用于确定患者中护理相关感染的发生风险的方法与流程

1.本发明涉及一种基于测量来自与刺激物一起孵育的患者血液样本的细胞因子的表达的体外或离体方法，该方法用于确定在从所述患者进行血液样本采集之日后7天内所述患者发生医疗保健相关感染的风险。


背景技术：

2.医疗保健相关感染的发展是与医疗护理相关的主要并发症，特别是在医院等医疗护理机构中(其中我们将更具体地讨论院内感染)。已经证明，重症监护室中发生在20％至40％的患者中的院内感染与发病率和死亡率增加、器官衰竭支持性护理所需的持续时间更长、住院时间更长、医疗保健费用更高、导致抗微生物剂耐药性的抗生素大量使用有关。近年来，由于多重耐药病原体的增加，医疗保健相关感染的出现尤为严重。据世界卫生组织(who)估计，欧洲医院的院内感染数约为500万，导致约50,000例死亡，每年额外花费130至240亿欧元。许多因素影响医疗保健相关感染的发生和发展，例如患者的一般健康状况，还有与患者治疗(例如抗生素的施用和/或侵入性医疗设备的使用)相关的因素，与医院环境(例如护士人数与患者人数的比率)相关的因素，以及医院工作人员对无菌技术的可变使用。特别是美国卫生与公众服务部、欧洲疾病预防和控制中心、who和国家机构，已经发布建议，并鼓励建立感染控制计划，对这些机构来说，预防和减少与医疗保健相关的感染已成为一个主要的优先事项。已经证明，医疗保健相关感染的控制计划在减少严重感染方面尤为有效。然而，据估计，最多65％至70％的与导管放置有关的血液和尿路感染案例以及55％的与机械通气和手术部位感染有关的肺炎案例可以避免。此外，在一些医院，尤其是在低收入和中等收入国家，根据建议遵守和应用程序可能会很复杂。早期识别处在发生医疗保健相关感染风险中的患者将是预防这些感染和治疗这些患者的关键步骤。根据一些模型，一种可以减少识别处在发生医疗保健相关感染的高风险中的患者的时间的测定将降低这些患者的死亡率，具有良好的成本/效益比。然而，目前还没有用于识别处于发生医疗保健相关感染的高风险中的患者的临床体外诊断测定。
3.功能测定或免疫功能测定(ifa)是离体直接测量一个或多个细胞群对与细胞接触的刺激物作出反应的能力的测定。例如，这些功能测定已用于研究单核细胞的无反应性，最常用的是测量用脂多糖(lps)离体刺激后蛋白质水平的tnfα，以及用于临床中，在结核病的情况下，通过测量用来自结核分枝杆菌的抗原刺激后蛋白质水平的干扰素γ(ifnγ)。功能测定也被用作旨在定义响应于不同感染挑战的正常免疫反应(即在“健康”情况下)的限度的研究的一部分(urrutia等人(2016),cell reports 16:2777-2791)。
4.此外，先前的研究表明，在大内脏手术后的脓毒症患者中，在抗cd3/cd28的刺激下，与存活患者和对照患者相比，t淋巴细胞分泌的il2、tnfα和部分ifnγ在非存活患者中显著减少；但是，没有提到与发生医疗保健相关感染的风险之间的联系(heidecke等人(2000),chirurg.71(2):159-65)。
5.另一方面，一些研究表明，分泌到来自儿科患者(处于脓毒性休克中、严重受伤或
接受过心脏手术)的血液样本中的细胞因子水平以及之前与刺激物一起孵育的细胞因子水平在发生院内感染的患者和未发生院内感染的患者之间显示出一些差异(muszynski等人(2014),crit care 18:r145；muszynski等人(2014),shock 42(4):313-321；greathouse等人(2018),circulation 138:a16525)。所使用的方法可以评估先天免疫功能(使用lps作为刺激物)或适应性免疫功能(使用植物血凝素(pha)作为刺激物)。lps与tlr4受体结合，尤其是在先天免疫细胞水平，而pha是一种与t淋巴细胞结合的凝集素。然而，这些研究通常是指在侵犯之日(即脓毒性休克、受伤或手术的发生)后14至30天内发生医疗保健相关感染，而更早的预测更为可取，因为必须迅速(最好在一周内)做出治疗干预的决策。因此，需要开发能够确定在从患者采集样本之日后一周内(即在已进行该采集之日后7天内)该患者发生医疗保健相关感染的风险的测定方法，在从该患者采集样本的次日之后的一周内，即在已对该患者执行此采集之日后的7天内。
6.然而，人们发现，非常令人惊讶的是，在某些类型的刺激物(如同时结合先天免疫细胞和适应性免疫细胞的超抗原)孵育下，基于对患者血液样本中细胞因子表达的测量的功能测定，可以确定在从该患者进行血液样本采集之日后7天内该患者发生医疗保健相关感染的风险。这些处于发生医疗保健相关感染的风险中的患者可从个体化治疗或免疫刺激治疗中获益。


技术实现要素：

7.因此，本发明的目的是一种用于确定在对患者(优选医疗保健机构中的患者)实施血液样本采集之日后7天内在所述患者中发生医疗保健相关感染(优选院内感染)的风险的体外或离体方法，其包含：
8.a)将患者的血液样本与刺激物一起孵育的步骤，所述刺激物包含选自由以
9.下组成的组的分子：
[0010]-能够结合至少一种抗原呈递细胞(apc)(优选一种先天免疫细胞)和至少一种适应性免疫(或获得性免疫)细胞(优选t淋巴细胞)的分子，
[0011]-允许直接激活t淋巴细胞的一种或多种分子，所述一种或多种分子选自抗体和抗体类似物，和
[0012]-咪唑喹啉型分子；
[0013]
b)测量从步骤a)得到的受刺激血液样本中至少一种细胞因子的表达的步骤，所述细胞因子由先天免疫细胞和/或适应性免疫细胞产生。
[0014]
当然，该方法包括确定发生所述感染的风险的最后步骤。
[0015]
在本发明的上下文中：
[0016]-术语“患者”是指与医疗保健专业人员例如医生(例如全科医生)或医疗机构或卫生设施(例如医院，更特别地是急诊室、复苏室、重症监护室或持续护理室，或疗养院类型的老年人医疗机构)接触的个体(人)。例如，作为预防接种规程(特别是在疗养院或甚至有全科医生)的一部分，患者可以是老年人；
[0017]-如果感染发生在医疗保健专业人员对患者进行(诊断性、治疗性、保守性、预防性、教育性或手术)治疗期间或之后，并且在治疗开始时既不存在也不潜伏，则称为“医疗保健相关”感染。医疗保健相关感染(hai)包括在医疗保健机构内发生的感染(称为院内感
染)，但也包括在该环境之外提供的医疗保健期间发生的感染。当治疗开始时的感染状态不明确时，通常接受至少48小时或超过潜伏期的延迟来定义hai。对于手术部位感染，在手术后13天内发生的感染，或者如果在手术后的一年内植入了植入物、假体或假体材料，通常被认为是医疗保健相关的。
[0018]-术语“血液样本”是指全血样本或来自血液的细胞样本(即从血液中获得并包含至少一种细胞类型的样本，例如外周血单核细胞或pbmc样本)；
[0019]
‑“
抗原呈递细胞”(apc)应理解为免疫系统的细胞，它将入侵者的一部分呈递给t淋巴细胞。它可以是先天免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)或b淋巴细胞；
[0020]
‑“
抗体类似物”应理解为模仿互补位/表位识别行为的分子，就像抗体一样。这些抗体类似物为本领域技术人员所熟知。实例包括fab、fab'、f(ab')2、scfv、纳米抗体、adnectins/单体(monobody)、双抗体、亲和体(affibody)、适体、抗生长促进素(anticalines)、darpins、高亲和性多聚体(avimers)、affilins、fynomers、nanofitins/亲和蛋白(affitins)、knottins、pronectins、kunitz结构域。
[0021]
医疗保健相关感染发生在从患者采集血液样本之日后的7天内，可能发生在从患者处采集了血液样本之日后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天或第7天(无论采集样本的日期是哪一天)。
[0022]
优选地，在如前所述的方法中：
[0023]-患者是医疗机构中、优选医院中的患者，更优选是急诊室、复苏室、重症监护室或持续护理室中的患者；更优选地，患有严重炎症发作的患者；更优选地，处于脓毒症状态的患者(更具体地，处于脓毒性休克中的患者，尤其是需要血管加压药和/或乳酸超过2mmol/l的患者)，遭受烧伤的(更具体地，严重烧伤)患者，遭受创伤(更具体地，严重创伤)的患者，或正在接受手术(更具体地，大手术)的患者。
[0024]
在这种情况下，根据本发明的方法允许确定患者发生院内感染的风险。脓毒症患者(或患有脓毒症的患者)应理解为因宿主对感染的不适当反应而导致的至少一个危及生命的器官衰竭的患者。脓毒性休克应理解为脓毒症亚型，其中尽管有足够的血管充盈，低血压持续存在。在患者处于脓毒症状态(已经遭受首次感染)的情况下，根据本发明的方法可以确定发生二次感染的风险。
[0025]
患者可以是儿科患者(18岁或以下)或成年患者(18岁以上)；优选地，他们是成年患者。
[0026]
优选地，在其所有实施方案中，如前所述的方法应用于含有白细胞(特别是至少含有t淋巴细胞)的血液样本。血液样本可以例如是纯化的t淋巴细胞的样本。它也可以是外周血单核细胞(或pbmc)样本，其由淋巴细胞(b细胞、t细胞和nk细胞)、树突状细胞和单核细胞组成，并且通常通过本领域技术人员熟知的ficoll方法获得。然而，为了尽量减少对样本的操作并保持参与免疫反应的不同细胞群之间的生理细胞相互作用，并更好地反映患者先天性和适应性免疫反应的复杂性，优选直接使用通过静脉途径(例如通过使用含有抗凝剂的管)收集的全血样本(即包含所有白细胞、红细胞、血小板和血浆)。特别是，当pbmc仅含有单核细胞时，全血也含有粒细胞(或多形核细胞)。
[0027]
如有必要，可以在进入医疗保健机构时或患者发生病情演变后，特别是在炎症发作或入院后的第一周(即d1、d2、d3、d4、d5、d6或d7)进行血液样本采集。
[0028]
根据本发明的方法基于功能测定，其中患者的血液样本与刺激物一起孵育。特别地，这种刺激物特异性结合适应性免疫细胞(更特别地，t淋巴细胞，特别是在t细胞受体或tcr的α和β可变链水平)并且可能还结合抗原呈递细胞(特别是在ii类主要组织相容性复合体或mhc ii水平)。
[0029]
因此，在如前所述的方法中，在其所有实施方案中，刺激物可以例如包括一种(多种)能够结合以下的分子：
[0030]-一方面，至少一种抗原呈递细胞(apc)，所述apc具体可能是一种先天免疫细胞(如单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)或一种适应性免疫细胞(如b淋巴细胞)，和
[0031]-另一方面，至少一种适应性免疫细胞(如t淋巴细胞)。
[0032]
优选地，所述分子能够同时结合至少一种抗原呈递细胞(apc)和至少一种适应性免疫细胞，从而在这些细胞之间形成“旁路”。
[0033]
优选地，它是包含超抗原类型的分子或类似于超抗原的分子的刺激物。超抗原是一种蛋白质性质的毒素，能够通过同时经由高变区cdr4与t细胞受体可变结构域(v
β
)的β链结合和与存在于抗原呈递细胞(apc)的表面上的mhc ii(ii类主要组织相容性复合物)分子结合来刺激大量t淋巴细胞。在携带mhc的抗原呈递细胞和其t细胞受体携带v
β
片段的t淋巴细胞之间建立的强制相互作用导致这些t淋巴细胞的多克隆活化，而与它们对呈递的肽抗原的特异性无关。当使用包含超抗原类型分子的刺激物时，在根据本发明的方法中使用的血液样本优选包含t淋巴细胞和抗原呈递细胞。在更感兴趣的超抗原中，可以特别提及由葡萄球菌物种产生的超抗原和由链球菌物种产生的超抗原。葡萄球菌和链球菌超抗原是已知的。葡萄球菌超抗原的实例包括sea、seb、sec(尤其包括sec1、sec2、sec3和sec4变体)、sed、see、sef、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、ses、set、seu、sev(葡萄球菌肠毒素a到v)和tsst-1，链球菌超抗原的实例包括spe a、spe b和spe c(链球菌化脓性外毒素a到c)。优选地，刺激物包含选自sea(葡萄球菌肠毒素a)、seb(葡萄球菌肠毒素b)和sec(葡萄球菌肠毒素c)的至少一种分子。在类似于超抗原的分子中，可以提及例如双特异性抗体，其一方面能够与t淋巴细胞结合，另一方面能够与抗原呈递细胞结合(例如，抗体一方面能够与t淋巴细胞上的v
β
结合，另一方面能够与抗原呈递细胞上的mhc ii分子或tlr型受体结合)。
[0034]
在根据本发明的方法中，还可以使用包含一种或多种抗体(或抗体类似物)的刺激物，其允许直接激活t淋巴细胞，特别是通过识别和激活t淋巴细胞表面上的受体。这些可以是彼此物理和/或化学结合的抗体，更优选还通过偶联在聚合物上、偶联在珠上、偶联在bsa(牛血清白蛋白)上或偶联在它们之间。优选地，它们可以是结合t淋巴细胞的抗cd3抗体(例如muromonab-cd3，以名称orthoclone okt3销售)，更优选地，所述抗cd3抗体与一种或多种如前所述结合抗原呈递细胞的抗体物理和/或化学结合，所述抗体可优选选自由以下组成的列表：抗hla-dr(人类白细胞抗原-dr)抗体、抗cd28抗体、抗cd2抗体和/或抗cd137/tnfrsf9抗体。
[0035]
在根据本发明的方法中，还可以使用包含咪唑喹啉型分子的刺激物(低分子量的核苷的结构类似物，包括其结构中的环)，优选tlr受体激动剂，更优选tlr7和/或tlr8受体激动剂。这种类型的刺激物产生体内抗病毒和抗肿瘤作用。可能会提到咪唑喹啉型刺激物的一个实例雷西莫德(resiquimod，r848)，它与树突状细胞上的人tlr7和tlr8结合，或更一
般地与抗原呈递细胞上的人tlr7和tlr8结合(nf-kb依赖性反应)。还描述了对t淋巴细胞的直接作用(smits等人(2008),oncologist 13(8):859-875)。
[0036]
作为根据本发明的方法的一部分，使用允许程序标准化的系统是特别有利的；特别是，可以使用预先填充有培养基和感兴趣的刺激物的半封闭培养系统(例如管)，这些系统是标准化的，例如包含明确定义的刺激物(即在刺激物的生产水平上就其性质/组成而言没有批次间差异)和/或以“批次”加载，以控制管中刺激物的数量并具有管对管的可重复性。优选地，这些管还可以允许采集血液样本(这允许在采集时刺激细胞)，并且更优选地，它们允许采集精确体积的血液。标准化系统的一个实例是管。
[0037]
在如上所述的方法中，在其所有实施方案中，用刺激物孵育患者血液样本的步骤可以在不同温度(优选37℃)和不同孵育时间(优选孵育1小时至48小时；例如孵育1小时或更短、2小时或更短、4小时或更短、12小时或更短、24小时或更短、或48小时或更短)进行。短孵育时间对于在临床实践中实施测定特别有利。
[0038]
如前所述，将患者的血液样本与刺激物一起孵育会诱导细胞反应，从而产生细胞因子，从而可以确定在从所述患者采集血液样本之日后7天内患者发生医疗保健相关感染的风险。因此，在如前所述的方法中，在其所有实施方案中，测量至少一种细胞因子的表达，所述细胞因子由先天免疫细胞和/或适应性免疫细胞产生。细胞因子的低表达水平与在采集血液样本之日后的7天内发生医疗保健相关感染的风险较高有关。所述方法可以包括测量至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种细胞因子的表达，所述细胞因子选自由gm-csf、ifnγ、il2、il3、il4、il5、il6、il10、il17和tnfα组成的组(“适应性免疫”列表)，优选选自由gm-csf、ifnγ、il2、il3、il4、il5、il6、il10和il17组成的组，更优选选自ifnγ和il2。这些细胞因子对应于适应性免疫细胞(特别是t淋巴细胞)产生的细胞因子。所述方法还可以包括测量至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种细胞因子的表达，所述细胞因子选自由ccl2(mcp1)、ccl3(mip1α)、ccl4(mip1β)、cxcl8(il8)、cxcl10(ip10)、ifnγ、il1α、il1β、il1ra、il3、il6、il10、il18和tnfα组成的组(“先天免疫”列表)，更优选地，所述至少一种细胞因子是ifnγ。这些细胞因子对应于先天免疫细胞(特别是单核细胞和/或巨噬细胞)产生的细胞因子。
[0039]
所述方法还可以包括(特别是当刺激物包含能够结合至少一种抗原呈递细胞和至少一种适应性免疫细胞的分子时)测量至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种、至少十六种、至少十七种、至少十八种、至少十九种不同细胞因子的表达，所述细胞因子分别选自“先天免疫”列表和“适应性免疫”列表，优选至少两种不同细胞因子中的至少一种细胞因子选自ifnγ和il2，更优选地，所述两种不同细胞因子是ifnγ和il2。
[0040]
细胞因子表达的测量尤其可以在蛋白质水平上进行。此类蛋白质表达测量的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，可以提及通过免疫测定进行的测定，例如elisa(酶联免疫吸附测定)、elfa(酶联荧光测定)和ria(放射免疫测定)，通过ecl(电化学发光法)进行的测定和通过质谱法进行的测定。
[0041]
优选地，如前所述的方法，在其所有实施方案中，还可以包括测量来自没有受到刺激(也就是说，样本血液在与受到刺激的血液样本相同的条件(但不存在刺激物)下孵育)的对照血液样本中与受到刺激的血液样本中测量的相同细胞因子的表达的步骤。更优选地，该方法还可以包括计算受到刺激的血液样本中每种细胞因子的表达相对于对照血液样本(未受到刺激)中相同细胞因子的表达的比值的步骤，或从来自受到刺激的血液样本中相同细胞因子的表达中减去对照(未受到刺激的)血液样本中每种细胞因子的表达的步骤。
[0042]
优选地，在如前所述的方法中，在其所有实施方案中，将患者的受到刺激的血液样本中细胞因子的表达与参考值或与参考血液样本中相同细胞因子的表达进行比较。参考血液样本可以是，例如来自志愿者(健康个体)的血液样本、来自多个志愿者(健康个体)的样本的混合物、来自患者的样本或来自多个患者的样本的混合物，如上所述，患者可能特别是患有严重的炎症发作；这些参考血液样本优选地受到与待测患者的受到刺激的血液样本相同的刺激物刺激。
[0043]
优选地，在如前所述的方法中，在其所有实施方案中，将受到刺激的血液样本中每种细胞因子的表达相对于对照血液样本(未受到刺激)中相同细胞因子的表达的比率与对应于来自参考血液样本的受到刺激的样本中相同细胞因子的表达相对于来自参考血液样本的未受到刺激的样本中相同细胞因子的表达的比率的参考值进行比较。
[0044]
优选地，在如前所述的方法中，在其所有实施方案中，将受到刺激的血液样本中每种细胞因子的表达减去对照(未受到刺激的)血液样本中相同细胞因子的表达所得的值与来自参考血液样本的受到刺激的样本中相同细胞因子的表达减去来自参考血液样本的未受到刺激的样本中相同细胞因子的表达所得的参考值进行比较。
[0045]
根据本发明的功能测定可单独使用，或与一些免疫参数组合使用，从而改进对在采集血液样本之日后7天内发生医疗保健相关感染的预测。因此，如前所述的方法，在其所有实施方案中，还可以包括在未被刺激物孵育的患者血液样本中测量il10浓度、il6浓度、每个单核细胞的hla-dr分子数、cd10
low
/cd16
low
中性粒细胞的百分比和/或cd10
high
/cd16
high
中性粒细胞的百分比的步骤。
[0046]
本发明还涉及：
[0047]-用于检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种、至少十六种、至少十七种、至少十八种、至少十九种细胞因子(特别选自上文所述那些)的表达的装置，所述检测装置优选为抗体，或
[0048]-一种包含此类检测装置的试剂盒，所述试剂盒优选地还包含如上定义的刺激物，
[0049]
用于确定在从患者(优选医疗保健机构中的患者)采集血液样本(从血液样本中测量细胞因子的表达)之日后7天内所述患者发生医疗保健相关感染(优选院内感染)的风险的用途。
附图说明
[0050]
图1：不同刺激物(seb、sec和双功能偶联物
‘
ahladr/acd3’，包括移植到bsa上的抗hla-dr和抗cd3单克隆抗体)对细胞因子il6、il10和cxcl10的分泌的影响。在37℃下将100μl(组1)或300μl(组2)全血与刺激物一起孵育24小时(组1)或16小时(组2)，然后测量分泌的
细胞因子的量。“ns”：统计学上不显著。
具体实施方式
[0051]
本发明通过以下实施例进行说明，但不限于此。
[0052]
实施例1：
[0053]
材料和方法
[0054]
在edouard herriot医院(里昂，法国)进行了一项前瞻性、纵向和单中心观察性临床研究。该临床研究的设计已发表在rol等人(2017),bmj open 7(6):e015734中。该临床研究于2015年11月获得法国国家药品和健康产品安全局(ansm)的批准，并于2015年12月获得东南ii个人保护委员会(south-east ii personal protection committee)的批准。该方案分别于2016年7月和2017年1月进行了修订。简言之，在2015年12月至2018年3月期间，共纳入377名患者，分别处于脓毒性状态(n＝35)或处于脓毒性休克(n＝72)，遭受严重烧伤(n＝24)、严重创伤(n＝137)或大手术后在复苏室或重症监护室住院(n＝109)，以及175名健康志愿者。
[0055]-脓毒性状态/脓毒性休克患者：根据第一个临床方案，只纳入脓毒性休克患者，基于怀疑感染性病灶，在进入复苏室后48小时内开始用儿茶酚胺治疗，并用儿茶酚胺(去甲肾上腺素)》0.25μg/kg/min治疗至少2小时。然后，脓毒性休克的新定义脓毒症3(singer等人(2016),jama 810-801:(8)315)发布后，2016年8月对资格标准进行了修订。因此，脓毒性休克患者因怀疑感染性病灶而被纳入，在进入复苏室后48小时内开始儿茶酚胺治疗以及维持血压≥65mmhg和乳酸浓度》2mmol/l(18mg/dl)所必需的血管加压治疗，尽管纠正了低血容量。2017年，增加了纳入脓毒症状态(根据脓毒症3定义)患者的可能性，即怀疑感染性病灶，并且在进入复苏室后48小时内，sofa评分较基础sofa增加≥2分。对于该人群，第1天对应于脓毒症或脓毒性休克的诊断日期；
[0056]-严重创伤：在第一个方案中，仅纳入严重创伤患者(损伤严重程度评分(iss)≥25)。2016年8月，该可能性被增加到还包括较轻的损伤(16《iss《24)。对于该人群，第1天对应于进入复苏室或重症监护室的日期(约为创伤当天)；
[0057]-大手术：在第一个方案中，仅考虑胃食管切除术(esogastrectomy)、bricker型膀胱切除术、头十二指肠胰腺切除术(cephalic duodenopancreatectomy)和通过剖腹进行的腹主动脉手术。2017年1月增加了其他具有高并发症风险的手术类型：(全或尾部)胰腺切除术、神经内分泌肿瘤、肝切除术(右侧)、延长的结肠切除术(剖腹手术)、腹会阴切除术(abdoperineal resection)、肾切除术(剖腹手术，pkd)、髂股旁路术(scarpa)。对于该人群，第1天对应于手术当天；
[0058]-严重烧伤：根据烧伤总面积大于30％选择患者。对于该人群，第1天对应于进入复苏室或重症监护室的当天(约为烧伤当天)。
[0059]
排除标准主要与可能影响免疫状态并使结果偏颇的因素(例如：重度中性粒细胞减少、皮质类固醇治疗、肿瘤血液学病理学等)有关。在第30天之前导致医院发生疑似医疗保健相关感染的每个事件都由三名不参与患者招募的医生进行独立审查。26％的患者在第30天之前或离开医院之前至少发生过一次医疗保健相关感染。
[0060]
为患者多次收集肝素化全血样本，即第一周3-4次(在第1天或第2天：d1/2，在第3
天或第4天：d3/4和在第5天、第6天或第7天：d5/7)，然后在以后的时间收集3次(约在d14、d28和d60)。将这些样本分配到预热的truculture管(myriad rbm，美国德克萨斯州奥斯汀市)中，该管含有单独培养基(“对照样本”)或具有seb的培养基(100ng/ml)(“受到刺激的样本”)。然后将这些管插入干块培养箱(dry block incubator)中，并在37℃下保持24小时。孵育后，按照供应商的建议，使用纳米流体平台ella(proteinsimple,san jos
é
，加利福尼亚州，美国)，通过elisa测定测量ifnγ或il2的浓度(参考文献分别为spckb-cs-000292和spckb-cs-000955,biotechne)。
[0061]
关于数据分析，针对感染发生的不同时间间隔(即样本采集和首次感染发生之间的时间)评估了细胞因子分泌与发生医疗保健相关感染的风险之间的关联。考虑的不同时间段是：样本采集后4天内和7天内发生医疗保健相关感染，无论采集样本时间如何。对于发生医疗保健相关感染的每位患者(即“案例患者”)，所考虑的样本对应于在首次发生医疗保健相关感染之前最近的样本收集(最少延迟24小时)。对于未发生医疗保健相关感染的每位患者(即“对照患者”)，使用匹配方法为每个案例患者选择同一样本采集日的与sofa和charlson评分接近的对照患者。最后，为每个独特案例选择了单独的对照。实施单变量逻辑回归。对所有类型的组合患者进行了分析。细胞因子分泌与医疗保健相关感染发生之间的关联以表示为四分位数间距的优势比(or iqr)的形式估计，其95％置信区间与之相关。
[0062]
结果
[0063]
已经观察到，在用seb刺激后，较低浓度的il2或ifnγ与样本采集之日后4天或7天内发生医疗保健相关感染的风险较高有关(表1)。
[0064][0065]
表1.seb刺激后ifnγ或il2的测量与样本采集之日后4天或7天内发生医疗保健相关感染的风险之间的关联。优势比(or iqr)表示为具有相关95％置信区间(ci)的四分位数间距。
[0066]
实施例2
[0067]
在这个实施例中，发明人比较了三种刺激物(seb、sec和包含移植到bsa上的抗hla-dr和抗cd3单克隆抗体的双功能偶联物
‘
ahladr/acd3’)对不同细胞因子(il6、il6、il10和cxcl10)的分泌的影响。
[0068]
材料和方法
[0069]
将来自健康志愿者(每种条件n＝5)的全血样品(100μl或300μl)在浓度约为1.4
×
10-8
m(即0.0004g/l seb(myriad,ref 782-001124)、0.0004g/l sec(toxin technology,inc.,ref ct111-sec1)或0.0094g/l ahladr/acd3偶联物(ultra-leaf纯化的抗人hla-dr-na.41(ozyme)，参考ble307666和ultra-leaf纯化的抗人cd3-na.41(ozyme)，参考ble317347))的刺激物存在下在37℃条件下在rpmi中孵育16h或24h。孵育后，使用ella纳米流体平台(proteinsimple)测量细胞因子(il6、il10、cxcl10
–
proteinsimple)的浓度
(以pg/ml计)。不同刺激物之间的比较是使用非参数测试t(对配对样本进行的威尔科克森符号秩检验)进行的。p≤0.05的值被认为具有统计学意义(双边检验)。
[0070]
结果
[0071]
图1显示了使用不同刺激物获得的结果。组1说明seb刺激和sec刺激之间的il6、il10和cxcl10分泌水平在统计学上没有显著的差异。类似地，组2显示，在sec刺激和ahladr/acd3偶联物刺激之间，这些细胞因子的分泌水平在统计学上没有显著的差异。因此，这三种刺激物诱导血液样本中相似量的细胞因子的分泌。