一种治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物及其制备方法与流程

1.本发明属于药物新型给药系统研究领域，特别涉及一种治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物及其制备方法。


背景技术：

2.肾脏缺血再灌注损伤是肾脏组织缺血再灌注后，其组织细胞代谢障碍，从而导致肾脏结构和功能的破坏造成的急性肾损伤。近年研究发现，肾小管上皮细胞是急性肾损伤发生及发展的主要靶细胞。急性肾损伤可引起肾小管上皮细胞损伤、凋亡、坏死以及脱落，而肾小管内脱落的细胞易与尚未脱落的受激细胞通过粘附分子的相互作用，粘附成团，堵塞管腔，使管内压升高，进一步造成肾小球滤过率下降。其病理生理机制存在损伤级联反应，主要包括氧化应激、炎症反应、凋亡、细胞内钙超载等，其中氧化应激及其所诱导的细胞损伤、凋亡在急性肾损伤中的作用尤为瞩目。当呼吸链被抑制后再次恢复氧供时，线粒体会快速产生大量的ros，过度氧化应激和细胞内钙超载是导致线粒体通透性转换孔大量开放的主要原因。线粒体通透性转换孔的大量开放易引起线粒体外膜破裂，继而形成线粒体水肿，并且释放大量的促调亡因子，如细胞色素c。外渗的细胞色素c与caspase 9和apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可激活凋亡执行蛋白caspase 3，并最终导致细胞凋亡。
3.线粒体是ros产生和清除的主要场所，同时也是ros损伤的主要作用靶点。由于线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)缺乏保护性组蛋白，dna修复机制不完善，又紧邻呼吸链，对ros极其敏感，容易引起突变。而mtdna突变可引起氧化磷酸化功能受损产生大量ros，进一步促进mtdna突变，形成恶性循环，进而导致细胞氧供不足，出现线粒体功能障碍，而采用抗氧化剂预处理可提供肾缺血再灌注损伤的保护作用。因此，从逆转肾小管上皮细胞线粒体的氧化应激损伤过程入手，寻找一种有效的治疗riri的手段具有十分重要的研究价值与临床意义。
4.目前临床上抗氧化剂的品种很多，如姜黄素、维生素、氨基酸及其衍生物、ω-3多不饱和脂肪酸、褪黑素等，但总体疗效往往不尽如人意，这主要是由于所用药物均存在不同程度的肾外效应，进入机体后不能集中作用于受损靶细胞线粒体，即药物浓度过低，无法达到有效治疗浓度。因此，如何使尽可能多的抗氧化药物分布于肾脏组织，实现肾小管上皮细胞及胞内线粒体的主动靶向递送，提高治疗药物浓度，是急性肾损伤抗氧化治疗的关键。
5.褪黑素是一种由松果体分泌的吲哚类激素，具有许多重要的生物学功能，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除体内自由基等作用。近年研究表明褪黑素可通过抗氧化和抗炎等方式减轻缺血再灌注引起的急性肾损伤，还可通过与nlrc4炎性小体相互作用，调节急性肾损伤相关炎症反应。但其受限于半衰期短、体内易被代谢等问题，且其对肾脏组织细胞缺乏选择特异性，往往疗效不尽如人意。因此，有必要采用制剂手段从提高体内循环时间、改变药物体内分布等方面出发改善褪黑素用于缺血再灌注引起的急性肾损伤靶向抗氧化治疗效果。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种安全、高效的治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物、其制备方法及应用。
7.本发明的第一个目的是提供一种治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物，由(4-羧丁基)三苯基溴化膦、褪黑素和不同聚合度的透明质酸嫁接而成，高分子前体药物的化学结构式如下：
[0008][0009]
其中，n的取值范围为5～20。
[0010]
本发明的第二个目的是提供所述治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的制备方法，步骤如下：
[0011]
1)将(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到无水二甲基亚砜中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸水溶液，加热搅拌持续反应48小时后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，离心取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物；
[0012]
2)将(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热搅拌使反应物完全溶解，加入褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，离心取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物。
[0013]
作为优化。所述透明质酸的聚合度为5～20。
[0014]
本发明的第三个目的是提供所述治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的应用，作为原料用于制备治疗肾缺血再灌注损伤的药物。
[0015]
本发明的有益效果是：高分子前体药物属于聚合物疗法的范畴，其主要特征是将治疗药物通过共价键与亲水性大分子聚合物载体相连，这样会极大地改变原形药物的理化性质和体内行为。相比于游离药物，高分子前体药物能显著延长了血液循环间、改善组织分布和累积、提高药物的生物利用度。该类药物的设计一般需要遵循以下几个原则：1、化学键在细胞外应有足够的稳定性，以延长前药系统在体内的半衰期；2、一旦进入细胞内，化学键(在酸、碱、酶等条件下不稳定)应迅速被破坏降解，释出完整的药物分子；3、作为载体的聚
合物应在血液循环中有足够的稳定性。本发明基于高分子前体药物的上述特性，通过将褪黑素与亲水性大分子聚合物相连，改善药物体内半衰期和分布，实现褪黑素的肾小管上皮细胞主动靶向递送。
[0016]
黏附因子cd44在正常肾脏组织内表达较少，但在急性肾损伤发生时肾小管上皮细胞上表达异常增加，这为急性肾损伤的主动靶向治疗提供了可能。透明质酸是一种存在于细胞外基质和滑液中的具有生物相容性和生物可降解性的天然阴离子多糖，是黏附因子cd44的特异性配体之一，可与受体黏附因子cd44特异性结合以透明质酸为载体，将褪黑素靶向提送至肾脏损伤细胞中。考虑到肾损伤时肾功能的减弱，肾小管上皮细胞膜上的megalin-cubilin受体介导的内吞作用可能也随之下降，而cd44受体可特异性上调，进而可确保药物在肾小管上皮细胞中的有效分布。在此基础上，进一步进行线粒体靶向基团的修饰。三苯基膦是目前研究最为成功的线粒体靶向分子，其含有三个苯环可增加分子表面积，形成离域正电荷，可有效穿透线粒体双层疏水膜。在三苯基膦的作用下，将主动转运进入肾小管上皮细胞中的褪黑素进一步输送至线粒体以起到清除过多ros、改善线粒体通透性和肿胀，有效逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，实现对缺血再灌注引起的急性肾损伤的高效靶向治疗。本发明提供的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物，可以用于肾缺血再灌注损伤治疗。该高分子前体药物可通过透明质酸与肾小管上皮细胞表面特异性表达的cd44受体结合，增加褪黑素在肾小管上皮细胞内的分布；进入细胞的高分子前体药物在线粒体靶向分子(4-羧丁基)三苯基溴化膦的介导下，进一步增加褪黑素在靶细胞线粒体中的分布，通过降低线粒体产生的ros，有效逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤，实现对急性肾损伤的靶向治疗。
[0017]
所述(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物可靶向肾小管上皮细胞及胞内细胞器，提高药物在肾脏病灶的药物浓集量，从而提高药物治疗效率，本发明药物能从逆转肾小管上皮细胞的氧化应激损伤过程入手，获得一种安全、高效的缺血再灌注引起的急性肾损伤靶向治疗新途径。
附图说明
[0018]
图1为治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的合成路线图。
[0019]
图2为治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的核磁氢谱。
[0020]
图3为治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的肾小管上皮细胞靶向分布图片。
[0021]
图4为治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的线粒体靶向分布图片。
[0022]
图5为载荧光标记物吲哚菁绿的治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的体内分布图片。
[0023]
图6为治疗肾缺血再灌注损伤的逐级靶向高分子前体药物的药效学结果。
具体实施方式
[0024]
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
[0025]
下列各实施例中，逐级靶向高分子前体药物，即(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的制备方法，按照两步方法实现，其合成路线图如图1所示：首先通过(4-羧丁基)三苯基溴化膦上的羧基与透明质酸上羟基发生酯化反应合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物，其次褪黑素与(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物上的羧基发生酯化反应合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物。下面具体对其两步合成过程进行描述：
[0026]
1、(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物的合成
[0027]
称取88.6mg(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10ml无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸水溶液(含透明质酸总量400mg)，加热搅拌持续反应48小时，待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物。
[0028]
2、(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的合成
[0029]
取步骤1)中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，加入46.4mg褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，离心取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物。
[0030]
下面通过各实施例展示本发明的具体技术效果，以便于本领域技术人员更好地理解本发明。
[0031]
实施例1
[0032]
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的合成
[0033]
第一步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物，精密称取88.6mg(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10ml无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸(聚合度为5，200mg)水溶液，加热搅拌持续反应48小时，待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物。
[0034]
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物，取步骤1)中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入34.5mgn-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，加入46.4mg褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸与褪黑素的嫁接。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物的结构进行确证。
[0035]
实施例2
[0036]
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的合成
[0037]
第一步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物，精密称取88.6mg(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10ml无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸(聚合度为10，400mg)水溶液，加热搅拌持续反应48小时，待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物。
[0038]
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物，取步骤1)中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，加入46.4mg褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸与褪黑素的嫁接。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物的结构进行确证。
[0039]
实施例3
[0040]
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的合成
[0041]
第一步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物，精密称取88.6mg(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10ml无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸(聚合度为15，600mg)水溶液，加热搅拌持续反应48小时，待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物。
[0042]
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物，取步骤1)中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，加入46.4mg褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸与褪黑素的嫁接。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物的结构进行确证。
[0043]
实施例4
[0044]
1.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的合成
[0045]
第一步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物，精密称取88.6mg(4-羧丁基)三苯基溴化膦加入到10ml无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，然后向混合溶液中逐滴加入透明质酸(聚合度为20，800mg)水溶液，加热搅拌持续反应48小时，待反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析48h，收集透析袋中的混悬液，于14000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物。
[0046]
第二步合成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物，取步骤1)中的(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸嫁接物加入到无水二甲基亚砜中，再加入34.5mg n-羟
基琥珀酰亚胺、57.6mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，60℃加热搅拌使反应物完全溶解，加入46.4mg褪黑素，加热搅拌持续反应48小时后，完成(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸与褪黑素的嫁接。利用核磁共振仪对(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素嫁接物的结构进行确证。取(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物10mg溶于0.5ml氘代水中，使其最终浓度为20mg/ml，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱。结果如图2所示，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的核磁氢谱中可见(4-羧丁基)三苯基溴化膦与褪黑素特征峰(a，b)。
[0047]
2.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的细胞靶向性
[0048]
将人肾小管上皮细胞以5.0
×
104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，孵育24小时后，采用双氧水刺激细胞构建体外氧化应激损伤细胞模型，荧光探针异硫氰酸荧光素标记高分子前体药物，考察(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物在肾小管上皮细胞中的摄取差异。结果如图3所示，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物在氧化应激损伤细胞中的分布显著高于其在正常细胞中的分布，且游离透明质酸会竞争性影响(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的细胞摄取。
[0049]
3.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的细胞内线粒体靶向性
[0050]
将人肾小管上皮细胞以5.0
×
104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，孵育24小时，荧光探针异硫氰酸荧光素标记高分子前体药物，考察(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的线粒体分布特性，以未经(4-羧丁基)三苯基溴化膦修饰的透明质酸-褪黑素高分子前体药物为对照。孵育2h后，加入线粒体荧光探针溶液，染色30min，荧光倒置显微镜下观察高分子前体药物于线粒体共定位情况。结果如图4所示，相比于透明质酸-褪黑素高分子前体药物(p＝0.06)，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物(p＝0.91)于线粒体的共定位比例更高，线粒体靶向性更好。
[0051]
4.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的体内分布
[0052]
采用吲哚菁绿标记(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物的体内分布情况。采用无创动脉夹夹闭肾动脉构建缺血再灌注引起的急性肾损伤动物模型，高分子前体药物溶液0.2ml，注射后不同时间点处死动物，取各组织脏器于小动物活体成像仪下观察高分子前体药物在各组织脏器的荧光信号分布情况。结果如图5所示，高分子前体药物主要分布于肾脏组织，且肾脏的分布量要远高于其他各组织。
[0053]
5.(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物对急性肾损伤的治疗作用
[0054]
采用无创动脉夹夹闭肾动脉构建缺血再灌注引起的急性肾损伤动物模型后，尾静脉给药，评价肾功能变化及病理特征。将c57bl/6小鼠随机分为正常组、急性肾损伤组、急性肾损伤 褪黑素组、急性肾损伤 透明质酸-褪黑素高分子前体药物组和急性肾损伤 (4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物组，在给药24h后测定动物肾功能指标(血肌酐、尿素氮)并制备肾脏组织病理切片。结果如图6所示，(4-羧丁基)三苯基溴化膦-透明质酸-褪黑素高分子前体药物组模型动物肾功能(血肌酐、尿素氮)得到显著改善。
[0055]
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同
等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。