用于整合原位空间测定的方法和组合物与流程

技术特征：
1.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：(a)使基底上的生物样品与一个或多个核酸探针接触，所述一个或多个核酸探针直接或间接地与所述生物样品中的第一靶核酸或其互补序列或扩增产物杂交，其中所述基底包含直接或间接地固定在其上的多种捕获剂，其中所述多种捕获剂中的一种捕获剂包含(i)能够捕获核酸的捕获结构域和(ii)对应于所述捕获剂在所述基底上的位置的空间条形码；(b)在所述生物样品的空间位置处检测所述一个或多个核酸探针；(c)提供允许所述捕获剂直接或间接地捕获第二靶核酸或其互补序列或扩增产物的条件；以及(d)产生空间标记的多核苷酸，所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述第二靶核酸的序列或其互补序列和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列。2.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：(a)使第一基底上的生物样品与一个或多个核酸探针接触，所述一个或多个核酸探针直接或间接地与所述生物样品中的第一靶核酸或其互补序列或扩增产物杂交；(b)在所述生物样品的空间位置处检测所述一个或多个核酸探针；(c)提供允许多种捕获剂直接或间接地捕获第二靶核酸或其互补序列或其扩增产物的条件，其中所述多种捕获剂中的一种捕获剂包含：(i)能够捕获所述第二靶核酸的捕获结构域，和(ii)空间条形码；以及(d)产生空间标记的多核苷酸，所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述第二靶核酸的序列或其互补序列和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列。3.如权利要求2所述的方法，其中所述多种捕获剂直接或间接地连结至所述第一基底或第二基底。4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述空间条形码对应于所述捕获剂在所述第一基底或在第二基底上的位置。5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)之前，将包含所述多种捕获剂的第二基底提供给所述生物样品。6.一种分析生物样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：(a)使第一基底上的生物样品与一个或多个核酸探针接触，所述一个或多个核酸探针直接或间接地与所述生物样品中的第一靶核酸或其互补序列或扩增产物杂交；(b)在所述生物样品的空间位置处检测所述一个或多个核酸探针；(c)提供允许多种捕获剂直接或间接地捕获第二靶核酸或其互补序列或其扩增产物的条件，其中所述多种捕获剂直接或间接地连结至所述第一基底或第二基底，并且其中所述多种捕获剂中的一种捕获剂包含：(i)能够捕获核酸的捕获结构域，和(ii)对应于所述捕获剂在所述第一基底或在所述第二基底上的位置的空间条形码；以及(d)产生空间标记的多核苷酸，所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述第二靶核酸的序列或其互补序列和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸包含相同的核酸序列。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸包含不同的核酸序列。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸是相同的分子或不同的分子。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第二靶核酸是或包含所述第一靶核酸、其序列、其互补序列、其杂交产物、其连接产物、其延伸产物、其复制产物、其转录/逆转录产物和/或其扩增产物。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第二靶核酸是或包含所述一个或多个核酸探针中的至少一个、所述核酸探针的互补序列、所述核酸探针的杂交产物、所述核酸探针的连接产物、所述核酸探针的延伸产物、所述核酸探针的复制产物、所述核酸探针的转录/逆转录产物和/或核酸探针的扩增产物。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸包含rna序列，任选地其中所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸是mrna分子。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品在步骤(a)之前或期间可逆地交联。14.如权利要求13所述的方法，其中步骤(c)中提供的所述条件包括使所述可逆交联的生物样品去交联。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中提供的所述条件包括从所述生物样品中释放所述第二靶核酸或其互补序列或其扩增产物。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中提供的所述条件包括使所述生物样品中的所述第二靶核酸或其互补序列或其扩增产物与所述基底(或所述第一基底)或所述第二基底的所述捕获剂接触。17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中提供的所述条件包括从所述基底(或所述第一基底)或从所述第二基底释放所述多种捕获剂，和/或将所述释放的多种捕获剂朝向所述生物样品递送或驱动和/或递送或驱动到所述生物样品之中或之上。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多种捕获剂包括可释放地偶联至分析物捕获剂的捕获剂。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中对经加工或清除的生物样品进行步骤(b)。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含组织样品。21.如权利要求20所述的方法，其中所述组织样品是厚度介于约1μm与约50μm之间的组织切片，任选地其中所述组织切片的厚度介于约5μm与约35μm之间。22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述组织样品被包埋在水凝胶中。23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸、其互补序列和/或其扩增产物与基质例如水凝胶可逆地交联。24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述一个或多个核酸探针中的至少一个包含指示所述第一靶核酸中的序列或其互补序列的条形码序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中检测所述一个或多个核酸探针包括对所述生物样品进行成像。26.如权利要求24或25所述的方法，其中在步骤(b)中，确定所述条形码序列的序列或其互补序列或其经扩增序列。27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括多个探针的原位测序和/或顺序杂交。28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述一个或多个核酸探针包括直接与所述第一靶核酸或其互补序列或扩增产物杂交的初级探针。29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一靶核酸是mrna，所述互补序列是cdna，和/或所述扩增产物是滚环扩增(rca)产物。30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述初级探针包括挂锁探针、环状探针或环化探针。31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述初级探针包含一个或多个条形码序列，所述一个或多个条形码序列任选地对应于所述第一靶核酸的序列。32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使所述生物样品与能够直接或间接地与所述初级探针(或其互补序列或扩增产物)杂交的一个或多个可检测标记的探针接触，任选地其中所述一个或多个可检测标记的探针与所述初级探针(或其互补序列或扩增产物)的一个或多个条形码序列杂交。33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使所述生物样品与能够直接或间接地与所述初级探针(或其互补序列或扩增产物)杂交的一个或多个二级探针接触，任选地其中所述一个或多个二级探针与所述初级探针(或其互补序列或扩增产物)的一个或多个条形码序列杂交。34.如权利要求33所述的方法，其中步骤(b)还包括使所述生物样品与能够直接或间接地与所述一个或多个二级探针(或其互补序列或扩增产物)杂交的一个或多个可检测标记的探针接触，任选地其中所述一个或多个可检测标记的探针与所述一个或多个二级探针(或其互补序列或扩增产物)的一个或多个条形码序列杂交。35.如权利要求31-34中任一项所述的方法，所述方法包括对所述生物样品成像以对所述初级探针(或其互补序列或扩增产物)的所述一个或多个条形码序列和/或所述一个或多个二级探针(或其互补序列或扩增产物)的所述一个或多个条形码序列进行测序，任选地其中所述测序包括连接法测序或杂交测序。36.如权利要求24-35中任一项所述的方法，所述方法还包括产生包含所述条形码序列的序列或其互补序列的扩增产物。37.如权利要求36所述的方法，其中所述扩增产物通过滚环扩增产生。38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述扩增产物包含一个或多个经修饰的核苷酸。39.如权利要求27-38中任一项所述的方法，其中所述原位测序包括连接法测序。40.如权利要求27-39中任一项所述的方法，其中所述原位测序包括杂交测序。41.如权利要求25-40中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述成像之后使所述基底上的所述生物样品透化。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述第二靶核酸是mrna分子，并且所述捕获剂包含捕获探针。43.如权利要求42所述的方法，其中所述捕获探针包含游离3'端，使得所述捕获探针使用所述第二靶核酸作为引物延伸的模板而用作逆转录酶(rt)引物。44.如权利要求43所述的方法，其中所述游离3'端包含寡聚dt、随机序列或基因特异性序列。45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述捕获探针还包含位于所述空间条形码5'的通用结构域，其中所述通用结构域包含：(i)扩增结构域；和/或(ii)用于从所述基底的表面释放所述产生的空间标记的多核苷酸的裂解结构域。46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述产生的空间标记的多核苷酸是cdna或其扩增产物。47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前，所述捕获结构域不捕获所述第一靶核酸、其互补序列或其扩增产物。48.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在使所述可逆交联的生物样品去交联之前，所述捕获结构域不捕获所述第一靶核酸、其互补序列或其扩增产物。49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述捕获剂通过杂交、通过连接或通过杂交、然后连接例如通过夹板连接来捕获所述第二靶核酸或其互补序列或其扩增产物。50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述捕获剂捕获所述一个或多个核酸探针或其互补序列或其扩增产物。51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述捕获剂捕获与所述第一靶核酸杂交的所述一个或多个核酸探针。52.如权利要求51所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前释放与所述第一靶核酸杂交的所述一个或多个核酸探针。53.如权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述一个或多个核酸探针的核酸探针的序列或其互补序列和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列。54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述空间标记的多核苷酸或其一部分被释放(例如，从所述第一或第二基底)以用于分析。55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述空间标记的多核苷酸或其互补序列的至少一部分。56.如55所述的方法，其中所述确定包括连接法测序、杂交测序、合成法测序和/或结合测序。57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述经释放的空间标记的多核苷酸通过直接测序或间接测序进行分析，任选地在所述测序之前进行扩增。58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述空间标记的多核苷酸的所述空间条形码与所述一个或多个核酸探针的检测到的空间位置相关联。59.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：(a)使所述生物样品与第一核酸探针和第二核酸探针接触，其中所述第一核酸探针和
所述第二核酸探针未固定在人工基底上；(b)在所述生物样品中原位产生滚环扩增(rca)产物，所述rca产物包含所述第一核酸探针的序列或其互补序列；(c)在第一基底上的所述生物样品的空间位置处检测与所述rca产物相关的信号(例如，荧光信号)；(d)提供允许多种捕获剂直接或间接地捕获所述第二核酸探针和/或其产物的条件，其中所述多种捕获剂直接或间接地连结至所述第一基底或第二基底，并且其中所述多种捕获剂中的一种捕获剂包含：(i)能够捕获核酸的捕获结构域，和(ii)对应于所述捕获剂在所述第一基底或在所述第二基底上的位置的空间条形码；以及(e)产生空间标记的多核苷酸，所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述第二核酸探针的序列和/或其产物和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列，其中所述方法不包括检测所述第一基底上或所述第二基底上的所述空间标记的多核苷酸。60.如权利要求59所述的方法，其中所述第一核酸探针和所述第二核酸探针靶向相同或不同的分析物和/或结合至所述生物样品中的相同或不同的分子。61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述方法不包括产生包含所述第二核酸探针的序列或其互补序列的rca产物。62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在所述第一基底上或所述第二基底上的空间位置处检测与所述第二核酸探针或其产物相关的信号(例如，荧光信号)。63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，所述方法还包括：(f)从所述第一基底或所述第二基底除去所述空间标记的多核苷酸，其中在所述除去步骤之后确定所述空间标记的多核苷酸的序列。64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述第一核酸探针包含挂锁探针，所述挂锁探针任选地包含一个或多个条形码序列。65.如权利要求59-64中任一项所述的方法，其中所述第二核酸探针包含与所述生物样品中的rna或dna(例如，cdna)分子杂交的两个或更多个探针，其中所述两个或更多个探针任选地包含一个或多个条形码序列。66.如权利要求65所述的方法，其中所述两个或更多个探针与所述生物样品中的mrna分子杂交，或者其中所述两个或更多个探针与所述第一核酸探针(例如，挂锁探针)或其产物杂交。67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述方法还包括连接与所述rna或dna分子杂交的所述两个或更多个探针以产生连接的第二核酸探针。68.如权利要求67所述的方法，其中所述连接的第二核酸探针被所述捕获剂捕获，任选地其中所述连接是rna模板化或dna模板化反应。69.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：(a)使第一基底上的所述生物样品与第一核酸探针和第二核酸探针接触，其中所述第
一探针和所述第二核酸探针未固定在人工基底上；(b)在所述生物样品中原位产生滚环扩增(rca)产物，所述rca产物包含所述第一核酸探针的序列或其互补序列；(c)提供允许多种捕获剂直接或间接地捕获所述第二核酸探针和/或其产物的条件，其中所述多种捕获剂直接或间接地连结至所述第一基底或第二基底，并且其中所述多种捕获剂中的一种捕获剂包含：(i)能够捕获核酸的捕获结构域，和(ii)对应于所述捕获剂在所述第一基底或在所述第二基底上的位置的空间条形码；以及(d)产生空间标记的多核苷酸，所述空间标记的多核苷酸包含(i)所述第二核酸探针的序列和/或其产物和(ii)所述空间条形码的序列或其互补序列，其中在所述第一基底上的所述生物样品的空间位置处检测与所述rca产物相关的信号(例如，荧光信号)，并且从所述第一基底或所述第二基底除去所述空间标记的多核苷酸以确定所述空间标记的多核苷酸的序列。70.如权利要求69所述的方法，所述方法还包括：(e)在所述第一基底上的所述生物样品的所述空间位置处检测与所述rca产物相关的所述信号(例如，荧光信号)。71.如权利要求69或70所述的方法，所述方法还包括：(f)从所述第一基底或所述第二基底除去所述空间标记的多核苷酸以确定所述空间标记的多核苷酸的序列。72.如权利要求63或权利要求71所述的方法，所述方法还包括使用连接法测序、杂交测序、合成法测序和/或结合测序来确定所述除去的空间标记的多核苷酸的所述序列或其互补序列。73.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述连接是rna模板化或dna模板化反应。

技术总结
本文提供了一种生物样品的整合测定，所述整合测定包括原位测定模块和空间测定模块。所述原位测定包括分析在所述生物样品的空间位置处核酸探针与第一分析物的结合。所述方法还包括提供允许带空间条形码的捕获剂捕获第二分析物以在所述空间测定模块中进行分析的条件。件。件。


技术研发人员：F
受保护的技术使用者：10X基因组学有限公司
技术研发日：2021.02.19
技术公布日：2023/2/3