一种秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法与流程

1.本发明属于育种技术领域，具体涉及一种秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法。


背景技术：

2.柿(diospyroskakithunb.)为柿科(ebenaceae)，柿属(diospyros)植物，是重要的经济林树种，有“铁杆庄稼”之称。柿果实营养丰富，风味独特，可鲜食也可制成柿饼食用，柿蒂、柿根、柿叶等可入药，清热解毒、护肝降压，在食品、保健、医药和化工等领域具有重要的应用价值和广阔的开发前景。
3.柿绝大多数栽培品种为六倍体(2n＝6x＝90)，极少数品种为九倍体 (2n＝9x＝135)，九倍体柿实为种内三倍体，综合性状优良，如日本最优甜柿品种
‘
秋王’和主栽涩柿品种
‘
平核无’等均为九倍体品种，展现出极大的利用价值和发展潜力。我国柿品种繁多，但均为六倍体。
4.柿倍性育种目前多集中于利用2n配子创制九倍体方面，但2n配子诱导率不高，且授粉后存在胚乳不平衡导致胚胎败育的情况，导致九倍体诱导困难。十二倍体诱导方面也有相关研究，主要是通过秋水仙碱处理离体叶片获得十二倍体再生植株，但十二倍体组培苗由于单宁含量较高，存在生根困难，移栽成活率低等问题。而利用秋水仙碱处理种子诱导十二倍体，种子萌发后可直接长成幼苗，不存在再生根及移苗成活率的问题，是高效获得柿十二倍体的方法之一。
5.目前，关于秋水仙碱处理柿种子诱导十二倍体的相关研究未见报道。因此，提供一种秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法，该方法克服了传统秋水仙碱对未萌发的种子直接处理诱导效果极差的缺点，本发明方法采用秋水仙碱处理最佳萌发状态的种子，显著提高了柿多倍体的诱导效率。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法，该方法为：
8.s1、种子催芽：
9.s101、浸种：挑选健康饱满的柿种子，用温水浸泡3d，每天换水1 次，浸泡结束后晾干水分，得到浸种后的种子；
10.s102、消毒：将s101中得到的浸种后的种子用高锰酸钾溶液浸泡4h，然后用清水冲洗，晾干水分，得到消毒后的种子；
11.s103、激素处理：将s102中得到的消毒后的种子用浓度为1g/l的 ga3溶液浸泡15h，然后用清水冲洗；再用浓度为40mg/l的6-ba溶液浸泡3h后，用清水冲洗；最后用浓度为
100mg/l的2,4-d溶液浸泡30min 后，用清水冲洗，晾干水分，得到激素处理后的种子；
12.s104、沙藏种子催芽：筛出沙中的杂质后，用800倍稀释的菌必清溶液进行喷湿消毒，得到消毒后的沙子；在温室地面上铺一层消毒后的粗沙，将s103中得到的激素处理后的种子散开平铺在所述消毒后的粗沙上，再覆盖一层消毒后的中沙，然后在保温保湿的条件下进行沙藏；所述沙藏的过程中，每隔1d观察所述消毒后的粗沙和所述消毒后的中沙的湿度，所述沙藏10d后，第一次检查所述激素处理后的种子的萌发情况，随后每天检查一次，直至所述激素处理后的种子萌发，最终得到萌发的种子；
13.s2、秋水仙碱处理种子：将s104中得到的萌发的种子用秋水仙碱避光浸泡24h，然后用清水冲洗，得到处理过的种子；
14.s3、播种育苗：将土、基质和蛭石按质量比为5:3:2的比例混合，翻拌均匀后得到混合土并装入营养钵内，然后将s2中得到的处理过的种子的种跟斜向下放入所述营养钵中，再覆一层所述混合土将所述处理过的种子掩盖住；播种完后浇透水，然后搭建拱棚进行保温保湿处理，定期观察所述处理过的种子的发芽情况，破土后若有种皮难脱落的情况，需要人为剥落种子，使其子叶展开，观察所述拱棚内的温度及湿度，及时补水降温，保证小苗正常生长。
15.优选地，s101中所述温水的温度为37℃；s102中所述高锰酸钾溶液的质量分数为0.2％。
16.优选地，s104中所述消毒后的粗沙的厚度为10cm，粒径为0.5mm～1 mm；所述消毒后的中沙的厚度为5cm，粒径为0.25mm～0.5mm。
17.优选地，s104中所述保温保湿的温度≥25℃，湿度为50％。
18.优选地，s2中所述秋水仙碱的浓度为0.1％。
19.优选地，s3中所述处理过的种子的种跟长度为0.1cm～0.5cm。
20.优选地，s3中所述拱棚内的温度为25℃～30℃，湿度为60％。
21.本发明与现有技术相比具有以下优点：
22.1、目前柿多倍体育种技术，主要集中在2n配子的诱导和利用，以及秋水仙碱处理离体组织诱导多倍体方面，在利用种子为材料进行多倍体创制方面未见报道。且其他物种利用秋水仙碱处理种子诱导多倍体时，多数是对未萌发的种子进行处理，而柿种子种皮和胚乳组织较厚，未萌发时直接处理诱导效果极差，因此本发明在秋水仙碱处理的最适时期(即柿种子的最佳萌发状态)，以及最适秋水仙碱浓度和处理时间等条件上进行了创新与优化，显著提高了柿多倍体的诱导效率。
23.2、本发明柿种子经过激素处理、沙藏种子催芽和秋水仙碱处理种子的结合处理，多倍体柿的诱导效率可达到13％，且种子萌发后处理的成苗率高(》95％)，不存在组培苗生根难、移苗成活率低等问题，显著提高了柿的倍性育种效率。
24.下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
附图说明
25.图1是实施例1中流式细胞仪法倍性鉴定图。
具体实施方式
26.实施例1
27.本实施例的秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法，该方法为：
28.s1、种子催芽：
29.s101、浸种：挑选健康饱满的柿种子，用37℃的温水浸泡3d，所述温水自然冷却，每天换水1次，浸泡结束后晾干水分，得到浸种后的种子；
30.s102、消毒：将s101中得到的浸种后的种子用质量分数为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4h，然后用清水冲洗，晾干水分，得到消毒后的种子；
31.s103、激素处理：将s102中得到的消毒后的种子用浓度为1g/l的 ga3溶液浸泡15h，然后用清水冲洗；再用浓度为40mg/l的6-ba溶液浸泡3h后，用清水冲洗；最后用浓度为100mg/l的2,4-d溶液浸泡30min，清水冲洗后，晾干水分，得到激素处理后的种子；
32.s104、沙藏种子催芽：筛出沙中的杂质后，用800倍稀释的菌必清溶液对沙进行喷湿消毒，得到消毒后的沙子；在温室(25℃)地面上铺一层厚度为10cm的消毒后的粗沙，将s103中得到的激素处理后的种子散开平铺在所述消毒后的粗沙上，再覆盖一层厚度为5cm的消毒后的中沙，然后用塑料布搭建拱棚进行保温保湿，在保温保湿的条件下进行沙藏，保持所述沙藏的温度为25℃，湿度为50％；所述沙藏的过程中，每隔1d观察沙子湿度，以手握沙子可以聚拢，放手后沙子可以散开为最佳湿度状态，及时补水；所述沙藏10d后，第一次检查所述激素处理后的种子的萌发情况，随后每天检查一次，直至所述激素处理后的种子萌发，最终得到萌发的种子；所述萌发的种子的种跟长度为0.1cm～0.5cm；所述消毒后的粗沙的粒径为0.5mm；所述消毒后的中沙的粒径为0.25mm；
33.s2、秋水仙碱处理种子：将s104中得到的萌发的种子用浓度为0.1％的秋水仙碱避光浸泡24h，然后用清水冲洗，得到处理过的种子；
34.s3、播种育苗：将土、基质和蛭石按质量比为5:3:2的比例混合，翻拌均匀后得到混合土并装入营养钵内，然后将s2中得到的处理过的种子的种跟斜向下放入所述营养钵内的所述混合土中，再覆一层厚度为1cm的所述混合土将所述处理过的种子掩盖住；播种完后浇透水，然后搭建拱棚做保温保湿处理，定期观察所述处理过的种子的发芽情况，破土后若有种皮难脱落的情况，需要人为剥落种子，使其子叶展开，观察所述拱棚内的温度及湿度，及时补水降温，保持所述拱棚内的温度为25℃，湿度为60％，保证小苗正常生长。
35.待小苗长出多片真叶后，采取新展出的嫩叶叶片0.5cm2，置于培养皿中，取400μl的裂解液(cystainuvpr250tests试剂盒，型号5002-02) 加于叶片上，用刀片将叶片切碎，横向充分切碎后，纵向充分切碎，裂解萃取3min，向切碎的叶片中加入dapi染液1600μl，避光染色1min，将培养皿中的液体用30μm的滤网过滤至样品管中，用cyflowspace型流式细胞仪进行倍性鉴定，结果如图1所示。出峰位置对应基因组大小，r2 峰为六倍体柿，r3峰为本实施例中经秋水仙碱处理后诱导出的十二倍体柿。
36.对比例1
37.本对比例中处理种子的高效诱导柿多倍体的方法与实施例1相同，其不同之处在于，未进行实施例1中的s104步骤，只得到激素处理后的种子，即未萌发的种子。
38.将实施例1s104中得到的萌发的种子和对比例1中未萌发的种子进行秋水仙碱处理，设置多个处理组合，如表1所示。
39.表1不同处理组合诱导十二倍体结果统计
[0040][0041][0042]
可见，对未萌发的种子进行处理，秋水仙碱使用浓度和处理时间同本发明方法一致，但由于柿种子本身萌发不是百分百的，会有一定比例的种子正状态下也不会萌发，所以成苗较低，而且柿种子种皮和胚乳组织较厚，直接处理的话，秋水仙碱难以直接作用到种子中心的胚，多倍体诱导率极低。
[0043]
实施例1中多倍体柿的诱导效率达13％，且种子萌发后处理的成苗率为100％，不存在组培苗生根难、移苗成活率低等问题，显著提高了柿的倍性育种效率。
[0044]
对比例2
[0045]
本对比例中处理种子的高效诱导柿多倍体的方法与实施例1相同，其不同之处在于，设置3个因素(ga3、6-ba和2,4-d)，每个因素设置4 个水平，按照l16(43)做正交试验，分别处理s102中得到的消毒后的种子，沙藏催芽后进行秋水仙碱处理和播种，统计各处理组合的发芽率；结果如表2所示，处理组合15发芽率最高，即用1000mg/lga3处理15h，再用40mg/l的6-ba处理3h，最后再用100mg/l2,4-d处理30min，种子的萌发效果最好，发芽率为64％。
[0046]
表2不同激素浓度处理种子发芽率统计
[0047]
[0048][0049]
实施例2
[0050]
本实施例的秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法，该方法为：
[0051]
s1、种子催芽：
[0052]
s101、浸种：挑选健康饱满的柿种子，用37℃的温水浸泡3d，所述温水自然冷却，每天换水1次，浸泡结束后晾干水分，得到浸种后的种子；
[0053]
s102、消毒：将s101中得到的浸种后的种子用质量分数为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4h，然后用清水冲洗，晾干水分，得到消毒后的种子；
[0054]
s103、激素处理：将s102中得到的消毒后的种子用浓度为1g/l的 ga3溶液浸泡15h，然后用清水冲洗；再用浓度为40mg/l的6-ba溶液浸泡3h，清水冲洗；最后用浓度为100mg/l的2,4-d溶液浸泡30min，清水冲洗后，晾干水分，得到激素处理后的种子；
[0055]
s104、沙藏种子催芽：筛出沙中的杂质后，用800倍稀释的菌必清溶液对沙进行喷湿消毒，得到消毒后的沙子；在温室(24℃)地面上铺一层厚度为10cm的消毒后的粗沙，将s103中得到的激素处理后的种子散开平铺在所述消毒后的粗沙上，再覆盖一层厚度为5cm的消毒后的中沙，然后用塑料布搭建拱棚进行保温保湿，在保温保湿的条件下进行沙藏，保持所述沙藏的温度为27℃，湿度为50％；所述沙藏的过程中，每隔1d观察沙子湿度，以手握沙子可以聚拢，放手后沙子可以散开为最佳湿度状态，及时补水；所述沙藏10d后，第一次检查所述激素处理后的种子的萌发情况，随后每天检查一次，直至所述激素处理后的种子萌发，最终得到萌发的种子；所述萌发的种子的种跟长度为0.1cm～0.5cm；所述消毒后的粗沙的粒径为1mm；所述消毒后的中沙的粒径为0.5mm；
[0056]
s2、秋水仙碱处理种子：将s104中得到的萌发的种子用浓度为0.1％的秋水仙碱避光浸泡24h，然后用清水冲洗，得到处理过的种子；
[0057]
s3、播种育苗：将土、基质和蛭石按质量比为5:3:2的比例混合，翻拌均匀后得到混合土并装入营养钵内，然后将s2中得到的处理过的种子的种跟斜向下放入所述营养钵内的
所述混合土中，再覆一层厚度为1cm的所述混合土将所述处理过的种子掩盖住；播种完后浇透水，然后搭建拱棚做保温保湿处理，定期观察所述处理过的种子的发芽情况，破土后若有种皮难脱落的情况，需要人为剥落种子，使其子叶展开，观察所述拱棚内的温度及湿度，及时补水降温，保持所述拱棚内的温度为30℃，湿度为60％，保证小苗正常生长。
[0058]
实施例3
[0059]
本实施例的秋水仙碱处理种子高效诱导柿多倍体的方法，该方法为：
[0060]
s1、种子催芽：
[0061]
s101、浸种：挑选健康饱满的柿种子，用37℃的温水浸泡3d，所述温水自然冷却，每天换水1次，浸泡结束后晾干水分，得到浸种后的种子；
[0062]
s102、消毒：将s101中得到的浸种后的种子用质量分数为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4h，然后用清水冲洗，晾干水分，得到消毒后的种子；
[0063]
s103、激素处理：将s102中得到的消毒后的种子用浓度为1g/l的 ga3溶液浸泡15h，然后用清水冲洗；再用浓度为40mg/l的6-ba溶液浸泡3h，清水冲洗；最后用浓度为100mg/l的2,4-d溶液浸泡30min，清水冲洗后，晾干水分，得到激素处理后的种子；
[0064]
s104、沙藏种子催芽：筛出沙中的杂质后，用800倍稀释的菌必清溶液对沙进行喷湿消毒，得到消毒后的沙子；在温室(23℃)地面上铺一层厚度为10cm的消毒后的粗沙，将s103中得到的激素处理后的种子散开平铺在所述消毒后的粗沙上，再覆盖一层厚度为5cm的消毒后的中沙，然后用塑料布搭建拱棚进行保温保湿，在保温保湿的条件下进行沙藏，保持所述沙藏的温度为28℃，湿度为50％；所述沙藏的过程中，每隔1d观察沙子湿度，以手握沙子可以聚拢，放手后沙子可以散开为最佳湿度状态，及时补水；沙藏10d后，第一次检查所述激素处理后的种子的萌发情况，随后每天检查一次，直至所述激素处理后的种子萌发，最终得到萌发的种子；所述萌发的种子的种跟长度为0.1cm～0.5cm；所述消毒后的粗沙的粒径为 0.7mm；所述消毒后的中沙的粒径为0.35mm；
[0065]
s2、秋水仙碱处理种子：将s104中得到的萌发的种子用浓度为0.1％的秋水仙碱避光浸泡24h，然后用清水冲洗，得到处理过的种子；
[0066]
s3、播种育苗：将土、基质和蛭石按质量比为5:3:2的比例混合，翻拌均匀后得到混合土并装入营养钵内，然后将s2中得到的处理过的种子的种跟斜向下放入所述营养钵内的所述混合土中，再覆一层厚度为1cm的所述混合土将所述处理过的种子掩盖住；播种完后浇透水，然后搭建拱棚做保温保湿处理，定期观察所述处理过的种子的发芽情况，破土后若有种皮难脱落的情况，需要人为剥落种子，使其子叶展开，观察所述拱棚内的温度及湿度，及时补水降温，保持所述拱棚内的温度为27℃，湿度为60％，保证小苗正常生长。
[0067]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。