一种人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法

1.本发明涉及细菌培养技术领域，具体涉及一种人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法。


背景技术：

2.拟杆菌属(bacteroides)是革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌，又称类杆菌属。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。其培养需一种能模拟人体环境的培养基及相应模拟人体内的温度及厌氧环境的培养环境。
3.人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的数量可以有效的反应人体内砷暴露的情况以及人体内代谢砷的能力，通过对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的菌群数量测试可以指导砷暴露病人的精准治疗。现有技术通常是通过测量血液及尿液的砷含量，以指导砷暴露病人的治疗，但是血液及尿液的砷含量并不能精确反映病人本身的砷代谢能力。所以，采用人体肠道专性厌氧菌拟杆菌作为人体砷代谢能力的评价指标，可以对现有技术的方法形成有效补充。对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌进行研究以及数量测试，首先需要对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌进行有效地体外培养。亟需研究一种专门针对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法，以解决现有技术中缺少专门针对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法，包括以下依次进行的步骤：
7.s1：配制固体培养基，将人体肠道专性厌氧菌拟杆菌接种于固体培养基中，再经厌氧培养，获得单菌落；所述固体培养基为含有兔血的胰酶大豆肉汤固体培养基；
8.s2：配制液体培养基，挑取单菌落接种于液体培养基中，再经厌氧培养，获得菌液；所述液体培养基为含有胎牛血清的施耐德昆虫细胞液体培养基。
9.本技术方案还提供了用于人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养的培养基，其特征在于：包括用于活化菌种的固体培养基和用于扩增培养的液体培养基；所述固体培养基中含有5％的兔血、3％的胰酶大豆肉汤预制粉和1.5％的琼脂；所述液体培养基为含有20％热灭活胎牛血清的施耐德昆虫细胞培养基。
10.本方案的原理及优点是：
11.采用本发明的培养基以及培养方法可以对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌进行有效地体外培养。并且，这些培养基不仅可以培养人体肠道专性厌氧菌拟杆菌，而且成本低廉，降低了实验费用，同时可用于培养其他的人体肠道细菌。所述培养方法，操作简单，降低了实验难度的同时，提高了成活率。
12.在本技术方案中，除了保证厌氧环境对于厌氧菌的培养非常关键，培养基的具体
类型的选取，也对培养成功以及提升细菌活性和生物量非常关键。固体培养基为含有兔血的胰酶大豆肉汤固体培养基，液体培养基为含有胎牛血清的施耐德昆虫细胞液体培养基，这是发明人经过大量实验尝试的最优选择。固体培养中加入兔血以及采用胰酶大豆肉汤固体培养基，对于活化菌株以及提升细菌繁殖量非常关键。将兔血替换为胎牛血清，以及将胰酶大豆肉汤固体培养基替换为脑心浸液固体培养基或者lb固体培养基，都不能充分活化菌株以及提升细菌繁殖量。液体培养中加入灭活胎牛血清以及采用液体施耐德昆虫细胞培养基，提升细菌增殖活性以及繁殖量非常关键。不使用灭活胎牛血清，以及将液体施耐德昆虫细胞培养基替换为胰酶大豆肉汤液体培养基、脑心浸液固体培养基或者lb固体培养基，都不能充分提升细菌增殖活性以及繁殖量。
13.进一步，在s1中，所述固体培养基中含有5％的兔血、3％的胰酶大豆肉汤预制粉和1.5％琼脂。上述兔血条件量保证了细菌的充分活化，发明人尝试过添加更少量的兔血，但是，这会一定程度上影响细菌生长状态，已经影响后续液体培养基中的细菌扩增量。
14.进一步，在s2中，所述液体培养基中含有20％的热灭活胎牛血清。胎牛血清为细菌生长提供营养以及生长因子。20％的热灭活胎牛血清可以保证厌氧菌获得充分的生长活性。发明人曾经尝试过5％和10％的热灭活胎牛血清添加量，但是，在培养24h之后，发现细菌生物量远远低于添加20％的热灭活胎牛血清的情形。
15.进一步，在s1中，厌氧培养在放置有厌氧产气袋的密闭的厌氧培养罐中进行，温度为37℃，时长为36小时。上述厌氧培养的温度、时间可保证细菌充分繁殖生长。
16.进一步，在s2中，厌氧培养在放置有厌氧产气袋的密闭的厌氧培养罐中进行，温度为37℃，时长为24小时，并且维持70rpm转速；获得菌液的od值≥0.6。上述厌氧培养的温度、时间、转速可保证细菌充分繁殖生长，并获得理想的菌液od值。
17.进一步，在s1和s2中，固体培养基和液体培养基均经过厌氧处理。对固体培养基和液体培养基进行厌氧处理，以保证培养基中的厌氧环境，促进人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的生长。
18.进一步，厌氧处理的固体培养基或者液体培养基的方法为：将固体培养基或者液体培养基置于放置有厌氧产气袋的密闭的厌氧培养罐中，在37℃条件下持续至少4h。37℃条件下持续至少4h，可保证在培养基中营造适合人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧气氛。
19.进一步，厌氧产气袋每24小时更换一次。定时更换厌氧产气袋以保证密闭的厌氧培养罐中的厌氧环境，促进人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的生长。
20.进一步，人体肠道专性厌氧菌拟杆菌为bacteroides vulgatus，保藏号为atcc 8482。本技术方案以普通拟杆菌(bacteroides vulgatus，atcc 8482)为例对本技术方案的培养方法进行了说明，除了普通拟杆菌外，本技术方案的培养方法还适合于其他类型的人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的培养。
附图说明
21.图1为现有技术的装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧培养罐。
22.图2为实施例1的人体肠道专性厌氧菌拟杆菌在固体培养基上厌氧培养后获得的典型细菌生长状态图像。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
24.附图标记具体如下：固定锁1、装填罐体2、厌氧产气袋3、培养皿4、密封盖5、钯颗粒容纳腔6、亚甲基蓝厌氧指示袋7。
25.实施例1：
26.本实施例展示了对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌(bacteroides vulgatus，atcc 8482)进行厌氧培养的设备和方法。本技术方案使用常规的厌氧培养罐进行细菌培养，厌氧培养罐(图1)包括装填罐体2，装填罐体2上盖有密封盖5，密封盖5通过固定锁1固定且密封在装填罐体2上。装填罐体2上方设有钯颗粒容纳腔6，用于催化装填罐体2中的氧气形成水(用于移除氧气)。装填罐体2的底部放置有厌氧产气袋3，用于缓慢释放二氧化碳和氢气。本技术方案中具体采用厌氧产气袋gaspak
tm
。含有培养基的培养皿4堆叠放置于装填罐体2底部。在装填罐的底部还放置有亚甲基蓝厌氧指示袋7，用于指示厌氧环境。
27.人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的培养基为琼脂平板培养基，由血和胰蛋白酶大豆肉汤制成，所述制好的平板培养基放在装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧培养罐进行厌氧处理4小时(37℃)。所述一种人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的厌氧培养方法如下：
28.(1)准备接种菌株的固体培养基：培养基用蒸馏水配制，其中含有质量百分数为3％的胰酶大豆肉汤(tryptic soy broth，tsb，胰酶大豆肉汤预制粉末，thermo fisher scientific，r111870)、质量百分数为1.5％的琼脂(thermo fisher scientific，22700025)和质量百分数为5％的兔血(thermo fisher scientific，k0761)。胰酶大豆肉汤预制粉末、兔血和琼脂均可以通过商业手段购置。固体培养基配制时，先将胰蛋白酶大豆肉汤和琼脂溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，待冷却后，在无菌条件下加入兔血，混匀后倒平板，获得琼脂平板培养基。
29.制好的琼脂平板培养基放在装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧培养罐进行厌氧处理4小时(37℃)，厌氧处理过程中培养皿盖不完全盖合，以维持固体培养基和外部厌氧气氛的接触。为了恢复菌株(-80℃冷冻保存的甘油菌)，菌株先接种(即常规划线接种)于经过厌氧预处理的上述固体培养基中。
30.(2)接种细菌后的培养皿在装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧瓶中37℃生长36小时。此过程中24小时更换一次厌氧产气袋gaspak
tm
，更换厌氧产气袋操作过程全程通氮气，培养后获得的典型细菌生长状态图像参见图2。
31.(3)转移固体培养基上的拟杆菌单个菌落至液体培养基中，每个单菌落对应15ml液体培养基。液体培养基为厌氧处理过的含有体积百分数20％的热灭活胎牛血清的schneider's insect medium(施耐德昆虫细胞培养基)。厌氧处理同s1，即将配好的液体培养基放入可通气试管(即试管盖不盖紧)中，在装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧罐中厌氧处理4小时或者更长时间。热灭活胎牛血清(thermo fisher scientific，26170043)和施耐德昆虫细胞培养基(himedia，iml003a，1
×
液体施耐德昆虫细胞培养基)均可以通过商业途径购置。在现有技术中，施耐德昆虫细胞液体培养基用于体外培养果蝇细胞和组织。在本技术方案中，该培养基被用于对人体肠道专性厌氧菌拟杆菌的培养，获得了理想的效果。
32.(4)液体培养基中的拟杆菌，装有厌氧产气袋gaspak
tm
的厌氧罐中培养24小时，培养条件为37℃、70rpm(放置于转速设置为70rpm的培养箱中)。培养24小时，菌液的波长600nm的条件下的od值(od
600
)可到0.6以上。经三次重复试验，平均od值为0.7
±
0.03。
33.对比例1
34.本对比例基本同实施例1，不同点在于固体培养基。在本对比例中固体培养基的配制方法如下：培养基用蒸馏水配制，其中含有质量百分数为3％的胰酶大豆肉汤预制粉末、质量百分数为1.5％的琼脂和质量百分数为2％的兔血。37℃厌氧培养36小时后，细菌在平板上的生长状态较实施例1差。按照实施例1的方式将单菌落接种在液体培养基中，经24小时培养，od值在0.2左右。经三次重复试验，平均od值为0.2
±
0.02(经t检验，p＜0.01，数据与实施例1存在显著差异)。
35.对比例2
36.本对比例基本同实施例1，不同点在于固体培养基。在本对比例中固体培养基的配制方法如下：培养基用蒸馏水配制，其中含有质量百分数为3％的胰酶大豆肉汤预制粉末和质量百分数为1.5％的琼脂。37℃厌氧培养36小时后，细菌在平板上难以生长，基本无法存活，无法获得共后续实验的菌落。
37.对比例3
38.本对比例基本同实施例1，不同点在于固体培养基。在本对比例中固体培养基的配制方法如下：培养基用蒸馏水配制，其中含有质量百分数为3％的胰酶大豆肉汤预制粉末、质量百分数为1.5％的琼脂和体积百分数为20％的胎牛血清。37℃厌氧培养36小时后，细菌在平板上难以生长，基本无法存活，无法获得共后续实验的菌落。
39.对比例4
40.本对比例基本同实施例1，不同点在于固体培养基，具体为含有质量分数为5％兔血的常规lb固体培养基。细菌在平板上的生长状态较实施例1差。按照实施例1的方式将单菌落接种在液体培养基中，经24小时培养，od值在0.2左右。经三次重复试验，平均od值为0.2
±
0.03(经t检验，p＜0.01，数据与实施例1存在显著差异)。
41.对比例5
42.本对比例基本同实施例1，不同点在于固体培养基，具体为含有质量分数为5％兔血的常规脑心浸液固体培养基，37℃厌氧培养36小时后，细菌在平板上难以生长，基本无法存活，无法获得共后续实验的菌落。
43.综合实施例1、对比例1-5的实验数据，说明固体培养中加入兔血以及采用胰酶大豆肉汤固体培养基，对于活化菌株以及提升细菌繁殖量非常关键。将兔血替换为胎牛血清，以及将胰酶大豆肉汤固体培养基替换为脑心浸液固体培养基或者lb固体培养基，都不能充分活化菌株以及提升细菌繁殖量。
44.对比例6
45.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基。具体地，本对比例的液体培养基的配制方法为：培养基用蒸馏水配制，其中含有质量百分数为3％的胰酶大豆肉汤预制粉末和体积百分数为20％的胎牛血清(即含有胎牛血清的胰酶大豆肉汤液体培养基，不加琼脂)。在液体培养基中培养24小时，经多次重复试验，od值基本上为0，细菌无法生长。
46.对比例7
47.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基，具体为含有体积百分数为20％的胎牛血清的常规脑心浸液液体培养基。在液体培养基中培养24小时，细菌无法生长。经三次重复试验，od值均为0。
48.对比例8
49.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基，具体为含有体积百分数为20％的胎牛血清的常规lb液体培养基。在液体培养基中培养24小时，细菌无法生长。经三次重复试验，od值均为0。
50.对比例9
51.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基，具体为不加胎牛血清的液体施耐德昆虫细胞培养基。在液体培养基中培养24小时，细菌无法生长。经三次重复试验，od值均为0。
52.对比例10
53.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基，具体为加10％胎牛血清的液体施耐德昆虫细胞培养基。在液体培养基中培养24小时，菌液od值为0.2左右。经三次重复试验，平均od值为0.2
±
0.02(经t检验，p＜0.01，数据与实施例1存在显著差异)。
54.对比例11
55.本对比例基本同实施例1，不同点在于液体培养基，具体为加5％胎牛血清的液体施耐德昆虫细胞培养基。在液体培养基中培养24小时，菌液od值为0.2左右。经三次重复试验，平均od值为0.2
±
0.01(经t检验，p＜0.01，数据与实施例1存在显著差异)。
56.综合实施例1、对比例6-11的实验数据，说明液体培养中加入灭活胎牛血清以及采用液体施耐德昆虫细胞培养基，提升细菌增殖活性以及繁殖量非常关键。不使用灭活胎牛血清，以及将液体施耐德昆虫细胞培养基替换为胰酶大豆肉汤液体培养基、脑心浸液固体培养基或者lb固体培养基，都不能充分提升细菌增殖活性以及繁殖量。
57.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。