mca的肽底物以从其淬灭剂释放游离荧光团的能力(图6(a))。释放的mca可以使用荧光微量板读取器容易地进行定量。
83.之前报告显示，野生和固态培养的牛樟芝甲醇萃取物抑制血管紧张素转化酶，其ic
50
值分别为0.312mg/ml和0.172mg/ml。然而，没有关于确切的抑制机制和负责化合物的信息。人们开始关注，由于ace-2作为病毒结合位点的作用，血管紧张素转化酶抑制剂理论上增加sars-cov-2感染的风险。然而，已知血管紧张素转化酶抑制剂不抑制ace-2，因为血管紧张素转化酶和ace-2是完全不同的酶。
84.通过以蛋白质和细胞为基础的测定法，证明ant-ex有效抑制ace-2酶活性(图6)。在图10(b)中，通过对ace-2蛋白质的酶活性测定法，显示出ae-f03具有抑制ace-2的能力。在ant-ex或ae-f03的主要成分中，除樟芝酸b以外，所有这些测试的化合物均具有对ace-2酶活性的抑制能力。根据图7和10(c)，尤其是dsa和樟芝酸k更是最强的抑制剂，其对酶活性的抑制超过30％。
85.实施例4：ant-ex和ae-f03抑制刺突蛋白与ace-2的结合
86.为了确认ace-2的表达和酶活性的降低是否与抑制病毒结合有关，应用具有sars-cov-2s蛋白质及携带荧光素酶报导基因的伪病毒以及在细胞表面上过表达ace-2蛋白质的细胞(图8(a))。进行测定法系统以观测ace是否抑制sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)与在细胞表面上的ace-2之间的相互作用。
87.此外，vero-e6细胞在37℃用指示浓度的ant-ex(图9(a))或ae-f03(图10(d))预处理1小时，然后在37℃用100pfu(moi＝0.01)的sars-cov-2吸附1小时。除去病毒，并在细胞中加入含有指示浓度化合物的新鲜培养基孵育1天。固定细胞并用抗sars-cov-2n蛋白质抗体加抗人体igg-488进行免疫染色。对于细胞存活测试，vero-e6细胞在37℃用指定浓度的ace处理1天。由细胞计数试剂盒-8(cck-8)确定细胞存活。荧光信号通过高内涵成像进行定量，并且将未经化合物处理的感染率设定为100％。通过prism软件计算50％抑制浓度(ic50)和50％细胞毒性浓度(cc50)。
88.根据图8(b)所示的结果，ant-ex显著抑制了s蛋白与ace-2之间的相互作用。根据图9(a)和10(d)所示的结果，ant-ex以68.5μg/ml的ic50显著地抑制sars-cov-2感染vero-e6细胞(图9(a))，而ae-f03则以82.92μg/ml的ic50抑制sars-cov-2感染vero-e6细胞(图10(d))。这些证实明显地表示出，将ant-ex、ae-f03或其成分作为重要的预防试剂或药物来施用以防止受试者免于sars-cov-2感染或通过结合ace-2受体的相似机制感染受试者的其他病毒感染。
89.其他实施方案
90.本说明书中所公开的所有技术特征可用以任何组合方式进行组合。提供相同、等效或相似目的的替代特征可替换本说明书中所公开的每个特征。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个技术特征仅是一系列相似或等效技术的示例。
91.根据以上描述，本领域的技术人员可以容易地确认本发明的必要特征，并且在不悖离本文的精神和范围的情况下，对本发明进行各种变动和修改以将其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在本技术专利范围之内。
92.等效项
93.尽管本文已描述和说明了几个发明实施方案，本领域的普通技术人员可以很容易
设想到用于执行所述功能的各种其他手段或构想和/或取得本文所述的结果和/或一项或多项优点，而此类变动或修改的每一个都被视为在本文所述的发明实施方案的范畴内。更一般地，本领域一般技术人员将容易地理解到，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置均是示例性的，而实际参数、尺寸、材料或配置将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够理解到，仅能以常规实验来确定本文描述的发明实施方案的许多等效项。因此，可以理解到，前述实施方案仅透过示例的方式表示，并且在所附专利申请书及其等效项的范围内，以不同于具体描述和申请专利的方法来实践本发明的实施方案。本文公开的发明实施方案涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒或方法。此外，如果两个或多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒或方法的任何组合不相互矛盾，则这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒或方法包括在本文公开的发明范围内。
94.本文所定义和使用的所有定义，应可解释控制字典定义，通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的一般含义。
95.本文公开的所有参考文献、专利和专利申请通过引用就其各自引用的主题并入本文中，在某些情况下可涵盖整份参考文件。
96.除非相反的明确说明，否则在说明书和权利要求中使用的冠词“一个”应解释为“至少一个”。
97.在说明书和权利要求中使用的用语如“和/或”应解释为表示连接在一起的要素的“之一或两者”，也就是在某些情况下连接存在和在其他情况下分开存在的要素。以“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，也就是连接在一起的“一个或多个”要素。除了以“和/或”从句特别限定的要素外，任选地存在其他要素，无论与上述特定要素是否相关。因此，在非限制性实施例中，引用“a或b”，当与开放性用语诸如“包括”连结使用时，是指在一个实施方案中仅有a(任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中，仅有b(任选地包括除a以外的要素)；又另一个实施方案中，有a和b(任选地包括其他要素)；等等。
98.本文于说明书和权利要求使用的，“或”应与上文所定义的“和/或”含义相同。例如，当用于分隔列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为包含性的，也就是包括众多或一系列要素中的至少一个，但也包括一个以上，以及任选地其他未列出的项目。另外还有明确指出数量的用语，例如“仅有一个”或“只有一个”，或当在权利要求中时，使用“由...组成”指的是包括众多或一系列要素中的仅有一个要素。一般而言，本文中使用的术语“或”仅在前面带有排他性术语时应解释为表示排他性(即“一个或另一个但不是两者”)，例如“任一”、“其中一个”、“仅有一个”或“只有一个”。“基本上由
……
组成”当在权利要求中使用时，应具有专利法领域中使用的普通含义。
99.如本文在说明书和权利要求中使用的，指示一个或多个要素的列表时的用语“至少一个”应解释为表示从要素列表中任何一个或多个要素选择的至少一个要素，但不一定包括表示要素列表中特别列出的每一个要素的至少一个，且不排除要素列表中的任何要素组合。上述定义还允许除了用语“至少一个”所指要素列表中特别限定的要素之外，要素任选地存在，无论与特别限定的上述组要素是否相关。因此，作为非限制性示例，“a和b中的至少一个”(或等价地“a或b中的至少一个”，或等价地“a和/或b中的至少一个)可以指，在一个实施方案，至至少一个，可选地包括多于一个，a，不存在b(并且可选地包括b以外的要素)；在另一个实施方案中，至至少一个，可选地包括多于一个，b，不存在a(并且任选地包括除a
之外的要素)；在又一个实施方案中，至少一个，可选地包括多于一个，a，和至少一个，可选地包括多于一个，b(并且可选地包括其他要素)；等等。
100.还应该理解的是，除非有明确的相反指示，在本文要求保护的任何方法中，包括一个以上的步骤或动作，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所述方法的这些步骤或动作的顺序。