用于治疗生理病况的非侵入性聚焦超声神经调制
1.相关申请的交叉引用本技术要求在2020年4月9日提交的美国临时申请号63/007,766和2020年5月20日提交的美国临时申请号63/027,724的优先权和益处。
背景技术：
2.本文公开的主题涉及神经调制，并且更具体地，涉及用于使用从能量源施加的能量来调制生理响应的技术。
3.神经调制已经用于治疗多种临床病况。例如，在沿脊髓的不同位置的电刺激已经用于治疗慢性背痛。可植入装置可以周期性地产生电能，将该电能施加到组织以激活某些神经纤维，这可以导致疼痛感觉的降低。关于脊髓刺激，刺激电极通常定位在硬膜外腔中，尽管脉冲发生器可以定位成稍微远离电极，例如在腹部或臀区域中，但是经由导线连接到电极。在其它实现中，深度脑刺激可以用于刺激脑的特定区域以治疗运动障碍，并且刺激位置可以通过神经成像来引导。这样的中枢神经系统刺激通常靶向局部神经或脑细胞功能，并且由递送电脉冲并且定位在靶神经处或附近的电极介导。然而，将电极定位在靶神经处或附近是有挑战性的。例如，这样的技术可能涉及递送能量的电极的外科手术放置。此外，经由神经调制的特定组织靶向是具有挑战性的。定位在某些靶神经处或附近的电极通过触发神经纤维中的动作电位来介导神经调制，这进而导致神经递质在神经突触处释放以及与下一神经的突触通信。这样的传播可能导致比期望的相对更大或更分散的生理作用，因为植入电极的当前实现一次刺激许多神经或轴突。因为神经途径是复杂且互连的，更具选择性和靶向的调制作用可能在临床上更有用。
技术实现要素：
4.下面概述某些实施方案。这些实施方案不旨在限制所要求保护的主题的范围，而是这些实施方案仅旨在提供可能的实施方案的简要概述。实际上，本公开可以涵盖可以与下面阐述的实施方案类似或不同的多种形式。
5.在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括将聚焦超声能量施加到受试者中的感兴趣区域以诱导一个或多个神经途径的神经调制，其中所述感兴趣区域包含腹腔丛的至少一部分。
6.在一个实施方案中，提供了一种系统，其包括超声探头，其被配置为将聚焦超声能量施加到受试者中包含腹腔丛的至少一部分的感兴趣区域，以神经调制所述受试者的所述腹腔丛的外周神经节。所述系统还包括控制器，其被配置为从以成像模式操作的所述超声探头获取所述受试者的图像数据，基于所述图像数据选择所述感兴趣区域；和控制所述超声探头以将所述聚焦超声能量施加到所述感兴趣区域，作为治疗所述受试者的炎性肠病的治疗方案的一部分。
7.在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括从以成像模式操作的超声探头获取受试者的图像数据，其中所述受试者被诊断为患有炎性肠病；基于所述图像数据选择包含
所述腹腔丛的至少一部分的感兴趣区域；和控制所述超声探头以将聚焦超声能量施加到所述感兴趣区域，作为治疗所述炎性肠病的治疗方案的一部分，其中所述感兴趣区域包含腹腔丛的外周神经节的至少一部分。
附图说明
8.当参考附图阅读以下详细描述时，本公开的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，在附图中，相同的符号在所有图中表示相同的部件，其中：图1是根据本公开的实施方案的用于超声能量施加的实验设置的示意图；图2显示用于在空间上选择感兴趣区域用于超声能量施加的超声成像；图3显示在摄取葡聚糖硫酸钠(dss)的动物模型中，在重复聚焦超声(fus)治疗过程中，相对于对照，疾病活动指数(dai)的变化；图4显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，粪便稠度的dai亚类的变化；图5显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，总出血的dai亚类的变化；图6显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，重量的dai亚类的变化；图7是研究组中的动物死后结肠的示意图，其显示dss和聚焦超声对粪便稠度的作用；图8显示在未经处理的动物中不同浓度的dss与dai评分之间的关系；图9显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，dai的变化；图10显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，粪便稠度的dai亚类的变化；图11a显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗的过程中，相对于对照，总出血的dai亚类的变化；图11b显示代表性照片，其显示来自不同治疗组和对照组的第7天和第8天大鼠的总出血的变化；图12显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗的过程中，相对于对照，重量变化作为距基线的百分比；图13显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，单个动物粪便稠度评分；图14显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，单个动物总出血评分；图15a显示研究中的各组的结肠长度；图15b显示相对于彼此确定大小的结肠长度的代表性照片；图16a显示相对于对照，每天两次聚焦超声处理的摄取(dss)的动物模型的结肠苏木精和曙红y染色切片；图16b显示相对于对照，每天聚焦超声处理的摄取(dss)的动物模型的结肠苏木精
和曙红y染色切片；图16c显示研究中的各组的组织病理学评分；图17显示由在“朴素(naive)”、“水 2x fus”、
ꢀ“
dss 2x模拟fus”和“dss 2x fus”组中的大鼠的结肠评估的大鼠细胞因子活性的阵列坐标和阵列数据；图18显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图19显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图20显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图21是根据本公开的实施方案的神经调制系统的示意图；图22是根据本公开的实施方案的神经调制系统的框图；和图23是根据本公开的实施方案的神经调制的方法的流程图。
具体实施方式
9.下面描述一个或多个具体实施方案。为了提供这些实施方案的简明描述，在说明书中没有描述实际实现的所有特征。应当理解，在任何这样的实际实现的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须做出许多实现特定的决定以实现开发者的特定目标，例如符合系统相关的和商业相关的约束，其可能从一个实现到另一个实现而变化。此外，应当理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但对于受益于本公开的普通技术人员而言，仍然是设计、制作和制造的例行任务。
10.本文给出的任何实例或说明不应以任何方式视为对与其一起使用的任何一个或多个术语的限制、局限于此或表达其定义。相反，这些实例或说明应被认为是关于各种特定实施方案描述的，并且仅是说明性的。本领域普通技术人员将理解，与这些实例或说明一起使用的任何一个或多个术语将涵盖可以或不可以与其一起或在说明书中的其它地方给出的其它实施方案，并且所有这样的实施方案旨在包括在该一个或多个术语的范围内。指定这样的非限制性实例和说明的语言包括但不限于“例如(for example)”、“例如(for instance)”、“例如(such as)”、“例如(eg.)”、“包括”、“在某些实施方案中”、“在一些实施方案中”和“在(一个)实施方案中”。
11.当介绍本公开的各种实施方案的要素时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在是指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包含性的，并且是指除了所列要素之外还可以存在另外的要素。此外，以下讨论中的任何数值实例旨在是非限制性的，并因此另外的数值、范围和百分比在所公开的实施方案的范围内。
12.炎性肠病(ibd)包括一系列慢性和复发性胃肠(gi)病症，其中克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)是两个主要的值得注意的提及。ibd引起胃肠道慢性炎症，其中症状包含持续性腹泻、腹痛、出血和/或直肠出血。许多ibd症状也在胃肠道外出现，包括关节炎、巩膜外层炎和疲劳。截至2015年，美国大约有3百万成年人被诊断为患有ibd，这占国家人口的大约1%。近年来诊断数量的增加已经将ibd定位于全球健康问题，据估计每十年出现的新诊断增加20%，这也产生相当大的经济负担。
13.尽管有努力，但ibd的治疗选择在可用性和/或功效方面显著缺乏。许多患者变得对一线药物治疗难治或发展进一步的并发症，例如狭窄、穿孔或瘘管，这可能需要建议进行手术。最近引入针对ibd的抗肿瘤坏死因子(tnf)剂已经是治疗该疾病的主要进展，但是无
反应者的比率可能高达60%。另外，30%的个体在给予12个月内变得对治疗难治，并且复发有重新出现的症状。鉴于ibd的住院和手术率没有降低，并且数据假设cd和uc的住院率和手术率适度增加，仅进一步强调了开发治疗ibd的新治疗干预的未满足的需要和临床效用。
14.有多种有助于ibd发展的病因学组分，涉及遗传、免疫学和环境条件之间的复杂相互作用。在缺乏ibd的单一潜在病理生理学机制的情况下，本领域的共识是特定环境触发扰乱个体的肠道稳态，其固有易受免疫系统的慢性损伤和/或与肠道菌群的相互作用扰乱，导致炎性介导的损伤。
15.中枢神经系统(cns)和免疫系统之间的直接联系可能涉及脾，用于反馈控制调节脾和循环巨噬细胞的细胞因子释放。这与ibd特别相关，因为细胞因子水平失调在调制肠道炎症和结肠损伤中起作用。来自循环细胞因子/内毒素的感觉神经反馈可以触发迷走神经介导的信号传导至脾巨噬细胞以抑制炎性响应。这可以通过胆碱能抗炎途径(cap)内的腹腔丛中肾上腺素能神经元间接发生。鉴于此，外周途径可以用作新的生物电疗法的靶标，但目前的电刺激器不能给予肠刺激。
16.本文提供了使用聚焦超声神经调制腹腔丛(或腹腔丛的至少一部分)的技术，目标是改进ibd样症状学。本文公开了在结肠炎大鼠模型中的研究结果，其涉及动物每天经由其饮用瓶饮用葡聚糖硫酸钠(dss)。该研究评估了用聚焦超声给予或不用聚焦超声给予的ibd啮齿动物模型中常规使用的终点度量。本文提供的聚焦超声显示改进ibd样症状学，例如结肠炎的dss大鼠模型中的粪便稠度、总出血/腹泻和结肠组织完整性。在ibd的
‘
轻微’和
‘
严重’形式两者中都注意到了功效，这通过使用dss的不同制剂来揭示。这些结果证明非侵入性聚焦超声神经调制在ibd中的临床效用。聚焦超声可以用于靶向外周神经系统中特定的丛或神经节，以治疗疾病(例如ibd)。
17.图1显示用于进行某些神经调制实验的实验设置，所述神经调制实验聚焦本文提供的靶(例如腹腔丛)。根据由控制器设定的参数操作的能量施加装置将聚焦超声施加到感兴趣区域，以靶向腹腔丛。在大鼠中，该区域刚好位于膈膜下方。通过初始超声成像确定超声换能器在大鼠上的放置，如图2所示，其揭示作为用于定位腹腔丛的界标的两个主要动脉(肝和脾)。之后，将换能器刚好定位在腹腔丛上方大约25 mm的剑突的侧面，以在肠系膜上神经节的水平激活肠cap途径。
18.所有涉及动物的实验都符合国家卫生研究院和阿尔巴尼医学院(amc)动物护理和使用委员会(iacuc)的指南。动物购自taconic biosciences (germantown, ny, usa)，在亮-暗循环的亮阶段(7:00am至7:00pm)期间进行程序。动物可以随意获取食物和液体。
19.通过将初始重量为200-350g的雄性sprague dawley大鼠放置在填充有设定为2-3 l/min的4%异氟烷(harvard apparatus, ma, usa)的吸入室中，使其麻醉，使得可以容易地处理它们以获得动物肛门的照片，随后收集粪便样本以测试稠度和血液分析。之后，立即将大鼠的头部放置在密封的鼻锥中，同时将其背部定位，并经由台式蒸发器(harvard apparatus, ma, usa)以2-3 l/min用1.5%异氟烷维持麻醉。将腹部(特别是剑突上方的区域)剃毛并用黑笔标记以靶向换能器用于聚焦超声给予。该位置靶向迷走神经前干，其邻近肠系膜上以及左腹腔神经节和右腹腔神经节两者，如使用超声成像施加器所注意到的(图2)。在施加聚焦超声后，将大鼠从异氟烷麻醉中摘下，称重并放回到它们各自的笼中。
20.用葡聚糖硫酸钠(dss)模型诱导大鼠的ibd样病理生理学。葡聚糖硫酸钠(dss)是
水溶性的硫酸化的多糖，当每天与水一起在溶液中摄取时，其随时间诱导大鼠的肠道炎症。这源于dss是上皮细胞刺激物，其在大肠中集中，导致在整个结肠固有层中的溃疡性损伤。这通过损伤上皮屏障和使腔细菌(luminal bacteria)/抗原能够进入粘膜而诱导ibd样病理生理学和症状学。此外，粘膜损伤也在远端结肠中增加数量和大小，引起类似于在人溃疡性结肠炎中所见的上皮损伤。dss是急性、慢性和/或复发性肠道炎症的模型。
21.在实验的第1天，将dss加入到动物的可随意获得的含有常规自来水的饮用水中。根据实验，浓度在4-9%范围内。对照组中的动物仅饮用自来水。对于所有组，每3-5天更换饮用瓶以确保水瓶中的dss不降解并且没有将影响dss诱导的症状的细菌污染。
22.评估ibd啮齿动物模型中的症状学的终点度量是疾病活动指数(dai)，其可以用作评估如本文所提供的神经调制的有效性和/或成功的度量。使用重量减轻、粪便稠度和总出血评估dai评分。每个标准可以在0-4的范围内，以分别反映正常到最严重的症状学。相对于基线重量对重量减轻评分。该半定量分析工具由动物重量、粪便稠度和粪便中血液的存在以及直肠出血的每天测量组成，标准如下(表1)：表1：dai评分评分重量减轻(%)评分粪便稠度评分粪便中的总出血0无0正常0无11-51 1 25-102松散2轻微310-153 3 4》154水样4严重重量减轻评级从0分到4分，表示无重量减轻(0分)至超过15%重量减轻(4分)；粪便稠度评级从0分到4分，表示正常质地和外观(0分)至水样腹泻(4分)；直肠出血评级从0分到4分，包括无出血(0分)、轻微出血(2分)至总出血(4分)。总之，从3个亚类中，最大总dai评分为12分是可能的。
23.每天监测动物体重以评估重量减轻的存在和幅度。用数字记录用照片目测评估粪便稠度和总出血。另外使用粪便血液检测测试(sure-vue fecal occult blood slide test system; fisher scientific, hampton, nh)测试粪便样品的血液。如果出血不可见但潜血测试为阳性，则出血评分增加1分。除了dai度量，还记录12天的液体消耗。
24.饮用dss两周后，并且用聚焦超声处理或不用聚焦超声处理，处死大鼠。收集结肠用于死后分析，例如结肠长度比较、细胞因子和组织学损伤，包括上皮损伤和炎性细胞浸润。
25.由于聚焦超声在大鼠解剖结构的尺寸/规模上的空间限制，在异氟烷介导的麻醉下，通过用定位在剑突和下肋骨之间的左腹区域中的聚焦超声换能器探头调制腹腔丛(左腹腔神经节和右腹腔神经节和/或肠系膜上神经节)来靶向肠cap途径(图1)。
26.聚焦超声系统由函数发生器(agilent33120a)、射频(rf)功率放大器(eni350l)和定制的2.5 mhz聚焦超声(fus)换能器组成。fus换能器高0.75英寸且直径0.75英寸，具有弯曲表面，并且换能器聚焦深度为聚焦25.4 mm。fus换能器通过放置在剃毛的腹部上的超声凝胶声学耦合到动物。函数发生器产生由rf功率放大器增强并传输到fus换能器的脉冲正弦波形。fus刺激允许特定位置的靶向，不像以前的超声技术，以前的超声技术要求换能器
扫过器官或留在适当的位置作为具有5 cm2覆盖区的未聚焦超声。
27.每天，将3分钟的聚焦超声施加到靶区域(载波频率：2.5 mhz，振幅：300 mv，脉冲串长度：300个载波周期，脉冲串重复周期：200毫秒)。在2.5 mhz的载波频率下，每个载波周期是0.4微秒，并且300个载波周期的持续时间是120微秒。因此，在每个200毫秒的脉冲串重复周期期间，换能器在120微秒内有效地脉动，并且在重复下一个脉冲串之前在剩余199.88毫秒内保持不活动。将动物分成由其处理和对照变量(表2)描述的不同组。根据动物组的疾病病况和治疗来分配动物组。左列具有动物组名称，中间列描述处理。
28.表2：动物组
动物组处理的描述dss每天饮用dss的大鼠，持续两周dss 1xfus饮用dss的大鼠，每天一次非侵入性fus，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下dss 2xfus饮用dss的大鼠，每天两次非侵入性fus，每天间隔六小时，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下dss 模拟1xfus饮用dss的大鼠，在每天一次的异氟烷麻醉下，持续两周dss 模拟2xfus饮用dss的大鼠，在每天两次的异氟烷麻醉下，每天间隔六小时，持续两周朴素仅饮用水的大鼠，持续两周水 1xfus饮用水的大鼠，每天一次非侵入性fus，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下水 2xfus饮用水的大鼠，每天两次非侵入性fus，每天间隔六小时，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下水 模拟1xfus饮用水的大鼠，在每天一次的异氟烷麻醉下，持续两周水 模拟2xfus饮用水的大鼠，在每天两次的异氟烷麻醉下，每天间隔六小时，持续两周
将总共60只大鼠分成以下组：饮用葡聚糖硫酸钠的动物标记为
‘
dss’。给予非侵入性聚焦超声的动物在
‘
fus’组。作为标记为
‘
模拟fus’的聚焦超声的假对照组，大鼠经历与接受聚焦超声的大鼠相同的程序，例如腹部剃毛并用异氟烷麻醉，用笔标记，其中换能器探头定位在剑突和下肋骨之间的相同部位。然而，关闭rf功率放大器、函数发生器和换能器。将没有给予dss或聚焦超声，并且每天仅从它们的笼子中取出一次以监测重量变化并评估粪便稠度和总出血评分的动物标记为
‘
朴素’。在它们的治疗指定之前，将每天两次进行非侵入性聚焦超声的动物标记为
‘
2x’。对于
‘
2x fus’组中的动物特异性的，大鼠每天接受两次聚焦超声治疗，第一次在早晨施加，而第二次聚焦超声时间在第一次聚焦超声时间后大约6小时的下午进行。第二次聚焦超声的设置与早晨给予的第一次聚焦超声相同，但是在第二次聚焦超声治疗期间没有收集到终点度量。还对一些动物组组合标记以反映接受多个程序。例如，饮用dss但每天接受两次假聚焦超声程序的大鼠表示为
‘
dss 2x模拟fus’。
29.实验完成后，用ip注射在盐水中的氨基甲酸酯(urethane) (1.2-1.5g/kg)来麻醉动物，随后进行胸廓切开术和解剖以从盲肠到肛门取出结肠。在用1x磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗结肠之前和之后拍摄照片。将结肠分割成大约20 mm长的3个部分，其中近端部分靠近盲肠，远端部分靠近肛门，并且中间部分在两个端部之间。将每个部分称重，在液氮中速冻并在-80℃下储存，直到使用裂解缓冲液(tissue extraction reagent i, invitrogen, vienna, austria)与抑制剂混合物和乙二胺四乙酸(halt
™ꢀ
protease inhibitor cocktail, thermo scientific, rockford, ll usa)使组织匀浆以用于细胞因子分析。之后，在4℃下以10,000 g将样品离心30分钟，收集上清液并在-80℃下储存。使用bicinconinic acid测定(bca)分析蛋白质浓度，并用蛋白质组分析仪大鼠细胞因子阵列试剂盒(r&d systems, minneapolis, mn))评估细胞因子活性。该大鼠细胞因子阵列试剂盒包含在硝酸纤维素膜上一式两份的对照抗体。将封闭缓冲液加入到4孔板中，并将膜孵育一小时。将含有26种不同的生物素化的检测抗体的溶液(400 μg/μl)在室温下孵育一小时，并
替换从孔中去除的封闭缓冲液。将膜放置在振荡器(microjive shaker, boekel scientific, feasterville, pa)上，并在-4℃下孵育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤膜3次，以去除未结合的材料。之后，将链霉亲和素-hrp和化学发光检测试剂加入到膜中，这导致出现点。这些的位置、大小和颜色对应于结合的选择细胞因子的量(参见图17-18)。使用数字块扫描仪(chemidoc western blot digital 成像系统, bio-rad, hercules, ca)扫描膜，并使用hlimage (western vision software, salt lake city, ut)分析。
30.也获取直肠和邻近的1.5 cm结肠组织的部分，并保存在4%多聚甲醛(pfa)中，转移到70%乙醇中进行苏木精和曙红(h&e)染色，并包埋在石蜡中。将该组织纵向切成5 μm厚，并放置在带电显微镜载玻片上(globe scientific; mahway, nj)。
31.将载玻片在二甲苯中脱蜡洗涤三次，然后用100%乙醇(2
×
)和95%乙醇(2
×
)进行一系列醇漂洗以使组织水合。将载玻片放置在苏木精7211中，并在发蓝试剂浴后使用曙红-y区分。在曙红-y漂洗之前，对载玻片进行一次95%乙醇洗涤。然后通过将载玻片放置在100%乙醇中洗涤三次，而将载玻片再次脱水，并在用cytoseal 60 (fisher scientific, hampton, nh)盖上盖玻片之前用二甲苯替代物洗涤清洗。
32.苏木精-曙红y染色的切片用于使用半定量评分规则来评估炎性细胞的浸润、隐窝变形和侵蚀。(表3)。使用0-4的评分规则评估上皮损伤和炎性细胞浸润的组织学疾病严重性。将两个评分的总和合并以提供组织学总体损伤评分8。中间栏描述基于形态学、杯状细胞损失、隐窝损失和大面积隐窝损失的上皮损伤的幅度。右列描述基于渗透进入各个结肠层的深度的炎性细胞浸润的严重性。
33.表3：染色切片的评分
评分上皮损伤(e)浸润(i)0正常形态学无浸润1杯状细胞损失隐窝基础周围的浸润2大面积杯状细胞损失到达粘膜肌层的浸润3隐窝损失到达粘膜肌层的广泛浸润，具有大量水肿的粘膜增厚4大面积隐窝损失粘膜下层的浸润
具体地，基于0-4个等级独立地对上皮损伤和浸润评分，其中：0=正常形态学；1=杯状细胞损失；2=大面积杯状细胞损失；3=隐窝损失；4=大面积隐窝损失。如下指定浸润评分：0=无浸润；1=隐窝基础周围的浸润；2=到达粘膜肌层的浸润；3=到达粘膜肌层的广泛浸润并且具有大量水肿的粘膜增厚；4=粘膜下层的浸润。上皮损伤和浸润两者的总和导致总组织病理学最大评分为8。
34.与ibd症状学一致的被认为是
‘
轻微’的dss化学品购自sigma-aldrich (mw：》500kda，批号bcbz5763)。诱导
‘
严重
’ꢀ
ibd症状学的dss化学品购自fisher scientific (mw：35-50 kda，项目# aaj6360622)。除非另有说明，否则所有其它化学品均购自sigma-aldrich，其它地方购买的化学品和药物在本文中注明。
35.由至少两个未盲试的实验室人员评估dai、粪便稠度和总出血，同时由两个盲试的实验室人员对组织病理学组织进行评分。使用具有graphpad prism软件(v8.3.0; san diego, ca)的双向方差分析(anova)分析数据，其中在可能时重复测量，并且使用fisher的lsd进行事后分析用于每天的治疗间比较。由于重量减轻、死亡率和/或其它排除标准，一些
数据集具有从排除在研究之外的动物中遗漏的值。对于这些数据，使用混合作用模型(reml)双向anova代替重复测量。动物数量的减少表示为具有一定数值范围的样品大小，其中较大的数值代表初始组大小，而较小的数值代表从研究中排除动物后的最低样品大小。提供每个动物组的样品大小范围，用于在整个实验时间表上进行的分析。另外，多个所述组的n值由分别表示所述第一组和第二组的斜杠分开。例如，比较
‘
dss’和
‘
dss fus
’ꢀ
(n=6-1/7-2)表示
‘
dss’组在所有天内具有最多6只动物的数据点和最少1只动物的数据点，而
‘
dss fus’组在所有天内具有最多7只动物的数据点和最少两只动物的数据点。对于每天分析，比较第5天的
‘
dss’和
‘
dss fus
’ꢀ
(n=4/5)表示在第5天
‘
dss’组具有4个数据点，而
‘
dss fus’组具有5个数据点。使用单向anova进行结肠长度比较，使用holm-sidak事后测试进行多重比较。数据显示为平均值
±
平均值的标准误差(sem)，并且在p《0.05时确定统计学显著性。
36.图3显示用聚焦超声治疗或不用聚焦超声治疗的dss动物的dai评分。动物接受水或dss。在这两组中是接受聚焦超声(fus) (
‘
dss fus’和
‘
水 fus’)的动物群和没有接受聚焦超声(
‘
dss’和
‘
水 模拟fus’，后者接受假超声时间)的动物群。与饮用自来水的动物(n=11-2)相比，“dss”组中的大鼠(n=7-1)在快如饮用dss一天后就表现出较高的dai评分。
‘
dss fus’组(n=8-4)具有较低的dai评分，指示不太严重的ibd症状学。因此，如本文所提供的，靶向腹腔丛的聚焦超声可以导致与ibd相关的症状的改进。
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间的dai评分的差异在第5天(n=5/4)首先显著，并且在第7天(n=2/4)、第9天(n=6/8)、第11天(n=6/8)和第12天(n=4/4)继续显著。星号(*)表示对于
‘
dss’相对于
‘
dss fus
’ꢀ
p≤0.05，而井号(#)表示对于
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus
’ꢀ
p≤0.05。
37.图3中的群代表百分之五(5%) dss，与
‘
水 模拟fus’对照组相比其诱导
‘
dss’组中的dai评分显著增加(n=7-1/11-2；p《0.001，图3)。这两组之间dai的差异在饮用dss一天之后是显著的(n=4/11；p=0.004)，直到实验在第12天结束(n=4/2；p《0.001)。当比较dss组时，在第5天(n=5/4，p=0.014)、第7天(n=2/4，p=0.047)、第9天(n=6/8，p=0.007)、第11天(n=6/8，p=0.022)和第12天(n=4/4，p=0.022)，那些接受聚焦超声的(
‘
dss fus’组)具有比那些没有接受聚焦超声的(
‘
dss’组)显著更健康的dai评分(n=8-4/7-2；p=0.045)。在第7天，注意到
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间的最大功效(n=2/4)，前者的dai评分为6
±
1.4，而后者组的dai评分为2.5
±
1.7。在
‘
水 fus’和
‘
水 模拟fus’之间没有报道dai评分的差异(n=11-2/5-1；p=0.222)。有趣的是，尽管聚焦超声在饮用dss的大鼠的总体dai评分中是有效的，在
‘
dss’组中未观察到重量减轻(图6)，这是包含dai评分的亚类之一，并且在实验期结束时使用5% dss的其它研究中时常被报告。
38.独立地检查dai的每个亚类，而不是作为综合指数，如在图4-6中所示。dai评分的亚类包含粪便稠度(图4)、总出血(图5)和重量减轻(图6)。在图4中，
‘
dss fus’组(n=7-2)中的动物显示比
‘
dss’组(n=8-4)中的动物更低的粪便稠度评分。早在第2天就观察到这种功效，与不用fus的那些相比，在第3、4、5和11天持续改进。在图5中，到第5天，在
‘
dss’组中可观察到总出血症状，而fus将总出血症状的出现延迟三天。具体地，
‘
dss fus’组与
‘
水 fus’组中的动物相比直到第8天的总出血没有差异。在图6中，在
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间或任何其它组之间的重量减轻没有观察到差异。星号(*)表示对于
‘
dss’相对于
‘
dss fus
’ꢀ
p≤0.05，而井号(#)表示对于
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus
’ꢀ
p≤0.05。当与
‘
水 模拟fus’和
‘
水 fus’组中的大鼠相比时，摄取dss引起松散且流动的粪便稠度评分(例如，
‘
dss’相对于
‘
水
模拟fus’：n=6-1/5-1，p《0.001；
‘
dss’相对于
‘
水 fus’：n=6-1/11-2，p《0.001)。具体地，粪便稠度评分到第2天显著恶化，并且比起用聚焦超声或不用聚焦超声的饮用水的大鼠持续具有更高的评分，直到实验结束(对于所有天数的两个水组比较，p《0.001，图4)。水组中的大鼠，无论它们是否接受聚焦超声，具有相似的粪便稠度评分(
‘
水 模拟fus’相对于
‘
水 fus’；p=0.113)。关于
‘
dss fus’组中的大鼠，从第4-5天和第7-12天，粪便稠度明显比
‘
水 fus’组中的大鼠更差。然而，
‘
dss fus’组的大鼠比
‘
dss’组表现出更好的粪便稠度(n=7-2/8-4；p=0.008)，并且特别是在第2天(n=8/7；p《0.001)、第3天(n=4/5；p=0.006)、第4天(n=8/7；p=0.006)、第5天(n=4/5；p=0.010)和第11天(n=8/6；p=0.036) (图4)。在第2天看到聚焦超声的最大改进，其中
‘
dss’组的粪便稠度严重性评分为2.2
±
1.0，而
‘
dss 聚焦超声’组的评分为0.8
±
0.3。
39.dss和fus对粪便稠度的作用可以在衍生自死后大鼠结肠的摄影图像的代表性图像(图7)中观察到。与
‘
水 1x fus’组中的那些相比，接受dss的动物的结肠含有未形成的小粒或缺乏粪便(顶部箭头)，尤其是在结肠的远端部分。相反，接受dss和fus (
‘
dss 1x fus’)的动物在fus处理两周后显示完整的和
‘
规则的’小粒形状(底部箭头)，与在
‘
水 1x fus’组中观察到的那些相似。粪便稠度评分是从每天早晨从动物新鲜排泄的粪便样品获得的。然而，当处死动物时当在实验结束时检查大鼠结肠时，稠度也是目测可证实的。然后，
‘
dss fus’组(图7，图的底部)具有比
‘
dss’组中的大鼠(其粪便几乎没有形状或存在粪粒(图7，图的顶部))看起来更健康的组织和更硬的粪粒，其更接近地类似于仅饮用自来水的动物(图7，图的中部)。
40.除了在第6天(n=1/1；p=0.181)外，从第5天(n=5/3；p=0.05)开始直至第12天(n=4/3；p=0.002)，
‘
dss’组中的动物具有比
‘
水 模拟fus’动物(n=7-1/5-1；p=0.002)更差的总体总出血评分(图5)。在整个12天期间，
‘
水 fus’组和
‘
水 模拟fus’组之间的总出血相似(p=1.000)。值得注意的是，
‘
dss fus’组中的动物与
‘
dss’组中的动物相比具有显著改进的总出血评分(n=7-2/8-4；p=0.015)，其首先在第5天(n=4/5，p=0.048)、然后在第7天(n=4/2p=0.047)、第9天(n=8/6，p=0.001)和第11天(n=8/6，p=0.020)观察到(图5)。在第9天可见
‘
dss’组总出血的最大改进，其中
‘
dss’组的评分为3.0
±
0.7，而
‘
dss fus’组的评分为1.1
±
0.4。此外，使用聚焦超声将总出血症状的出现延迟大约3天。具体地，
‘
dss’组中的大鼠到第5天表现出超过1的总出血评分。相反，
‘
dss 聚焦超声’组在第8天首先表现出超过1的评分。
41.尽管饮用5% dss溶液12天的大鼠与ibd样症状(例如具有松散和水样粪便稠度的血性粪便)一致，在dss啮齿动物模型中没有看到重量减轻的标志性症状。事实上，尽管已经每天饮用这种溶液持续2周，饮用dss的动物的体重增加，并且在所有组中都看到了这种趋势(
‘
dss’相对于
‘
dss fus’：n=7-1/8-4，p=0.534；
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus’：n=8-4/5-1，p=0.577；
‘
水 fus’相对于
‘
水 模拟fus’：n=5-1/5-1，p=0.15) (图6)。有趣的是，在第2天和第3天，唯一的重量减轻短暂地发生在
‘
dss fus’组中。
42.假定没有显著的和长期的重量减轻，
‘
dss’组中的大鼠仅表现出12中的6.7的最大dai评分，其低于通常在高浓度啮齿动物dss模型中报道的值。为了产生更严重的ibd症状，然后使用40 kd的dss制剂代替用于引起上述轻微胃肠损伤的初始》500 kd制剂。然后用更有效的dss制剂进行第二组实验，以更好地概括严重ibd症状学，使得可以评估fus对这种
ibd症状学的严重性的功效。
43.研究较小尺寸的dss化学品以确定该模型是否引发ibd症状学，该症状学更好地概括了严重ibd模型。在两周内监测给予4%、5%、7%或9% dss的不同组的大鼠(图8)。基于这些结果，7% dss诱导最严重的ibd样症状学，在第10天的最大dai评分为12。相反，9% dss引起高死亡率和/或由于到第4-6天》20%重量减轻而引起大鼠被排除在研究之外，并且5% dss仅诱导最大dai评分为10。给定优化数据，使用较新dss制剂的7% dss浓度来研究非侵入性聚焦超声作为严重ibd症状学的治疗的功效。
44.为了改善具有7% dss浓度的
‘
严重
’ꢀ
dss模型中的ibd症状学，使用与
‘
轻微’模型相同的聚焦超声参数。然而，初步发现揭示dai评分没有改进(数据未显示)，其中
‘
dss fus’组中的动物具有
‘
dss’组中看到的相似的缩短的结肠长度(图15a)。从初始实验中确定需要更大剂量的聚焦超声来实现有效的肠cap刺激以减轻ibd严重性的增加。因此，非侵入性聚焦超声每天施加两次(
‘
2x fus’)而不是每天施加一次，以提供聚焦超声疗法的“剂量”的平行增加。
45.图9显示2x聚焦超声对该组中dai评分的作用。与饮用dss并接受模拟2x fus的动物相比，每天两次向饮用dss的大鼠给予fus改进了dai症状。在第5天(n=6/6)注意到dai评分的改进，并且在第7天(n=6/5)再次注意到。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。尽管
‘
dss 2x fus’组具有比
‘
水 2x fus’组显著更高(更差)的dai评分(n=6-1/6-1；p《0.001)，它们低于
‘
dss 模拟2x fus’组中的dai评分(n=6-1/6-1；p=0.046)。具体地，到第5天(n=6/6；p=0.037)和第7天(7.5
±
1.3相对于4.8
±
0.6，n=6/5；p=0.002)，不用聚焦超声(
‘
模拟2x fus’)的饮用dss的大鼠比接受2x聚焦超声的具有dss的动物具有显著更高的评分。在第12天动物也可能表现出fus功效，但样品大小排除任何结论(10.0
±
0.0相对于6.0
±
0.0，n=1/1) (图9)。最大功效发生在第7天。有趣的是，在第8、9、10和11天，
‘
dss 模拟2x fus’动物和
‘
dss 2x fus’动物之间没有看到变化(分别p=0.11、0.62、0.80、0.29)，这可能是由于在
‘
dss 模拟2x fus’组中具有最高dai评分的三只动物由于第7天(dai：11；12)和第8天(dai：10)之间的死亡率而从数据中排除。在这段时间内
ꢀ‘
dss 2x fus’组中的动物没有死亡。
46.图10-12详细显示dai的每个亚类。图10显示fus对粪便稠度评分的作用。当与
‘
dss 2x模拟fus’组(n=6-1)中的那些相比时，饮用dss并接受2x fus的动物(n=6-1)表现出改进的粪便稠度。从第4天(n=6/6)至第7天(n=6/5)注意到显著改进。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。井号(#)表示对于
‘
dss 2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。接受2x聚焦超声或2x模拟聚焦超声的饮用水的动物之间没有差异(
‘
水 2x fus’相对于
‘
水 模拟2x fus’：n=6-1/6-2；p=0.068) (图10)。相反，
‘
dss 模拟2x fus’组中的动物具有比
‘
水 模拟2x fus’组中的动物更差的粪便稠度评分(n=6-1/6-2；p《0.001)，从第2天(n=6/6；p《0.001)开始至第12天(显著性符号未显示)。每天两次给予的超声改进饮用dss的大鼠的粪便稠度(
‘
dss 模拟2x fus’相对于
‘
dss 2x fus’：n=6-1/6-1；p《0.001) (图10)，这到第4天首先观察到。后一组表现出粪便稠度评分为0.5
±
0.34，而前一组的评分为1.5
±
0.22 (n=6/6；p=0.003)。组间的最大差异是在第5天，其中
‘
dss 模拟2x聚焦超声’组(n=6)的评分为2.2
±
0.40，而
‘
dss 2x聚焦超声’组(n=6)的评分为1.0
±
0.0。在第7天，粪便稠度的改进持续，其中
‘
dss 2x fus’组的粪便稠度为2.4
±
0.24 (n=6)。相反，用2x模拟fus
的饮用dss的动物的评分为3.3
±
0.21 (n=5；p=0.008)。值得注意的是，在第7天和第8天之间，具有最高粪便稠度评分4的
‘
dss 2x模拟fus’组中两只动物死亡。
47.图11a显示fus对总出血评分的作用。饮用dss但接受fus (
‘
dss 2x fus’；n=6-1)的动物在第5天(n=6/6)至第8天(n=4/5)具有比接受模拟fus (
‘
dss 模拟2x fus’；n=6-1)的动物更低的总出血评分。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。井号(#)表示对于
‘
dss 2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。图11b显示在第7天和第8天，来自接受dss 1x fus以及dss 2x模拟fus的不同治疗组和对照组的动物的大鼠的代表性照片，由于来自严重疾病模型中的结肠内的血液停滞，其具有较暗的血液。相反，与
‘
dss 模拟2x fus’中的动物相比，
‘
dss 2x fus’动物在总出血方面显示视觉上的改进。
‘
dss 模拟2x fus’组具有肛门和粪便的总出血，而
‘
水 2x fus’组中的动物没有(n=6-1/6-1；p《0.001)。症状首先在第5天出现(n=3/6；p=0.003)，持续至第9天(n=3/6；p《0.001)，并且可能持续至第12天，尽管这与有限的样品大小(n=3/1)一致(图11a)。与粪便稠度的发现类似，当与
‘
dss 2x模拟fus’组相比时，
‘
dss 2x fus’组中的动物的总出血减少(n=6-1/6-1；p=0.012)。到第5天首次看到功效(n=6/6；p=0.006)，其中接受2x聚焦超声的组的评分为0.0
±
0.0，而不用聚焦超声的饮用7% dss的动物的评分为0.83
±
0.31。改进的总出血延长至第8天，其中
‘
dss 2x模拟fus’组的评分为3.75
±
0.25，而
‘
dss 2x fus组的评分为3.0
±
0.0 (n=4/5；p=0.028)。两组之间总出血评分的最大分离发生在第6天。
‘
dss 模拟2x fus’组表现出评分为2.0
±
0.26，而
‘
dss 2x fus’组的评分为0.83
±
0.30。在
‘
dss 2x模拟fus’组中，在第7天具有4的最严重总出血评分的两只动物在第8天之前死亡(图11a)。
48.图12显示重量变化作为基线的百分比，其中负值代表重量减轻。在实验结束时，用fus或不用fus的dss组重量减轻，而水组增加重量。在接受2x fus (n=6-1)或模拟2x fus (n=6-1)的dss组之间没有观察到差异。十字符号(
†
)表示对于
‘
水 模拟2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。
‘
水 模拟2x fus’组(n=6-2)中的大鼠在12天期间体重增加，但是饮用水并给予2x聚焦超声(n=6-3)的那些没有以相同的速率增加体重(p《0.001)。事实上，
‘
水 2x fus’组在实验的前4天中重量减轻。在第5天，
‘
水 模拟2x fus’大鼠自第1天起增加6.1
±
0.8%体重，而“水 2x fus”组中的大鼠自第1天起体量减轻1.4
±
0.5% (n=6/6；p《0.001)。在
‘
dss 2x fus’组中也看到重量减轻。然而，这可能很大程度上反映2x fus的作用，而不是ibd症状学的严重性，这是考虑到动物具有更坚实的粪便、较少的出血，几乎没有明显的痛苦，并且在它们的笼子中主动活动并显示探究行为。此外，在
‘
水 2x fus’组中也注意到类似的重量减轻趋势。相反，
‘
dss 模拟2x fus’动物也重量减轻(n=6-1)，但是当处理时，尽管与
‘
dss 2x fus’组(p=0.690)中的动物具有相似的重量减轻，它们仍表现出活动性的严重损害和嗜睡，图12。
49.图13-14显示
‘
dss 2x fus’组(n=6-1)和
‘
dss 模拟2x fus’组(n=6-1)中的单个动物的粪便稠度(图13)和总出血(图14)评分。图上的每条线代表单个动物，而与这些线相邻的每个箭头指示评分
‘
下降’。这突出了改进的症状学的实例。在粪便稠度评分中(图13)，在
‘
dss 2x fus
’ꢀ
(n=6-1)组中存在14个下降，如箭头的数量所示。相反，
‘
dss 模拟2x fus’组(n=6-1)仅具有2个下降。图14还显示
‘
dss 2x fus’动物表现出比
‘
dss 模拟2x fus’动物更高数量的总出血评分下降。将评分作图以跟踪12天期间的变化。通常，
‘
dss 2x fus’组(n=6-1)中的动物表现出比
‘
dss 模拟2x fus’对照动物(n=6-1)更高数量的dai亚类评分的逐
日降低。具体地，
‘
dss 模拟2x fus’组中的大鼠表现出粪便稠度严重性评分持续恶化，仅观察到2次摇摆；一个发生在第2天和第3天之间，而另一个发生在第4天和第5天之间(红色下降箭头，图13)。相反，接受超声的大鼠(
‘
dss 2x fus’)表现出更大的摇摆和粪便稠度严重性的更多逐日改进，其中在整个12天实验中观察到14次摇摆(下降箭头) (图13)。对于单个动物的总出血评分(图14)，除了在第8天和第9天之间以及第10天和第11天之间观察到的两次摇摆时机外，在
‘
dss 模拟2x fus’组中的大鼠在总出血症状学中显示持续增加(恶化)，看到类似的发现。然而，
‘
dss 2x fus’组中的大鼠的评分具有许多向下摇摆的情况，特别是在第3天和第5天之间实验的前半部分中，具有三次摇摆。在第10天和第12天之间还发生另外三次摇摆(图14)。在粪便稠度和总出血终点方面分析，“下降”的数量或严重性评分的逐日改进在接受2x聚焦超声的饮用dss的大鼠中显著高于用2x模拟聚焦超声的饮用dss的那些大鼠(p=0.012)。
50.图15a显示结肠长度的组数据。如x轴上所示，某些组接受水，而其它组接受dss。在图15b中显示图15a中的组数据的代表性图片，其中以结肠旁边的标尺作为参考。照片不是按比例的，而是相对于彼此定尺寸。与
‘
dss 模拟2x fus’对照组相比，当比较
‘
dss 2x fus’组中的动物时，小粒形状保持完整。星号(*)表示p《0.05，并且ns表示没有显著差异。结肠长度的减少是dss诱导的ibd的另一个重要的终点度量。尽管
‘
dss 2x fus’组具有比
‘
水 2x fus’组中的动物显著更短的结肠长度(p=0.016相对于；n=5/6)，其仍然比
‘
dss 模拟2x fus’组中的动物(13.8
±
0.3 cm，n=5/4；p=0.013)更完整和更长(18.5
±
1.8 cm) (图15a-b)。每天接受每天一次给予聚焦超声(
‘
dss 1x fus’)的大鼠与
‘
dss 模拟1x fus’对照组相比没有改进结肠长度，其中前者为14.1
±
0.50 cm (n=4)而后者为13.0
±
0.3 cm (n=3；p=0.958)。在
‘
水 2x fus’组(n=6)和
‘
水 2x模拟fus’组(n=5)的动物之间没有注意到结肠长度的差异，其中长度分别为22.7
±
0.5 cm和22.6
±
0.4 cm (p=0.958)。
51.图16a-c显示组织病理学数据。处死后立即将结肠远端2 cm切片保存在多聚甲醛中。切片用苏木精和曙红y染色处理。在图16a中，显示与用2x聚焦超声的dss动物(右图)相比，用模拟聚焦超声治疗的饮用dss的动物中结肠远端切片的粘膜损伤(左图)。存在隐窝基底和深层粘膜下层的损伤和浸润增加。图16b显示接受dss的动物中炎性因子的特写(右上图像)，这在接受dss 2x fus的动物中看不到(右下图像)。图16c是从半定量分析的评分标准得到的分组数据。从
‘
水 模拟2x fus
’ꢀ
(n=2)、
‘
水 2x fus
’ꢀ
(n=3)、
‘
dss 模拟2x fus
’ꢀ
(n=6)和
‘
dss 2x fus
’ꢀ
(n=5)组中的动物获取结肠。
‘
dss 模拟2x fus’组中的那些具有最高的组织病理学评分8，其在实验结束时表现出最大的上皮损伤和炎性细胞浸润(图16b：右上图像相对于右下图像)。饮用dss并接受2x聚焦超声的大鼠具有比
‘
水 2x fus’组(平均评分：0.4，sem：0.4)和
‘
水 模拟2x fus’组(平均评分：1.8，sem：0.5)更高的组织病理学评分(平均评分：6.3，sem：0.8) (p《0.001)。然而，在饮用7% dss的同时接受2x聚焦超声仍然与比
‘
dss 模拟2x fus’动物更健康的结肠一致(平均评分：8.0，sem：0.0) (p=0.022) (图13c)。
‘
水 2x fus’和
‘
水 模拟2x fus’组之间没有差异(p=0.173) (图16c)。
52.在“朴素”、“水 2x fus”、
ꢀ“
dss 2x模拟fus”和“dss 2x fus”组(n=4只大鼠/组)中，从大鼠结肠评估细胞因子活性。在使用大鼠细胞因子阵列检测的29种细胞因子中(图17)，发现七种细胞因子具有一致的结果，导致
‘
朴素’相对于
‘
dss 2x模拟fus’；
‘
水 2x fus’相对于
‘
dss 2x模拟fus’；
‘
dss 2x模拟fus’相对于
‘
dss 2x fus’之间的显著差异(图
18)。具体地，睫状神经营养因子(cntf)、分形趋化因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、由γ干扰素诱导的、受激活调节的单核因子(mig)、表达和分泌的正常t细胞 (rantes)、肿瘤坏死因子-α (tnf-α)和胸腺趋化因子在用模拟2x fu的饮用dss的大鼠中比朴素大鼠或用2x fu的饮用水的大鼠增加。此外，在饮用dss但也接受2x fus的动物中，这些都降低至
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’水平(图18，下图)。
53.在10种白细胞介素细胞因子中的8种(图20)中注意到类似的应答模式，其中il-1β、il-2、il-3、il-4、il-6、il-10、il-13和il-17均在用2x模拟fus的饮用dss的动物中比
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’动物组升高。这些在饮用dss同时还接受2x fus的动物中恢复到
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’水平(图19，下图)。最后，观察到8种对dss和/或fus具有更可变应答的其它细胞因子(图20)。特别是，il-1α和il-1ra是检测定剂盒中的2种其它白介素。il-1ra水平在不用2x fu的饮用dss的动物中比
‘
朴素’或
‘
水 2x fus’动物没有升高，而在
‘
dss 2x fus’动物中，il-1α水平高于
‘
水 2x fus’动物，但不高于
‘
朴素’大鼠(图21，下图)。无论如何，在用2x fus的饮用dss的动物中，两种白细胞介素均比不用2x fus的饮用dss的那些动物减少。在不用2x fus的饮用dss的动物中，干扰素γ (ifn-γ)水平比“朴素”和“水 2x fus”组增加，但是用2x fus的饮用dss的动物的干扰素γ (ifn-γ)水平降低(图20，下图))。这种降低仍然高于
‘
朴素’大鼠中所见的水平，但与用2x fus的饮用水的那些动物没有区别。并不奇怪，对于干扰素γ诱导的蛋白10 (ip-10，也称为cxcl10)观察到类似的变化模式。在不用2x fus的饮用dss的动物中比
‘
朴素’大鼠减少的唯一细胞因子是lix (也称为cxcl5)。水平不受2x fus影响。
54.最后，在所有四个动物组之间7个细胞因子保持不变，无论饮用水或dss，用2x fus和不用2x fus；这包括金属蛋白酶的组织抑制剂(timp-1) (图20，下图)以及细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1 (cinc-1)、cinc2α/β、cinc-3、巨噬细胞炎性蛋白-1α (mip-1α)、可溶性细胞间粘附分子-1 (sicam-1)和l-选择素(数据未显示)。
55.所公开的神经调制技术可以与神经调制系统结合使用。图21是用于神经调制以实现神经递质释放和/或激活对施加能量响应的腹腔丛的神经节中的一个或多个突触的部件(例如，突触前细胞、突触后细胞)的系统10的示意图。例如，可以使用聚焦超声来调制腹腔丛的神经节中的一个或多个突触。所描述的系统包括耦合到能量施加装置12 (例如，超声换能器)的脉冲发生器14。能量施加装置12被配置为例如经由导线或无线连接接受能量脉冲，所述能量脉冲在使用中被引导到受试者的内部组织或器官的感兴趣区域，这进而导致靶向的生理结果。在某些实施方案中，脉冲发生器14和/或能量施加装置12可以植入在生物相容的部位(例如腹部)，并且一根或多根导线将能量施加装置12和脉冲发生器14内部耦合。例如，能量施加装置12可以是mems换能器，例如电容式微机械超声换能器。
56.在某些实施方案中，能量施加装置12和/或脉冲发生器14可以例如与控制器16无线通信，该控制器可以进而向脉冲发生器14提供指令。在其它实施方案中，脉冲发生器14可以是体外装置，例如，可以经皮或以非侵入方式从受试者身体外部的位置施加能量，并且在某些实施方案中，可以集成在控制器16内。在其中脉冲发生器14在体外的实施方案中，能量施加装置12可以由照料者操作，并且定位在受试者皮肤上或上方的部位，使得能量脉冲经皮递送至期望的内部组织。一旦定位成将能量脉冲施加到期望的部位，系统10可以启动神经调制以实现靶向的生理结果或临床作用。
57.在某些实施方案中，系统10可以包括评估装置20，其耦合到控制器16并且评估指示是否已经实现调制的靶向的生理结果的特性。在一个实施方案中，靶向的生理结果可以是局部的。例如，调制可以导致局部组织或功能变化，例如组织结构变化、某些分子浓度的局部变化、组织位移、增加的流体运动等。
58.调制可以导致全身性或非局部变化，并且靶向的生理结果可以与循环分子的浓度变化或不包括向其直接施加能量的感兴趣区域的组织的特性变化相关。在一个实例中，位移可以是期望的调制的替代测量，并且低于预期位移值的位移测量可以导致调制参数的修改，直到诱导预期的位移值。因此，在一些实施方案中，评估装置20可以被配置为评估浓度的变化。在一些实施方案中，评估装置20可以是成像装置，其被配置为评估器官大小和/或位置的变化。虽然单独显示系统10的所描述的元件，应当理解，一些或所有元件可以彼此组合。此外，一些或所有元件可以以有线或无线方式彼此通信。
59.基于评估，可以改变控制器16的调制参数。例如，如果期望的调制与在限定的时间窗内(例如，在能量施加程序开始之后5分钟、30分钟)或相对于程序开始时的基线的浓度(一种或多种分子的循环浓度或组织浓度)的变化相关联，则可以期望调制参数(例如脉冲频率或其它参数)的变化，其进而可以由操作者或经由自动反馈回路提供给控制器16，用于限定或调节脉冲发生器14的能量施加参数或调制参数。
60.如本文所提供的系统10可以根据各种调制参数并且作为治疗方案的一部分提供能量脉冲。例如，调制参数可以包括从连续到间歇范围内的各种刺激时间模式。使用间歇刺激，在信号接通时间期间以某一频率在一段时间内递送能量。信号接通时间之后是没有能量递送的时间段，称为信号断开时间。调制参数还可以包括刺激施加的频率和持续时间。施加频率可以是连续的，或者在各种时间段(例如在一天或一周内)递送。治疗方案持续时间可以持续各种时间段，包括但不限于几分钟至几小时。在某些实施方案中，具有指定刺激模式的治疗持续时间可以持续一小时，以例如72小时的间隔重复。在某些实施方案中，治疗可以以较高的频率递送，例如每三小时，持续较短的持续时间，例如30分钟。根据调制参数(例如治疗持续时间和频率)可以可调节地控制能量的施加以实现期望的结果。
61.聚焦超声能量可以聚焦在感兴趣区域22上，其可以是包括腹腔丛的至少一部分的内部结构、组织或器官。例如，感兴趣区域可以包括腹腔丛的神经节(ganglion)或神经节(ganglia)。可以通过向聚焦在靶组织的感兴趣区域22上的能量施加装置12的聚焦场内的突触直接施加能量来刺激感兴趣区域22内的突触，以引起分子释放到突触空间中和/或离子通道活动的变化，这进而引起下游作用，例如肠cap的激活。可以选择感兴趣区域22以包括腹腔丛的特定神经节，而排除腹腔丛的不同神经节(并且还排除不是腹腔丛的一部分的神经节)。因此，可以选择感兴趣区域22以对应于具有或邻近期望的神经节或神经节的靶组织的一部分。可以选择能量施加以优先触发从突触内神经释放一种或多种分子(例如神经递质)。
62.在一个实施方案中，可以将能量施加到两个或更多个感兴趣区域22。在一些实施方案中，可以选择能量施加参数以诱导组织内直接接受能量的神经或非神经元部件的优先激活，以诱导期望的组合生理作用。在某些实施方案中，能量可以聚焦或集中在小于约25mm3的体积内。在某些实施方案中，能量可以聚焦或集中在约0.5mm
3-50mm3的体积内。用于将能量聚焦或集中在感兴趣区域22内的聚焦体积和聚焦深度可以受到能量施加装置12的
尺寸/结构的影响。能量施加的聚焦体积可以由能量施加装置12的聚焦场限定。
63.如本文所提供的，可以将能量基本上仅施加到一个或多个感兴趣区域22，以靶向方式优先激活突触，以实现靶向的生理结果，而基本上不以一般或非特异性方式施加到整个组织。因此，仅有多个不同类型的神经节的子集暴露于直接能量施加。例如，可以在空间上选择含有血管、神经或其它解剖界标的器官内的感兴趣区域，并用于识别具有特定轴突终端和突触的区域。在一个实施方案中，通过识别脾或肝动脉并在空间上选择接近或平行于脾或肝动脉的区域来选择感兴趣区域。可以基于亚器官组织功能、血管和神经支配来分割器官架构，并且可以选择轴突末端的子集以包括在向其直接施加能量的感兴趣区域中。其它神经节或神经结构可以在感兴趣区域22外部，并且可以不暴露于直接施加的能量。可以基于包括但不限于历史或实验数据(例如，显示特定位置与期望的或靶向的生理结果的关联的数据)的因素来选择感兴趣区域22。作为另外一种选择或除此之外，系统10可以将能量施加到腹腔丛的单个神经节，直到实现期望的靶向的生理作用。
64.图22是系统10的某些部件的框图。如本文所提供的，用于神经调制的系统10可以包括脉冲发生器14，其适于产生用于施加到受试者的组织的多个能量脉冲。脉冲发生器14可以是独立的，或者可以集成到外部装置(例如控制器16)中。控制器16包括用于控制装置的处理器30。软件代码或指令存储在控制器16的存储器32中，用于由处理器30执行以控制装置的各种部件。控制器16和/或脉冲发生器14可以经由一个或多个导线33或无线地连接到能量施加装置12。
65.控制器16还包括具有输入/输出电路34和显示器36的用户界面，其适于允许临床医生向调制程序提供选择输入或调制参数。每个调制程序可以包括一组或多组调制参数，包括脉冲幅度、脉冲宽度、脉冲频率等。脉冲发生器14响应于来自控制器装置16的控制信号修改其内部参数，以改变通过导线33传输到向其施加能量施加装置12的受试者的能量脉冲的刺激特性。可以采用任何合适类型的脉冲发生电路，包括但不限于恒定电流、恒定电压、多个独立的电流或电压源等。所施加的能量是电流幅度和脉冲宽度持续时间的函数。控制器16允许通过改变调制参数和/或在某些时间启动能量施加或在某些时间取消/抑制能量施加来可调节地控制能量。在一个实施方案中，能量施加装置的可调节的控制基于关于受试者中一种或多种分子(例如，循环分子，例如与ibd相关的生物标志物)的浓度的信息。如果信息来自评估装置20，则反馈回路可以驱动可调节的控制。例如，如果如由评估装置20测量的循环ibd生物标志物浓度高于预定的阈值或范围，则控制器16可以启动对感兴趣区域的能量施加，并且利用与生物标志物的减少相关的调制参数。能量施加的启动可以由ibd生物标志物漂移到超过预定的(例如，期望的)阈值或预定义的范围之外而触发。在另一个实施方案中，当能量的初始施加在预定的时间范围(例如，1小时、2小时、4小时、1天)内没有导致靶向的生理结果(例如，感兴趣分子的浓度)的预期变化时，可调节的控制可以是改变调制参数的形式。
66.在一个实施方案中，存储器32存储可由操作者选择的不同操作模式。例如，所存储的操作模式可以包括用于执行与特定治疗部位相关联的一组调节参数的指令。不同的部位可以具有不同的相关的调制参数。控制器16可以被配置为基于选择来执行适当的指令，而不是让操作者手动输入模式。在另一个实施方案中，存储器32存储用于不同类型治疗的操作模式。例如，激活可以与相对于与抑制或阻断组织功能相关联的刺激压力或频率范围不
同的刺激压力或频率范围相关联。在具体的实例中，当能量施加装置是超声换能器时，时间平均功率(时间平均强度)和峰正压在1 mw/cm
2-30,000 mw/cm
2 (时间平均强度)和0.1 mpa-7 mpa (峰值压力)的范围内。在一个实例中，在感兴趣区域中时间平均强度小于35 w/cm2，以避免与热损伤和消融/空化相关联的水平。在另一个具体实例中，当能量施加装置是机械致动器时，振动的振幅在0.1-10 mm的范围内。所选频率可以取决于能量施加的模式，例如超声或机械致动器。
67.在另一个实施方案中，存储器32存储校准或设置模式，其允许调节或修改调制参数以实现期望的结果。在一个实例中，刺激以较低能量参数开始，并且自动地或在接受到操作者输入时递增地增加。以这种方式，操作者可以在改变调制参数时实现对诱导的作用的调谐。
68.系统还可以包括成像装置，例如成像换能器40，当能量施加装置12在来自控制器16的指令下以成像模式操作时通过获取成像数据来促进聚焦能量施加装置12。能量施加装置12可以包括超声治疗换能器42，当在来自控制器16的指令下以治疗模式操作时其能够将聚焦超声能量施加到感兴趣区域22内的靶。能量施加装置12可以包括用于控制成像换能器40和/或超声治疗换能器42的控制电路。处理器30的控制电路可以集成到能量施加装置12 (例如，经由集成控制器16)或者可以是单独的部件。成像换能器40还可以被配置为获取图像数据以辅助在空间上选择期望的或靶向的感兴趣区域并将所施加的能量聚焦在靶组织或结构的感兴趣区域上。
69.在一个实施方案中，成像设备(换能器40)可以与能量施加设备12集成或与其相同，使得施加不同的超声参数(频率、孔径或能量)以用于选择(例如，在空间上选择)感兴趣区域并且用于将能量聚焦到所选择的感兴趣区域以用于靶向和随后的神经调制。在另一个实施方案中，存储器32存储一个或多个用于在空间上选择器官或组织结构内的感兴趣区域的靶向或聚焦模式。空间选择可以包括选择器官的子区域以识别对应于感兴趣区域的器官体积。在空间上选择可以依赖于如本文所提供的图像数据。在一个实施方案中，可以将控制器16编程为自动识别或基于图像数据来选择感兴趣区域。在实施方案中，图像数据可以在显示器36上显示，并且操作者可以指定对应于感兴趣区域的图像的部分。基于用户输入，控制器16可以选择感兴趣区域。基于空间选择，能量施加装置12可以聚焦在对应于感兴趣区域的所选体积上。例如，能量施加装置12可以被配置为首先以成像模式操作以施加成像模式能量，该成像模式能量用于捕获要用于识别感兴趣区域的图像数据。成像模式能量不在适于优先激活的水平和/或施加调制参数。然而，一旦识别感兴趣区域，控制器16然后可以根据与如本文所提供的与神经调制相关联的调制参数在治疗模式中操作。
70.控制器16还可以被配置为接受与靶向的生理结果相关的输入作为对调制参数的选择的输入。例如，当使用成像模态来评估组织特性时，控制器16可以被配置为接受特性的计算的指数或参数。基于该指数或参数是高于还是低于预定的阈值，可以修改调制参数。在一个实施方案中，参数可以是受影响组织的组织位移的度量或受影响组织的深度的度量。其它参数可以包括评估一个或多个感兴趣分子的浓度(例如，评估相对于阈值或基线/对照的浓度变化、变化率、确定浓度是否在期望的范围内中的一个或多个)。此外，能量施加装置12可以在控制器16的控制下操作，以a)获取组织的图像数据，其可以用于在空间上选择靶组织内的感兴趣区域，b)将调制能量施加到感兴趣区域，以及c)获取图像数据，以确定靶向
的生理结果已经发生(例如，经由位移测量)。在这样的实施方案中，成像装置、评估装置20和能量施加装置12可以是相同的装置。
71.在另一个实现中，还可以由控制器16存储期望的调制参数组。以这种方式，可以确定受试者特异性参数。此外，可以随着时间评估这样的参数的有效性。如果特定的参数组随时间而不太有效，则受试者可能对激活的途径产生不敏感性。如果系统10包括评估装置20，则评估装置20可以向控制器16提供反馈。在某些实施方案中，可以从用户或评估装置20接受指示靶生理结果的特性的反馈。控制器16可以被配置为引起能量施加装置根据调制参数施加能量，并且基于反馈动态地调节调制参数。例如，基于反馈，处理器16可以实时地并且响应于来自评估装置20的反馈自动地改变调制参数(例如，超声波束或机械振动的频率、幅度或脉冲宽度)。
72.所公开的技术可以用于评估神经调制作用，其进而可以用作用于选择或修改神经调制参数的输入或反馈。所公开的技术可以使用组织状况或功能的直接评估作为靶向的生理结果。评估可以在神经调制之前(即，基线评估)、期间和/或之后发生。
73.评估技术可以包括功能磁共振成像、扩散张量磁共振成像、正发射断层摄影或声学监测、热监测中的至少一个。评估技术还可以包括蛋白质和/或标记物浓度评估。来自评估技术的图像可以由系统接受用于自动或手动评估。基于图像数据，也可以修改调制参数。例如，器官大小或位移的变化可以用作局部神经递质浓度的标志，并用作局部细胞暴露于调制神经递质的表型的替代标志，并有效地用作ibd途径的预测作用的标志。局部浓度可以指能量施加的聚焦场内的浓度。
74.除此之外或作为另外一种选择，系统可以评估组织中或血液中循环的一种或多种分子的存在或浓度。组织中的浓度可以称为局部浓度或驻留浓度。组织可以通过细针抽吸物获取，并且可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适的技术进行对感兴趣分子(例如，代谢分子、代谢途径的标志物、肽递质、儿茶酚胺)的存在或水平的评估。如本文所提供的，感兴趣分子可以是ibd生物标志物中的一种或一种或多种，其可以是细胞因子(tnf-α、il-1 β)、核周抗嗜中性粒细胞抗体、抗酿酒酵母抗体、钙防卫蛋白、c反应蛋白或抗鞭毛蛋白抗体。
75.在其它实施方案中，靶向的生理结果可以包括但不限于组织位移、组织大小变化、一种或多种分子的浓度变化(局部、非局部或循环浓度)、基因或标记物表达的变化、传入活性和细胞迁移等。例如，组织位移(例如，相邻动脉的血管位移)可以作为向组织施加能量的结果而发生。通过评估组织位移(例如，经由成像)，可以估计其它作用。例如，某一位移可以是分子浓度的特定变化的特性。
76.图23是用于神经调制腹腔丛的方法50的流程图。在方法50中，在步骤52获取受试者的图像数据，以识别受试者的可能包括待调制的期望的外周神经节的区域。例如，虽然使用超声图像使单个神经节可视化可能是有挑战性的，但是可以使用一个或多个可视化的解剖界标的识别来识别感兴趣区域。这样的视觉界标可以包括识别腹主动脉和与邻近腹腔丛的外周神经节的动脉的一个或多个接合处。在一个实例中，感兴趣区域可以定位为包括腹主动脉与肝动脉或与脾动脉的接合处。在另一实例中，可以基于与这样的接合处的相对位置(例如，间隔开1-10 mm)来选择感兴趣区域。在步骤54，能量施加装置被定位成使得能量脉冲聚焦在期望的感兴趣区域，并且在步骤56，脉冲发生器将多个能量脉冲施加到靶组织
的感兴趣区域，以优先激活位于感兴趣区域中的腹腔丛中的至少一部分外周神经节，例如，以刺激神经节释放神经递质和/或诱导改变的神经递质释放和/或诱导改变的活性，如本文所提供的。在实施方案中，感兴趣区域包含腹腔丛或腹腔丛的至少一部分。在实施方案中，感兴趣区域包含腹腔丛的外周神经节。在某些实施方案中，所述方法可以包括评估刺激作用的步骤。例如，可以使用组织功能或状况的状态的一个或多个直接或间接评估。基于所评估的组织功能，可以修改(例如，动态地或可调节地控制)一个或多个能量脉冲的调制参数以实现靶向的生理结果。
77.在一个实施方案中，可以在施加能量脉冲之前和之后进行评估，以评估感兴趣分子的浓度变化、粪便特性(粪便稠度、粪便血液存在)。在一个实施方案中，评估可以包括dai确定。如果评估标记高于或低于阈值，则可以对调制参数进行适当的修改。例如，如果标记在期望的生理结果内或与期望的生理结果相关联，则在神经调制期间施加的能量可以逐步回到支持期望的结果的最小水平。如果相对于阈值的特性变化与标志的不足变化相关联，则可以改变某些调制参数，包括但不限于调制幅度或频率、脉冲形状、刺激模式和/或刺激位置。
78.此外，所评估的特性或状况可以是值或指数(例如，dai)，例如，流速、浓度、细胞群(例如，白细胞位置或特性的变化)或其任何组合，其进而可以通过合适的技术分析。例如，超过阈值的相对变化可以用于确定调制参数是否被修改。可以经由测量的临床结果来评估期望的调制，例如组织结构尺寸(例如结肠组织特征)增加的存在或不存在或者一种或多种释放的分子的浓度变化(例如相对于神经调制之前的基线浓度)。在一个实施方案中，期望的调制可以涉及浓度增加超过阈值，例如相对于基线浓度增加超过约50%、100%、200%、400%、1000%。对于阻断治疗，评估可以涉及追踪分子浓度随时间的降低，例如，感兴趣分子浓度降低至少10%、20%、30%、50%或75%。此外，对于某些受试者，期望的阻断治疗可以涉及在可能倾向于增加分子浓度的其它临床事件的背景下保持特定分子的相对稳定的浓度。也就是说，期望的阻断可以阻断潜在的增加。可以在从治疗开始的某个时间窗口内(例如约5分钟内、约30分钟内)测量增加或减少或其它诱导的和可测量的作用。在某些实施方案中，如果确定神经调制是期望的，则神经调制的变化是停止施加能量脉冲的指令。在另一个实施方案中，如果不期望神经调制，则改变神经调制的一个或多个参数。例如，调制参数的变化可以是脉冲重复频率的增加，例如10-100 hz的频率的逐步增加以及对期望的特性的评估，直到实现期望的神经调制。在另一个实现中，可以改变脉冲宽度。在其它实施方案中，可以一起、并行或串行地改变两个或更多个参数。如果在多个参数改变之后不期望神经调制，则可以改变能量施加的焦点(即，部位)。
79.在一个实例中，本技术可以用于治疗具有改进的ibd样症状学的受试者，以改进粪便稠度、总出血/腹泻和结肠组织完整性。在ibd中，各种病因学因素扰乱肠中免疫细胞的微妙稳态，例如t1、t2、t17、treg，其可以在自持周期中经由激活的巨噬细胞和树突细胞产生炎性细胞因子级联。一些值得注意的候选物包括肿瘤坏死因子-α (tnf-α)、干扰素-γ (ifn-γ)、白细胞介素-(il-)17、il-22、il-1、il-6、il-8、il-12和il-18。这些炎性细胞因子可以引起良性局部炎性反应，但不受控的过度产生可以引起组织损伤、难以超声凝固、死亡和/或低血压。考虑到这一点，经由胆碱能抗炎途径(cap)可以完成减轻肠道炎症和组织损伤中失调的细胞因子水平。靶向腹腔丛促进选择性区分脾(“全身”)相对于肠(“局部”)胆
碱能抗炎途径，以及激活肠系膜内不同位置的肠cap，所述位置包含肠系膜上神经节、腹腔神经节、肠系膜下神经节、背根神经节或肠肌丛。在某些实施方案中，所公开的技术允许在不激活脾cap的情况下或在相对较低地激活脾cap的情况下激活肠cap。本技术提供了优于已显示需要脾/脾神经节作为肠神经元激活途径的电迷走神经刺激装置的优点。本技术精确调制肠途径而不是脾途径。在某些实施方案中，激活可以是全身性/脾、局部/肠或混合/组合刺激。针对ibd治疗优化，可以进一步描述选择靶向特异性外周神经节相对于直接激活肠肌丛的cap刺激位点，以及选择特定超声刺激参数(包括刺激的功率、持续时间和剂量时间)。
80.本技术证明，当聚焦超声分别每天施加一次或两次时，在给定的轻微(5%)和更严重(7%) dss中ibd症状减轻。靶向腹腔丛导致聚焦超声对ibd症状学的功效。腹腔丛是一组负责从胰腺、肝、肾、胆囊、脾和肠发送信息的神经。存在四个与腹腔丛相关的主神经节，并且所公开的实例靶向腹腔丛的上部，包含腹腔神经节和肠系膜上神经节。肠系膜上神经节负责神经支配肠，这使其成为聚焦超声治疗ibd的理想靶。左腹腔神经节和右腹腔神经节两者也都起肠神经支配的作用，但是这些神经节也与肝活性有关。在大鼠中，测量肠系膜上神经节距腹腔神经节大约3mm。假定换能器的直径为约20 mm，焦点为1mm，换能器在该神经丛上的精确放置是成功的因素。偏离靶的聚焦超声可以解释为什么一些动物用聚焦超声比其它动物表现出好得多的粪便稠度、血性粪便和结肠长度。出于类似的考虑，在异氟烷麻醉下呼吸的动物可能引起胸部运动和换能器焦点的改变，随后误靶向腹腔丛。此外，这也可以解释用聚焦超声观察到的重量减轻，因为特定腹部位置的神经调制可以导致胃肠系统内肠降血糖素途径的直接激活。因此，考虑呼吸诱导的运动可以改进靶向。此外，这样的可变性可以指出使用具有更靶向(聚焦)和更少扩散作用的相对较小换能器的优点。
81.所公开的实施方案的技术作用包括用于在腹腔丛上非侵入性聚焦超声的技术，以减小ibd的作用，例如血性粪便，以改进粪便稠度并保护组织长度和完整性。本技术可以用于治疗对药物干预或对增加药物或外科手术干预无响应的患者。
82.本书面描述使用实例(包括最佳模式)并且还使本领域任何技术人员能够实践所公开的实施方案，包括制造和使用任何装置或系统，以及执行任何结合的方法。可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这样的其它实例旨在处于权利要求的范围内。
1.相关申请的交叉引用本技术要求在2020年4月9日提交的美国临时申请号63/007,766和2020年5月20日提交的美国临时申请号63/027,724的优先权和益处。
背景技术：
2.本文公开的主题涉及神经调制，并且更具体地，涉及用于使用从能量源施加的能量来调制生理响应的技术。
3.神经调制已经用于治疗多种临床病况。例如，在沿脊髓的不同位置的电刺激已经用于治疗慢性背痛。可植入装置可以周期性地产生电能，将该电能施加到组织以激活某些神经纤维，这可以导致疼痛感觉的降低。关于脊髓刺激，刺激电极通常定位在硬膜外腔中，尽管脉冲发生器可以定位成稍微远离电极，例如在腹部或臀区域中，但是经由导线连接到电极。在其它实现中，深度脑刺激可以用于刺激脑的特定区域以治疗运动障碍，并且刺激位置可以通过神经成像来引导。这样的中枢神经系统刺激通常靶向局部神经或脑细胞功能，并且由递送电脉冲并且定位在靶神经处或附近的电极介导。然而，将电极定位在靶神经处或附近是有挑战性的。例如，这样的技术可能涉及递送能量的电极的外科手术放置。此外，经由神经调制的特定组织靶向是具有挑战性的。定位在某些靶神经处或附近的电极通过触发神经纤维中的动作电位来介导神经调制，这进而导致神经递质在神经突触处释放以及与下一神经的突触通信。这样的传播可能导致比期望的相对更大或更分散的生理作用，因为植入电极的当前实现一次刺激许多神经或轴突。因为神经途径是复杂且互连的，更具选择性和靶向的调制作用可能在临床上更有用。
技术实现要素：
4.下面概述某些实施方案。这些实施方案不旨在限制所要求保护的主题的范围，而是这些实施方案仅旨在提供可能的实施方案的简要概述。实际上，本公开可以涵盖可以与下面阐述的实施方案类似或不同的多种形式。
5.在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括将聚焦超声能量施加到受试者中的感兴趣区域以诱导一个或多个神经途径的神经调制，其中所述感兴趣区域包含腹腔丛的至少一部分。
6.在一个实施方案中，提供了一种系统，其包括超声探头，其被配置为将聚焦超声能量施加到受试者中包含腹腔丛的至少一部分的感兴趣区域，以神经调制所述受试者的所述腹腔丛的外周神经节。所述系统还包括控制器，其被配置为从以成像模式操作的所述超声探头获取所述受试者的图像数据，基于所述图像数据选择所述感兴趣区域；和控制所述超声探头以将所述聚焦超声能量施加到所述感兴趣区域，作为治疗所述受试者的炎性肠病的治疗方案的一部分。
7.在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括从以成像模式操作的超声探头获取受试者的图像数据，其中所述受试者被诊断为患有炎性肠病；基于所述图像数据选择包含
所述腹腔丛的至少一部分的感兴趣区域；和控制所述超声探头以将聚焦超声能量施加到所述感兴趣区域，作为治疗所述炎性肠病的治疗方案的一部分，其中所述感兴趣区域包含腹腔丛的外周神经节的至少一部分。
附图说明
8.当参考附图阅读以下详细描述时，本公开的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，在附图中，相同的符号在所有图中表示相同的部件，其中：图1是根据本公开的实施方案的用于超声能量施加的实验设置的示意图；图2显示用于在空间上选择感兴趣区域用于超声能量施加的超声成像；图3显示在摄取葡聚糖硫酸钠(dss)的动物模型中，在重复聚焦超声(fus)治疗过程中，相对于对照，疾病活动指数(dai)的变化；图4显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，粪便稠度的dai亚类的变化；图5显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，总出血的dai亚类的变化；图6显示在摄取dss的动物模型中，在每天聚焦超声治疗过程中，相对于对照，重量的dai亚类的变化；图7是研究组中的动物死后结肠的示意图，其显示dss和聚焦超声对粪便稠度的作用；图8显示在未经处理的动物中不同浓度的dss与dai评分之间的关系；图9显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，dai的变化；图10显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，粪便稠度的dai亚类的变化；图11a显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗的过程中，相对于对照，总出血的dai亚类的变化；图11b显示代表性照片，其显示来自不同治疗组和对照组的第7天和第8天大鼠的总出血的变化；图12显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗的过程中，相对于对照，重量变化作为距基线的百分比；图13显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，单个动物粪便稠度评分；图14显示在摄取dss的动物模型中，在每天两次聚焦超声治疗过程中，相对于对照，单个动物总出血评分；图15a显示研究中的各组的结肠长度；图15b显示相对于彼此确定大小的结肠长度的代表性照片；图16a显示相对于对照，每天两次聚焦超声处理的摄取(dss)的动物模型的结肠苏木精和曙红y染色切片；图16b显示相对于对照，每天聚焦超声处理的摄取(dss)的动物模型的结肠苏木精
和曙红y染色切片；图16c显示研究中的各组的组织病理学评分；图17显示由在“朴素(naive)”、“水 2x fus”、
ꢀ“
dss 2x模拟fus”和“dss 2x fus”组中的大鼠的结肠评估的大鼠细胞因子活性的阵列坐标和阵列数据；图18显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图19显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图20显示来自图17的数据的动物组中单个细胞因子活性的变化；图21是根据本公开的实施方案的神经调制系统的示意图；图22是根据本公开的实施方案的神经调制系统的框图；和图23是根据本公开的实施方案的神经调制的方法的流程图。
具体实施方式
9.下面描述一个或多个具体实施方案。为了提供这些实施方案的简明描述，在说明书中没有描述实际实现的所有特征。应当理解，在任何这样的实际实现的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须做出许多实现特定的决定以实现开发者的特定目标，例如符合系统相关的和商业相关的约束，其可能从一个实现到另一个实现而变化。此外，应当理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但对于受益于本公开的普通技术人员而言，仍然是设计、制作和制造的例行任务。
10.本文给出的任何实例或说明不应以任何方式视为对与其一起使用的任何一个或多个术语的限制、局限于此或表达其定义。相反，这些实例或说明应被认为是关于各种特定实施方案描述的，并且仅是说明性的。本领域普通技术人员将理解，与这些实例或说明一起使用的任何一个或多个术语将涵盖可以或不可以与其一起或在说明书中的其它地方给出的其它实施方案，并且所有这样的实施方案旨在包括在该一个或多个术语的范围内。指定这样的非限制性实例和说明的语言包括但不限于“例如(for example)”、“例如(for instance)”、“例如(such as)”、“例如(eg.)”、“包括”、“在某些实施方案中”、“在一些实施方案中”和“在(一个)实施方案中”。
11.当介绍本公开的各种实施方案的要素时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在是指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包含性的，并且是指除了所列要素之外还可以存在另外的要素。此外，以下讨论中的任何数值实例旨在是非限制性的，并因此另外的数值、范围和百分比在所公开的实施方案的范围内。
12.炎性肠病(ibd)包括一系列慢性和复发性胃肠(gi)病症，其中克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)是两个主要的值得注意的提及。ibd引起胃肠道慢性炎症，其中症状包含持续性腹泻、腹痛、出血和/或直肠出血。许多ibd症状也在胃肠道外出现，包括关节炎、巩膜外层炎和疲劳。截至2015年，美国大约有3百万成年人被诊断为患有ibd，这占国家人口的大约1%。近年来诊断数量的增加已经将ibd定位于全球健康问题，据估计每十年出现的新诊断增加20%，这也产生相当大的经济负担。
13.尽管有努力，但ibd的治疗选择在可用性和/或功效方面显著缺乏。许多患者变得对一线药物治疗难治或发展进一步的并发症，例如狭窄、穿孔或瘘管，这可能需要建议进行手术。最近引入针对ibd的抗肿瘤坏死因子(tnf)剂已经是治疗该疾病的主要进展，但是无
反应者的比率可能高达60%。另外，30%的个体在给予12个月内变得对治疗难治，并且复发有重新出现的症状。鉴于ibd的住院和手术率没有降低，并且数据假设cd和uc的住院率和手术率适度增加，仅进一步强调了开发治疗ibd的新治疗干预的未满足的需要和临床效用。
14.有多种有助于ibd发展的病因学组分，涉及遗传、免疫学和环境条件之间的复杂相互作用。在缺乏ibd的单一潜在病理生理学机制的情况下，本领域的共识是特定环境触发扰乱个体的肠道稳态，其固有易受免疫系统的慢性损伤和/或与肠道菌群的相互作用扰乱，导致炎性介导的损伤。
15.中枢神经系统(cns)和免疫系统之间的直接联系可能涉及脾，用于反馈控制调节脾和循环巨噬细胞的细胞因子释放。这与ibd特别相关，因为细胞因子水平失调在调制肠道炎症和结肠损伤中起作用。来自循环细胞因子/内毒素的感觉神经反馈可以触发迷走神经介导的信号传导至脾巨噬细胞以抑制炎性响应。这可以通过胆碱能抗炎途径(cap)内的腹腔丛中肾上腺素能神经元间接发生。鉴于此，外周途径可以用作新的生物电疗法的靶标，但目前的电刺激器不能给予肠刺激。
16.本文提供了使用聚焦超声神经调制腹腔丛(或腹腔丛的至少一部分)的技术，目标是改进ibd样症状学。本文公开了在结肠炎大鼠模型中的研究结果，其涉及动物每天经由其饮用瓶饮用葡聚糖硫酸钠(dss)。该研究评估了用聚焦超声给予或不用聚焦超声给予的ibd啮齿动物模型中常规使用的终点度量。本文提供的聚焦超声显示改进ibd样症状学，例如结肠炎的dss大鼠模型中的粪便稠度、总出血/腹泻和结肠组织完整性。在ibd的
‘
轻微’和
‘
严重’形式两者中都注意到了功效，这通过使用dss的不同制剂来揭示。这些结果证明非侵入性聚焦超声神经调制在ibd中的临床效用。聚焦超声可以用于靶向外周神经系统中特定的丛或神经节，以治疗疾病(例如ibd)。
17.图1显示用于进行某些神经调制实验的实验设置，所述神经调制实验聚焦本文提供的靶(例如腹腔丛)。根据由控制器设定的参数操作的能量施加装置将聚焦超声施加到感兴趣区域，以靶向腹腔丛。在大鼠中，该区域刚好位于膈膜下方。通过初始超声成像确定超声换能器在大鼠上的放置，如图2所示，其揭示作为用于定位腹腔丛的界标的两个主要动脉(肝和脾)。之后，将换能器刚好定位在腹腔丛上方大约25 mm的剑突的侧面，以在肠系膜上神经节的水平激活肠cap途径。
18.所有涉及动物的实验都符合国家卫生研究院和阿尔巴尼医学院(amc)动物护理和使用委员会(iacuc)的指南。动物购自taconic biosciences (germantown, ny, usa)，在亮-暗循环的亮阶段(7:00am至7:00pm)期间进行程序。动物可以随意获取食物和液体。
19.通过将初始重量为200-350g的雄性sprague dawley大鼠放置在填充有设定为2-3 l/min的4%异氟烷(harvard apparatus, ma, usa)的吸入室中，使其麻醉，使得可以容易地处理它们以获得动物肛门的照片，随后收集粪便样本以测试稠度和血液分析。之后，立即将大鼠的头部放置在密封的鼻锥中，同时将其背部定位，并经由台式蒸发器(harvard apparatus, ma, usa)以2-3 l/min用1.5%异氟烷维持麻醉。将腹部(特别是剑突上方的区域)剃毛并用黑笔标记以靶向换能器用于聚焦超声给予。该位置靶向迷走神经前干，其邻近肠系膜上以及左腹腔神经节和右腹腔神经节两者，如使用超声成像施加器所注意到的(图2)。在施加聚焦超声后，将大鼠从异氟烷麻醉中摘下，称重并放回到它们各自的笼中。
20.用葡聚糖硫酸钠(dss)模型诱导大鼠的ibd样病理生理学。葡聚糖硫酸钠(dss)是
水溶性的硫酸化的多糖，当每天与水一起在溶液中摄取时，其随时间诱导大鼠的肠道炎症。这源于dss是上皮细胞刺激物，其在大肠中集中，导致在整个结肠固有层中的溃疡性损伤。这通过损伤上皮屏障和使腔细菌(luminal bacteria)/抗原能够进入粘膜而诱导ibd样病理生理学和症状学。此外，粘膜损伤也在远端结肠中增加数量和大小，引起类似于在人溃疡性结肠炎中所见的上皮损伤。dss是急性、慢性和/或复发性肠道炎症的模型。
21.在实验的第1天，将dss加入到动物的可随意获得的含有常规自来水的饮用水中。根据实验，浓度在4-9%范围内。对照组中的动物仅饮用自来水。对于所有组，每3-5天更换饮用瓶以确保水瓶中的dss不降解并且没有将影响dss诱导的症状的细菌污染。
22.评估ibd啮齿动物模型中的症状学的终点度量是疾病活动指数(dai)，其可以用作评估如本文所提供的神经调制的有效性和/或成功的度量。使用重量减轻、粪便稠度和总出血评估dai评分。每个标准可以在0-4的范围内，以分别反映正常到最严重的症状学。相对于基线重量对重量减轻评分。该半定量分析工具由动物重量、粪便稠度和粪便中血液的存在以及直肠出血的每天测量组成，标准如下(表1)：表1：dai评分评分重量减轻(%)评分粪便稠度评分粪便中的总出血0无0正常0无11-51 1 25-102松散2轻微310-153 3 4》154水样4严重重量减轻评级从0分到4分，表示无重量减轻(0分)至超过15%重量减轻(4分)；粪便稠度评级从0分到4分，表示正常质地和外观(0分)至水样腹泻(4分)；直肠出血评级从0分到4分，包括无出血(0分)、轻微出血(2分)至总出血(4分)。总之，从3个亚类中，最大总dai评分为12分是可能的。
23.每天监测动物体重以评估重量减轻的存在和幅度。用数字记录用照片目测评估粪便稠度和总出血。另外使用粪便血液检测测试(sure-vue fecal occult blood slide test system; fisher scientific, hampton, nh)测试粪便样品的血液。如果出血不可见但潜血测试为阳性，则出血评分增加1分。除了dai度量，还记录12天的液体消耗。
24.饮用dss两周后，并且用聚焦超声处理或不用聚焦超声处理，处死大鼠。收集结肠用于死后分析，例如结肠长度比较、细胞因子和组织学损伤，包括上皮损伤和炎性细胞浸润。
25.由于聚焦超声在大鼠解剖结构的尺寸/规模上的空间限制，在异氟烷介导的麻醉下，通过用定位在剑突和下肋骨之间的左腹区域中的聚焦超声换能器探头调制腹腔丛(左腹腔神经节和右腹腔神经节和/或肠系膜上神经节)来靶向肠cap途径(图1)。
26.聚焦超声系统由函数发生器(agilent33120a)、射频(rf)功率放大器(eni350l)和定制的2.5 mhz聚焦超声(fus)换能器组成。fus换能器高0.75英寸且直径0.75英寸，具有弯曲表面，并且换能器聚焦深度为聚焦25.4 mm。fus换能器通过放置在剃毛的腹部上的超声凝胶声学耦合到动物。函数发生器产生由rf功率放大器增强并传输到fus换能器的脉冲正弦波形。fus刺激允许特定位置的靶向，不像以前的超声技术，以前的超声技术要求换能器
扫过器官或留在适当的位置作为具有5 cm2覆盖区的未聚焦超声。
27.每天，将3分钟的聚焦超声施加到靶区域(载波频率：2.5 mhz，振幅：300 mv，脉冲串长度：300个载波周期，脉冲串重复周期：200毫秒)。在2.5 mhz的载波频率下，每个载波周期是0.4微秒，并且300个载波周期的持续时间是120微秒。因此，在每个200毫秒的脉冲串重复周期期间，换能器在120微秒内有效地脉动，并且在重复下一个脉冲串之前在剩余199.88毫秒内保持不活动。将动物分成由其处理和对照变量(表2)描述的不同组。根据动物组的疾病病况和治疗来分配动物组。左列具有动物组名称，中间列描述处理。
28.表2：动物组
动物组处理的描述dss每天饮用dss的大鼠，持续两周dss 1xfus饮用dss的大鼠，每天一次非侵入性fus，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下dss 2xfus饮用dss的大鼠，每天两次非侵入性fus，每天间隔六小时，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下dss 模拟1xfus饮用dss的大鼠，在每天一次的异氟烷麻醉下，持续两周dss 模拟2xfus饮用dss的大鼠，在每天两次的异氟烷麻醉下，每天间隔六小时，持续两周朴素仅饮用水的大鼠，持续两周水 1xfus饮用水的大鼠，每天一次非侵入性fus，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下水 2xfus饮用水的大鼠，每天两次非侵入性fus，每天间隔六小时，持续两周；在非侵入性fus给予期间在异氟烷下水 模拟1xfus饮用水的大鼠，在每天一次的异氟烷麻醉下，持续两周水 模拟2xfus饮用水的大鼠，在每天两次的异氟烷麻醉下，每天间隔六小时，持续两周
将总共60只大鼠分成以下组：饮用葡聚糖硫酸钠的动物标记为
‘
dss’。给予非侵入性聚焦超声的动物在
‘
fus’组。作为标记为
‘
模拟fus’的聚焦超声的假对照组，大鼠经历与接受聚焦超声的大鼠相同的程序，例如腹部剃毛并用异氟烷麻醉，用笔标记，其中换能器探头定位在剑突和下肋骨之间的相同部位。然而，关闭rf功率放大器、函数发生器和换能器。将没有给予dss或聚焦超声，并且每天仅从它们的笼子中取出一次以监测重量变化并评估粪便稠度和总出血评分的动物标记为
‘
朴素’。在它们的治疗指定之前，将每天两次进行非侵入性聚焦超声的动物标记为
‘
2x’。对于
‘
2x fus’组中的动物特异性的，大鼠每天接受两次聚焦超声治疗，第一次在早晨施加，而第二次聚焦超声时间在第一次聚焦超声时间后大约6小时的下午进行。第二次聚焦超声的设置与早晨给予的第一次聚焦超声相同，但是在第二次聚焦超声治疗期间没有收集到终点度量。还对一些动物组组合标记以反映接受多个程序。例如，饮用dss但每天接受两次假聚焦超声程序的大鼠表示为
‘
dss 2x模拟fus’。
29.实验完成后，用ip注射在盐水中的氨基甲酸酯(urethane) (1.2-1.5g/kg)来麻醉动物，随后进行胸廓切开术和解剖以从盲肠到肛门取出结肠。在用1x磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗结肠之前和之后拍摄照片。将结肠分割成大约20 mm长的3个部分，其中近端部分靠近盲肠，远端部分靠近肛门，并且中间部分在两个端部之间。将每个部分称重，在液氮中速冻并在-80℃下储存，直到使用裂解缓冲液(tissue extraction reagent i, invitrogen, vienna, austria)与抑制剂混合物和乙二胺四乙酸(halt
™ꢀ
protease inhibitor cocktail, thermo scientific, rockford, ll usa)使组织匀浆以用于细胞因子分析。之后，在4℃下以10,000 g将样品离心30分钟，收集上清液并在-80℃下储存。使用bicinconinic acid测定(bca)分析蛋白质浓度，并用蛋白质组分析仪大鼠细胞因子阵列试剂盒(r&d systems, minneapolis, mn))评估细胞因子活性。该大鼠细胞因子阵列试剂盒包含在硝酸纤维素膜上一式两份的对照抗体。将封闭缓冲液加入到4孔板中，并将膜孵育一小时。将含有26种不同的生物素化的检测抗体的溶液(400 μg/μl)在室温下孵育一小时，并
替换从孔中去除的封闭缓冲液。将膜放置在振荡器(microjive shaker, boekel scientific, feasterville, pa)上，并在-4℃下孵育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤膜3次，以去除未结合的材料。之后，将链霉亲和素-hrp和化学发光检测试剂加入到膜中，这导致出现点。这些的位置、大小和颜色对应于结合的选择细胞因子的量(参见图17-18)。使用数字块扫描仪(chemidoc western blot digital 成像系统, bio-rad, hercules, ca)扫描膜，并使用hlimage (western vision software, salt lake city, ut)分析。
30.也获取直肠和邻近的1.5 cm结肠组织的部分，并保存在4%多聚甲醛(pfa)中，转移到70%乙醇中进行苏木精和曙红(h&e)染色，并包埋在石蜡中。将该组织纵向切成5 μm厚，并放置在带电显微镜载玻片上(globe scientific; mahway, nj)。
31.将载玻片在二甲苯中脱蜡洗涤三次，然后用100%乙醇(2
×
)和95%乙醇(2
×
)进行一系列醇漂洗以使组织水合。将载玻片放置在苏木精7211中，并在发蓝试剂浴后使用曙红-y区分。在曙红-y漂洗之前，对载玻片进行一次95%乙醇洗涤。然后通过将载玻片放置在100%乙醇中洗涤三次，而将载玻片再次脱水，并在用cytoseal 60 (fisher scientific, hampton, nh)盖上盖玻片之前用二甲苯替代物洗涤清洗。
32.苏木精-曙红y染色的切片用于使用半定量评分规则来评估炎性细胞的浸润、隐窝变形和侵蚀。(表3)。使用0-4的评分规则评估上皮损伤和炎性细胞浸润的组织学疾病严重性。将两个评分的总和合并以提供组织学总体损伤评分8。中间栏描述基于形态学、杯状细胞损失、隐窝损失和大面积隐窝损失的上皮损伤的幅度。右列描述基于渗透进入各个结肠层的深度的炎性细胞浸润的严重性。
33.表3：染色切片的评分
评分上皮损伤(e)浸润(i)0正常形态学无浸润1杯状细胞损失隐窝基础周围的浸润2大面积杯状细胞损失到达粘膜肌层的浸润3隐窝损失到达粘膜肌层的广泛浸润，具有大量水肿的粘膜增厚4大面积隐窝损失粘膜下层的浸润
具体地，基于0-4个等级独立地对上皮损伤和浸润评分，其中：0=正常形态学；1=杯状细胞损失；2=大面积杯状细胞损失；3=隐窝损失；4=大面积隐窝损失。如下指定浸润评分：0=无浸润；1=隐窝基础周围的浸润；2=到达粘膜肌层的浸润；3=到达粘膜肌层的广泛浸润并且具有大量水肿的粘膜增厚；4=粘膜下层的浸润。上皮损伤和浸润两者的总和导致总组织病理学最大评分为8。
34.与ibd症状学一致的被认为是
‘
轻微’的dss化学品购自sigma-aldrich (mw：》500kda，批号bcbz5763)。诱导
‘
严重
’ꢀ
ibd症状学的dss化学品购自fisher scientific (mw：35-50 kda，项目# aaj6360622)。除非另有说明，否则所有其它化学品均购自sigma-aldrich，其它地方购买的化学品和药物在本文中注明。
35.由至少两个未盲试的实验室人员评估dai、粪便稠度和总出血，同时由两个盲试的实验室人员对组织病理学组织进行评分。使用具有graphpad prism软件(v8.3.0; san diego, ca)的双向方差分析(anova)分析数据，其中在可能时重复测量，并且使用fisher的lsd进行事后分析用于每天的治疗间比较。由于重量减轻、死亡率和/或其它排除标准，一些
数据集具有从排除在研究之外的动物中遗漏的值。对于这些数据，使用混合作用模型(reml)双向anova代替重复测量。动物数量的减少表示为具有一定数值范围的样品大小，其中较大的数值代表初始组大小，而较小的数值代表从研究中排除动物后的最低样品大小。提供每个动物组的样品大小范围，用于在整个实验时间表上进行的分析。另外，多个所述组的n值由分别表示所述第一组和第二组的斜杠分开。例如，比较
‘
dss’和
‘
dss fus
’ꢀ
(n=6-1/7-2)表示
‘
dss’组在所有天内具有最多6只动物的数据点和最少1只动物的数据点，而
‘
dss fus’组在所有天内具有最多7只动物的数据点和最少两只动物的数据点。对于每天分析，比较第5天的
‘
dss’和
‘
dss fus
’ꢀ
(n=4/5)表示在第5天
‘
dss’组具有4个数据点，而
‘
dss fus’组具有5个数据点。使用单向anova进行结肠长度比较，使用holm-sidak事后测试进行多重比较。数据显示为平均值
±
平均值的标准误差(sem)，并且在p《0.05时确定统计学显著性。
36.图3显示用聚焦超声治疗或不用聚焦超声治疗的dss动物的dai评分。动物接受水或dss。在这两组中是接受聚焦超声(fus) (
‘
dss fus’和
‘
水 fus’)的动物群和没有接受聚焦超声(
‘
dss’和
‘
水 模拟fus’，后者接受假超声时间)的动物群。与饮用自来水的动物(n=11-2)相比，“dss”组中的大鼠(n=7-1)在快如饮用dss一天后就表现出较高的dai评分。
‘
dss fus’组(n=8-4)具有较低的dai评分，指示不太严重的ibd症状学。因此，如本文所提供的，靶向腹腔丛的聚焦超声可以导致与ibd相关的症状的改进。
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间的dai评分的差异在第5天(n=5/4)首先显著，并且在第7天(n=2/4)、第9天(n=6/8)、第11天(n=6/8)和第12天(n=4/4)继续显著。星号(*)表示对于
‘
dss’相对于
‘
dss fus
’ꢀ
p≤0.05，而井号(#)表示对于
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus
’ꢀ
p≤0.05。
37.图3中的群代表百分之五(5%) dss，与
‘
水 模拟fus’对照组相比其诱导
‘
dss’组中的dai评分显著增加(n=7-1/11-2；p《0.001，图3)。这两组之间dai的差异在饮用dss一天之后是显著的(n=4/11；p=0.004)，直到实验在第12天结束(n=4/2；p《0.001)。当比较dss组时，在第5天(n=5/4，p=0.014)、第7天(n=2/4，p=0.047)、第9天(n=6/8，p=0.007)、第11天(n=6/8，p=0.022)和第12天(n=4/4，p=0.022)，那些接受聚焦超声的(
‘
dss fus’组)具有比那些没有接受聚焦超声的(
‘
dss’组)显著更健康的dai评分(n=8-4/7-2；p=0.045)。在第7天，注意到
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间的最大功效(n=2/4)，前者的dai评分为6
±
1.4，而后者组的dai评分为2.5
±
1.7。在
‘
水 fus’和
‘
水 模拟fus’之间没有报道dai评分的差异(n=11-2/5-1；p=0.222)。有趣的是，尽管聚焦超声在饮用dss的大鼠的总体dai评分中是有效的，在
‘
dss’组中未观察到重量减轻(图6)，这是包含dai评分的亚类之一，并且在实验期结束时使用5% dss的其它研究中时常被报告。
38.独立地检查dai的每个亚类，而不是作为综合指数，如在图4-6中所示。dai评分的亚类包含粪便稠度(图4)、总出血(图5)和重量减轻(图6)。在图4中，
‘
dss fus’组(n=7-2)中的动物显示比
‘
dss’组(n=8-4)中的动物更低的粪便稠度评分。早在第2天就观察到这种功效，与不用fus的那些相比，在第3、4、5和11天持续改进。在图5中，到第5天，在
‘
dss’组中可观察到总出血症状，而fus将总出血症状的出现延迟三天。具体地，
‘
dss fus’组与
‘
水 fus’组中的动物相比直到第8天的总出血没有差异。在图6中，在
‘
dss’和
‘
dss fus’组之间或任何其它组之间的重量减轻没有观察到差异。星号(*)表示对于
‘
dss’相对于
‘
dss fus
’ꢀ
p≤0.05，而井号(#)表示对于
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus
’ꢀ
p≤0.05。当与
‘
水 模拟fus’和
‘
水 fus’组中的大鼠相比时，摄取dss引起松散且流动的粪便稠度评分(例如，
‘
dss’相对于
‘
水
模拟fus’：n=6-1/5-1，p《0.001；
‘
dss’相对于
‘
水 fus’：n=6-1/11-2，p《0.001)。具体地，粪便稠度评分到第2天显著恶化，并且比起用聚焦超声或不用聚焦超声的饮用水的大鼠持续具有更高的评分，直到实验结束(对于所有天数的两个水组比较，p《0.001，图4)。水组中的大鼠，无论它们是否接受聚焦超声，具有相似的粪便稠度评分(
‘
水 模拟fus’相对于
‘
水 fus’；p=0.113)。关于
‘
dss fus’组中的大鼠，从第4-5天和第7-12天，粪便稠度明显比
‘
水 fus’组中的大鼠更差。然而，
‘
dss fus’组的大鼠比
‘
dss’组表现出更好的粪便稠度(n=7-2/8-4；p=0.008)，并且特别是在第2天(n=8/7；p《0.001)、第3天(n=4/5；p=0.006)、第4天(n=8/7；p=0.006)、第5天(n=4/5；p=0.010)和第11天(n=8/6；p=0.036) (图4)。在第2天看到聚焦超声的最大改进，其中
‘
dss’组的粪便稠度严重性评分为2.2
±
1.0，而
‘
dss 聚焦超声’组的评分为0.8
±
0.3。
39.dss和fus对粪便稠度的作用可以在衍生自死后大鼠结肠的摄影图像的代表性图像(图7)中观察到。与
‘
水 1x fus’组中的那些相比，接受dss的动物的结肠含有未形成的小粒或缺乏粪便(顶部箭头)，尤其是在结肠的远端部分。相反，接受dss和fus (
‘
dss 1x fus’)的动物在fus处理两周后显示完整的和
‘
规则的’小粒形状(底部箭头)，与在
‘
水 1x fus’组中观察到的那些相似。粪便稠度评分是从每天早晨从动物新鲜排泄的粪便样品获得的。然而，当处死动物时当在实验结束时检查大鼠结肠时，稠度也是目测可证实的。然后，
‘
dss fus’组(图7，图的底部)具有比
‘
dss’组中的大鼠(其粪便几乎没有形状或存在粪粒(图7，图的顶部))看起来更健康的组织和更硬的粪粒，其更接近地类似于仅饮用自来水的动物(图7，图的中部)。
40.除了在第6天(n=1/1；p=0.181)外，从第5天(n=5/3；p=0.05)开始直至第12天(n=4/3；p=0.002)，
‘
dss’组中的动物具有比
‘
水 模拟fus’动物(n=7-1/5-1；p=0.002)更差的总体总出血评分(图5)。在整个12天期间，
‘
水 fus’组和
‘
水 模拟fus’组之间的总出血相似(p=1.000)。值得注意的是，
‘
dss fus’组中的动物与
‘
dss’组中的动物相比具有显著改进的总出血评分(n=7-2/8-4；p=0.015)，其首先在第5天(n=4/5，p=0.048)、然后在第7天(n=4/2p=0.047)、第9天(n=8/6，p=0.001)和第11天(n=8/6，p=0.020)观察到(图5)。在第9天可见
‘
dss’组总出血的最大改进，其中
‘
dss’组的评分为3.0
±
0.7，而
‘
dss fus’组的评分为1.1
±
0.4。此外，使用聚焦超声将总出血症状的出现延迟大约3天。具体地，
‘
dss’组中的大鼠到第5天表现出超过1的总出血评分。相反，
‘
dss 聚焦超声’组在第8天首先表现出超过1的评分。
41.尽管饮用5% dss溶液12天的大鼠与ibd样症状(例如具有松散和水样粪便稠度的血性粪便)一致，在dss啮齿动物模型中没有看到重量减轻的标志性症状。事实上，尽管已经每天饮用这种溶液持续2周，饮用dss的动物的体重增加，并且在所有组中都看到了这种趋势(
‘
dss’相对于
‘
dss fus’：n=7-1/8-4，p=0.534；
‘
dss fus’相对于
‘
水 fus’：n=8-4/5-1，p=0.577；
‘
水 fus’相对于
‘
水 模拟fus’：n=5-1/5-1，p=0.15) (图6)。有趣的是，在第2天和第3天，唯一的重量减轻短暂地发生在
‘
dss fus’组中。
42.假定没有显著的和长期的重量减轻，
‘
dss’组中的大鼠仅表现出12中的6.7的最大dai评分，其低于通常在高浓度啮齿动物dss模型中报道的值。为了产生更严重的ibd症状，然后使用40 kd的dss制剂代替用于引起上述轻微胃肠损伤的初始》500 kd制剂。然后用更有效的dss制剂进行第二组实验，以更好地概括严重ibd症状学，使得可以评估fus对这种
ibd症状学的严重性的功效。
43.研究较小尺寸的dss化学品以确定该模型是否引发ibd症状学，该症状学更好地概括了严重ibd模型。在两周内监测给予4%、5%、7%或9% dss的不同组的大鼠(图8)。基于这些结果，7% dss诱导最严重的ibd样症状学，在第10天的最大dai评分为12。相反，9% dss引起高死亡率和/或由于到第4-6天》20%重量减轻而引起大鼠被排除在研究之外，并且5% dss仅诱导最大dai评分为10。给定优化数据，使用较新dss制剂的7% dss浓度来研究非侵入性聚焦超声作为严重ibd症状学的治疗的功效。
44.为了改善具有7% dss浓度的
‘
严重
’ꢀ
dss模型中的ibd症状学，使用与
‘
轻微’模型相同的聚焦超声参数。然而，初步发现揭示dai评分没有改进(数据未显示)，其中
‘
dss fus’组中的动物具有
‘
dss’组中看到的相似的缩短的结肠长度(图15a)。从初始实验中确定需要更大剂量的聚焦超声来实现有效的肠cap刺激以减轻ibd严重性的增加。因此，非侵入性聚焦超声每天施加两次(
‘
2x fus’)而不是每天施加一次，以提供聚焦超声疗法的“剂量”的平行增加。
45.图9显示2x聚焦超声对该组中dai评分的作用。与饮用dss并接受模拟2x fus的动物相比，每天两次向饮用dss的大鼠给予fus改进了dai症状。在第5天(n=6/6)注意到dai评分的改进，并且在第7天(n=6/5)再次注意到。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。尽管
‘
dss 2x fus’组具有比
‘
水 2x fus’组显著更高(更差)的dai评分(n=6-1/6-1；p《0.001)，它们低于
‘
dss 模拟2x fus’组中的dai评分(n=6-1/6-1；p=0.046)。具体地，到第5天(n=6/6；p=0.037)和第7天(7.5
±
1.3相对于4.8
±
0.6，n=6/5；p=0.002)，不用聚焦超声(
‘
模拟2x fus’)的饮用dss的大鼠比接受2x聚焦超声的具有dss的动物具有显著更高的评分。在第12天动物也可能表现出fus功效，但样品大小排除任何结论(10.0
±
0.0相对于6.0
±
0.0，n=1/1) (图9)。最大功效发生在第7天。有趣的是，在第8、9、10和11天，
‘
dss 模拟2x fus’动物和
‘
dss 2x fus’动物之间没有看到变化(分别p=0.11、0.62、0.80、0.29)，这可能是由于在
‘
dss 模拟2x fus’组中具有最高dai评分的三只动物由于第7天(dai：11；12)和第8天(dai：10)之间的死亡率而从数据中排除。在这段时间内
ꢀ‘
dss 2x fus’组中的动物没有死亡。
46.图10-12详细显示dai的每个亚类。图10显示fus对粪便稠度评分的作用。当与
‘
dss 2x模拟fus’组(n=6-1)中的那些相比时，饮用dss并接受2x fus的动物(n=6-1)表现出改进的粪便稠度。从第4天(n=6/6)至第7天(n=6/5)注意到显著改进。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。井号(#)表示对于
‘
dss 2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。接受2x聚焦超声或2x模拟聚焦超声的饮用水的动物之间没有差异(
‘
水 2x fus’相对于
‘
水 模拟2x fus’：n=6-1/6-2；p=0.068) (图10)。相反，
‘
dss 模拟2x fus’组中的动物具有比
‘
水 模拟2x fus’组中的动物更差的粪便稠度评分(n=6-1/6-2；p《0.001)，从第2天(n=6/6；p《0.001)开始至第12天(显著性符号未显示)。每天两次给予的超声改进饮用dss的大鼠的粪便稠度(
‘
dss 模拟2x fus’相对于
‘
dss 2x fus’：n=6-1/6-1；p《0.001) (图10)，这到第4天首先观察到。后一组表现出粪便稠度评分为0.5
±
0.34，而前一组的评分为1.5
±
0.22 (n=6/6；p=0.003)。组间的最大差异是在第5天，其中
‘
dss 模拟2x聚焦超声’组(n=6)的评分为2.2
±
0.40，而
‘
dss 2x聚焦超声’组(n=6)的评分为1.0
±
0.0。在第7天，粪便稠度的改进持续，其中
‘
dss 2x fus’组的粪便稠度为2.4
±
0.24 (n=6)。相反，用2x模拟fus
的饮用dss的动物的评分为3.3
±
0.21 (n=5；p=0.008)。值得注意的是，在第7天和第8天之间，具有最高粪便稠度评分4的
‘
dss 2x模拟fus’组中两只动物死亡。
47.图11a显示fus对总出血评分的作用。饮用dss但接受fus (
‘
dss 2x fus’；n=6-1)的动物在第5天(n=6/6)至第8天(n=4/5)具有比接受模拟fus (
‘
dss 模拟2x fus’；n=6-1)的动物更低的总出血评分。星号(*)表示
‘
dss 2x fus’和
‘
dss 模拟2x fus’组之间的p《0.05。井号(#)表示对于
‘
dss 2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。图11b显示在第7天和第8天，来自接受dss 1x fus以及dss 2x模拟fus的不同治疗组和对照组的动物的大鼠的代表性照片，由于来自严重疾病模型中的结肠内的血液停滞，其具有较暗的血液。相反，与
‘
dss 模拟2x fus’中的动物相比，
‘
dss 2x fus’动物在总出血方面显示视觉上的改进。
‘
dss 模拟2x fus’组具有肛门和粪便的总出血，而
‘
水 2x fus’组中的动物没有(n=6-1/6-1；p《0.001)。症状首先在第5天出现(n=3/6；p=0.003)，持续至第9天(n=3/6；p《0.001)，并且可能持续至第12天，尽管这与有限的样品大小(n=3/1)一致(图11a)。与粪便稠度的发现类似，当与
‘
dss 2x模拟fus’组相比时，
‘
dss 2x fus’组中的动物的总出血减少(n=6-1/6-1；p=0.012)。到第5天首次看到功效(n=6/6；p=0.006)，其中接受2x聚焦超声的组的评分为0.0
±
0.0，而不用聚焦超声的饮用7% dss的动物的评分为0.83
±
0.31。改进的总出血延长至第8天，其中
‘
dss 2x模拟fus’组的评分为3.75
±
0.25，而
‘
dss 2x fus组的评分为3.0
±
0.0 (n=4/5；p=0.028)。两组之间总出血评分的最大分离发生在第6天。
‘
dss 模拟2x fus’组表现出评分为2.0
±
0.26，而
‘
dss 2x fus’组的评分为0.83
±
0.30。在
‘
dss 2x模拟fus’组中，在第7天具有4的最严重总出血评分的两只动物在第8天之前死亡(图11a)。
48.图12显示重量变化作为基线的百分比，其中负值代表重量减轻。在实验结束时，用fus或不用fus的dss组重量减轻，而水组增加重量。在接受2x fus (n=6-1)或模拟2x fus (n=6-1)的dss组之间没有观察到差异。十字符号(
†
)表示对于
‘
水 模拟2x fus’相对于
‘
水 2x fus
’ꢀ
p≤0.05。
‘
水 模拟2x fus’组(n=6-2)中的大鼠在12天期间体重增加，但是饮用水并给予2x聚焦超声(n=6-3)的那些没有以相同的速率增加体重(p《0.001)。事实上，
‘
水 2x fus’组在实验的前4天中重量减轻。在第5天，
‘
水 模拟2x fus’大鼠自第1天起增加6.1
±
0.8%体重，而“水 2x fus”组中的大鼠自第1天起体量减轻1.4
±
0.5% (n=6/6；p《0.001)。在
‘
dss 2x fus’组中也看到重量减轻。然而，这可能很大程度上反映2x fus的作用，而不是ibd症状学的严重性，这是考虑到动物具有更坚实的粪便、较少的出血，几乎没有明显的痛苦，并且在它们的笼子中主动活动并显示探究行为。此外，在
‘
水 2x fus’组中也注意到类似的重量减轻趋势。相反，
‘
dss 模拟2x fus’动物也重量减轻(n=6-1)，但是当处理时，尽管与
‘
dss 2x fus’组(p=0.690)中的动物具有相似的重量减轻，它们仍表现出活动性的严重损害和嗜睡，图12。
49.图13-14显示
‘
dss 2x fus’组(n=6-1)和
‘
dss 模拟2x fus’组(n=6-1)中的单个动物的粪便稠度(图13)和总出血(图14)评分。图上的每条线代表单个动物，而与这些线相邻的每个箭头指示评分
‘
下降’。这突出了改进的症状学的实例。在粪便稠度评分中(图13)，在
‘
dss 2x fus
’ꢀ
(n=6-1)组中存在14个下降，如箭头的数量所示。相反，
‘
dss 模拟2x fus’组(n=6-1)仅具有2个下降。图14还显示
‘
dss 2x fus’动物表现出比
‘
dss 模拟2x fus’动物更高数量的总出血评分下降。将评分作图以跟踪12天期间的变化。通常，
‘
dss 2x fus’组(n=6-1)中的动物表现出比
‘
dss 模拟2x fus’对照动物(n=6-1)更高数量的dai亚类评分的逐
日降低。具体地，
‘
dss 模拟2x fus’组中的大鼠表现出粪便稠度严重性评分持续恶化，仅观察到2次摇摆；一个发生在第2天和第3天之间，而另一个发生在第4天和第5天之间(红色下降箭头，图13)。相反，接受超声的大鼠(
‘
dss 2x fus’)表现出更大的摇摆和粪便稠度严重性的更多逐日改进，其中在整个12天实验中观察到14次摇摆(下降箭头) (图13)。对于单个动物的总出血评分(图14)，除了在第8天和第9天之间以及第10天和第11天之间观察到的两次摇摆时机外，在
‘
dss 模拟2x fus’组中的大鼠在总出血症状学中显示持续增加(恶化)，看到类似的发现。然而，
‘
dss 2x fus’组中的大鼠的评分具有许多向下摇摆的情况，特别是在第3天和第5天之间实验的前半部分中，具有三次摇摆。在第10天和第12天之间还发生另外三次摇摆(图14)。在粪便稠度和总出血终点方面分析，“下降”的数量或严重性评分的逐日改进在接受2x聚焦超声的饮用dss的大鼠中显著高于用2x模拟聚焦超声的饮用dss的那些大鼠(p=0.012)。
50.图15a显示结肠长度的组数据。如x轴上所示，某些组接受水，而其它组接受dss。在图15b中显示图15a中的组数据的代表性图片，其中以结肠旁边的标尺作为参考。照片不是按比例的，而是相对于彼此定尺寸。与
‘
dss 模拟2x fus’对照组相比，当比较
‘
dss 2x fus’组中的动物时，小粒形状保持完整。星号(*)表示p《0.05，并且ns表示没有显著差异。结肠长度的减少是dss诱导的ibd的另一个重要的终点度量。尽管
‘
dss 2x fus’组具有比
‘
水 2x fus’组中的动物显著更短的结肠长度(p=0.016相对于；n=5/6)，其仍然比
‘
dss 模拟2x fus’组中的动物(13.8
±
0.3 cm，n=5/4；p=0.013)更完整和更长(18.5
±
1.8 cm) (图15a-b)。每天接受每天一次给予聚焦超声(
‘
dss 1x fus’)的大鼠与
‘
dss 模拟1x fus’对照组相比没有改进结肠长度，其中前者为14.1
±
0.50 cm (n=4)而后者为13.0
±
0.3 cm (n=3；p=0.958)。在
‘
水 2x fus’组(n=6)和
‘
水 2x模拟fus’组(n=5)的动物之间没有注意到结肠长度的差异，其中长度分别为22.7
±
0.5 cm和22.6
±
0.4 cm (p=0.958)。
51.图16a-c显示组织病理学数据。处死后立即将结肠远端2 cm切片保存在多聚甲醛中。切片用苏木精和曙红y染色处理。在图16a中，显示与用2x聚焦超声的dss动物(右图)相比，用模拟聚焦超声治疗的饮用dss的动物中结肠远端切片的粘膜损伤(左图)。存在隐窝基底和深层粘膜下层的损伤和浸润增加。图16b显示接受dss的动物中炎性因子的特写(右上图像)，这在接受dss 2x fus的动物中看不到(右下图像)。图16c是从半定量分析的评分标准得到的分组数据。从
‘
水 模拟2x fus
’ꢀ
(n=2)、
‘
水 2x fus
’ꢀ
(n=3)、
‘
dss 模拟2x fus
’ꢀ
(n=6)和
‘
dss 2x fus
’ꢀ
(n=5)组中的动物获取结肠。
‘
dss 模拟2x fus’组中的那些具有最高的组织病理学评分8，其在实验结束时表现出最大的上皮损伤和炎性细胞浸润(图16b：右上图像相对于右下图像)。饮用dss并接受2x聚焦超声的大鼠具有比
‘
水 2x fus’组(平均评分：0.4，sem：0.4)和
‘
水 模拟2x fus’组(平均评分：1.8，sem：0.5)更高的组织病理学评分(平均评分：6.3，sem：0.8) (p《0.001)。然而，在饮用7% dss的同时接受2x聚焦超声仍然与比
‘
dss 模拟2x fus’动物更健康的结肠一致(平均评分：8.0，sem：0.0) (p=0.022) (图13c)。
‘
水 2x fus’和
‘
水 模拟2x fus’组之间没有差异(p=0.173) (图16c)。
52.在“朴素”、“水 2x fus”、
ꢀ“
dss 2x模拟fus”和“dss 2x fus”组(n=4只大鼠/组)中，从大鼠结肠评估细胞因子活性。在使用大鼠细胞因子阵列检测的29种细胞因子中(图17)，发现七种细胞因子具有一致的结果，导致
‘
朴素’相对于
‘
dss 2x模拟fus’；
‘
水 2x fus’相对于
‘
dss 2x模拟fus’；
‘
dss 2x模拟fus’相对于
‘
dss 2x fus’之间的显著差异(图
18)。具体地，睫状神经营养因子(cntf)、分形趋化因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、由γ干扰素诱导的、受激活调节的单核因子(mig)、表达和分泌的正常t细胞 (rantes)、肿瘤坏死因子-α (tnf-α)和胸腺趋化因子在用模拟2x fu的饮用dss的大鼠中比朴素大鼠或用2x fu的饮用水的大鼠增加。此外，在饮用dss但也接受2x fus的动物中，这些都降低至
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’水平(图18，下图)。
53.在10种白细胞介素细胞因子中的8种(图20)中注意到类似的应答模式，其中il-1β、il-2、il-3、il-4、il-6、il-10、il-13和il-17均在用2x模拟fus的饮用dss的动物中比
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’动物组升高。这些在饮用dss同时还接受2x fus的动物中恢复到
‘
朴素’和
‘
水 2x fus’水平(图19，下图)。最后，观察到8种对dss和/或fus具有更可变应答的其它细胞因子(图20)。特别是，il-1α和il-1ra是检测定剂盒中的2种其它白介素。il-1ra水平在不用2x fu的饮用dss的动物中比
‘
朴素’或
‘
水 2x fus’动物没有升高，而在
‘
dss 2x fus’动物中，il-1α水平高于
‘
水 2x fus’动物，但不高于
‘
朴素’大鼠(图21，下图)。无论如何，在用2x fus的饮用dss的动物中，两种白细胞介素均比不用2x fus的饮用dss的那些动物减少。在不用2x fus的饮用dss的动物中，干扰素γ (ifn-γ)水平比“朴素”和“水 2x fus”组增加，但是用2x fus的饮用dss的动物的干扰素γ (ifn-γ)水平降低(图20，下图))。这种降低仍然高于
‘
朴素’大鼠中所见的水平，但与用2x fus的饮用水的那些动物没有区别。并不奇怪，对于干扰素γ诱导的蛋白10 (ip-10，也称为cxcl10)观察到类似的变化模式。在不用2x fus的饮用dss的动物中比
‘
朴素’大鼠减少的唯一细胞因子是lix (也称为cxcl5)。水平不受2x fus影响。
54.最后，在所有四个动物组之间7个细胞因子保持不变，无论饮用水或dss，用2x fus和不用2x fus；这包括金属蛋白酶的组织抑制剂(timp-1) (图20，下图)以及细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1 (cinc-1)、cinc2α/β、cinc-3、巨噬细胞炎性蛋白-1α (mip-1α)、可溶性细胞间粘附分子-1 (sicam-1)和l-选择素(数据未显示)。
55.所公开的神经调制技术可以与神经调制系统结合使用。图21是用于神经调制以实现神经递质释放和/或激活对施加能量响应的腹腔丛的神经节中的一个或多个突触的部件(例如，突触前细胞、突触后细胞)的系统10的示意图。例如，可以使用聚焦超声来调制腹腔丛的神经节中的一个或多个突触。所描述的系统包括耦合到能量施加装置12 (例如，超声换能器)的脉冲发生器14。能量施加装置12被配置为例如经由导线或无线连接接受能量脉冲，所述能量脉冲在使用中被引导到受试者的内部组织或器官的感兴趣区域，这进而导致靶向的生理结果。在某些实施方案中，脉冲发生器14和/或能量施加装置12可以植入在生物相容的部位(例如腹部)，并且一根或多根导线将能量施加装置12和脉冲发生器14内部耦合。例如，能量施加装置12可以是mems换能器，例如电容式微机械超声换能器。
56.在某些实施方案中，能量施加装置12和/或脉冲发生器14可以例如与控制器16无线通信，该控制器可以进而向脉冲发生器14提供指令。在其它实施方案中，脉冲发生器14可以是体外装置，例如，可以经皮或以非侵入方式从受试者身体外部的位置施加能量，并且在某些实施方案中，可以集成在控制器16内。在其中脉冲发生器14在体外的实施方案中，能量施加装置12可以由照料者操作，并且定位在受试者皮肤上或上方的部位，使得能量脉冲经皮递送至期望的内部组织。一旦定位成将能量脉冲施加到期望的部位，系统10可以启动神经调制以实现靶向的生理结果或临床作用。
57.在某些实施方案中，系统10可以包括评估装置20，其耦合到控制器16并且评估指示是否已经实现调制的靶向的生理结果的特性。在一个实施方案中，靶向的生理结果可以是局部的。例如，调制可以导致局部组织或功能变化，例如组织结构变化、某些分子浓度的局部变化、组织位移、增加的流体运动等。
58.调制可以导致全身性或非局部变化，并且靶向的生理结果可以与循环分子的浓度变化或不包括向其直接施加能量的感兴趣区域的组织的特性变化相关。在一个实例中，位移可以是期望的调制的替代测量，并且低于预期位移值的位移测量可以导致调制参数的修改，直到诱导预期的位移值。因此，在一些实施方案中，评估装置20可以被配置为评估浓度的变化。在一些实施方案中，评估装置20可以是成像装置，其被配置为评估器官大小和/或位置的变化。虽然单独显示系统10的所描述的元件，应当理解，一些或所有元件可以彼此组合。此外，一些或所有元件可以以有线或无线方式彼此通信。
59.基于评估，可以改变控制器16的调制参数。例如，如果期望的调制与在限定的时间窗内(例如，在能量施加程序开始之后5分钟、30分钟)或相对于程序开始时的基线的浓度(一种或多种分子的循环浓度或组织浓度)的变化相关联，则可以期望调制参数(例如脉冲频率或其它参数)的变化，其进而可以由操作者或经由自动反馈回路提供给控制器16，用于限定或调节脉冲发生器14的能量施加参数或调制参数。
60.如本文所提供的系统10可以根据各种调制参数并且作为治疗方案的一部分提供能量脉冲。例如，调制参数可以包括从连续到间歇范围内的各种刺激时间模式。使用间歇刺激，在信号接通时间期间以某一频率在一段时间内递送能量。信号接通时间之后是没有能量递送的时间段，称为信号断开时间。调制参数还可以包括刺激施加的频率和持续时间。施加频率可以是连续的，或者在各种时间段(例如在一天或一周内)递送。治疗方案持续时间可以持续各种时间段，包括但不限于几分钟至几小时。在某些实施方案中，具有指定刺激模式的治疗持续时间可以持续一小时，以例如72小时的间隔重复。在某些实施方案中，治疗可以以较高的频率递送，例如每三小时，持续较短的持续时间，例如30分钟。根据调制参数(例如治疗持续时间和频率)可以可调节地控制能量的施加以实现期望的结果。
61.聚焦超声能量可以聚焦在感兴趣区域22上，其可以是包括腹腔丛的至少一部分的内部结构、组织或器官。例如，感兴趣区域可以包括腹腔丛的神经节(ganglion)或神经节(ganglia)。可以通过向聚焦在靶组织的感兴趣区域22上的能量施加装置12的聚焦场内的突触直接施加能量来刺激感兴趣区域22内的突触，以引起分子释放到突触空间中和/或离子通道活动的变化，这进而引起下游作用，例如肠cap的激活。可以选择感兴趣区域22以包括腹腔丛的特定神经节，而排除腹腔丛的不同神经节(并且还排除不是腹腔丛的一部分的神经节)。因此，可以选择感兴趣区域22以对应于具有或邻近期望的神经节或神经节的靶组织的一部分。可以选择能量施加以优先触发从突触内神经释放一种或多种分子(例如神经递质)。
62.在一个实施方案中，可以将能量施加到两个或更多个感兴趣区域22。在一些实施方案中，可以选择能量施加参数以诱导组织内直接接受能量的神经或非神经元部件的优先激活，以诱导期望的组合生理作用。在某些实施方案中，能量可以聚焦或集中在小于约25mm3的体积内。在某些实施方案中，能量可以聚焦或集中在约0.5mm
3-50mm3的体积内。用于将能量聚焦或集中在感兴趣区域22内的聚焦体积和聚焦深度可以受到能量施加装置12的
尺寸/结构的影响。能量施加的聚焦体积可以由能量施加装置12的聚焦场限定。
63.如本文所提供的，可以将能量基本上仅施加到一个或多个感兴趣区域22，以靶向方式优先激活突触，以实现靶向的生理结果，而基本上不以一般或非特异性方式施加到整个组织。因此，仅有多个不同类型的神经节的子集暴露于直接能量施加。例如，可以在空间上选择含有血管、神经或其它解剖界标的器官内的感兴趣区域，并用于识别具有特定轴突终端和突触的区域。在一个实施方案中，通过识别脾或肝动脉并在空间上选择接近或平行于脾或肝动脉的区域来选择感兴趣区域。可以基于亚器官组织功能、血管和神经支配来分割器官架构，并且可以选择轴突末端的子集以包括在向其直接施加能量的感兴趣区域中。其它神经节或神经结构可以在感兴趣区域22外部，并且可以不暴露于直接施加的能量。可以基于包括但不限于历史或实验数据(例如，显示特定位置与期望的或靶向的生理结果的关联的数据)的因素来选择感兴趣区域22。作为另外一种选择或除此之外，系统10可以将能量施加到腹腔丛的单个神经节，直到实现期望的靶向的生理作用。
64.图22是系统10的某些部件的框图。如本文所提供的，用于神经调制的系统10可以包括脉冲发生器14，其适于产生用于施加到受试者的组织的多个能量脉冲。脉冲发生器14可以是独立的，或者可以集成到外部装置(例如控制器16)中。控制器16包括用于控制装置的处理器30。软件代码或指令存储在控制器16的存储器32中，用于由处理器30执行以控制装置的各种部件。控制器16和/或脉冲发生器14可以经由一个或多个导线33或无线地连接到能量施加装置12。
65.控制器16还包括具有输入/输出电路34和显示器36的用户界面，其适于允许临床医生向调制程序提供选择输入或调制参数。每个调制程序可以包括一组或多组调制参数，包括脉冲幅度、脉冲宽度、脉冲频率等。脉冲发生器14响应于来自控制器装置16的控制信号修改其内部参数，以改变通过导线33传输到向其施加能量施加装置12的受试者的能量脉冲的刺激特性。可以采用任何合适类型的脉冲发生电路，包括但不限于恒定电流、恒定电压、多个独立的电流或电压源等。所施加的能量是电流幅度和脉冲宽度持续时间的函数。控制器16允许通过改变调制参数和/或在某些时间启动能量施加或在某些时间取消/抑制能量施加来可调节地控制能量。在一个实施方案中，能量施加装置的可调节的控制基于关于受试者中一种或多种分子(例如，循环分子，例如与ibd相关的生物标志物)的浓度的信息。如果信息来自评估装置20，则反馈回路可以驱动可调节的控制。例如，如果如由评估装置20测量的循环ibd生物标志物浓度高于预定的阈值或范围，则控制器16可以启动对感兴趣区域的能量施加，并且利用与生物标志物的减少相关的调制参数。能量施加的启动可以由ibd生物标志物漂移到超过预定的(例如，期望的)阈值或预定义的范围之外而触发。在另一个实施方案中，当能量的初始施加在预定的时间范围(例如，1小时、2小时、4小时、1天)内没有导致靶向的生理结果(例如，感兴趣分子的浓度)的预期变化时，可调节的控制可以是改变调制参数的形式。
66.在一个实施方案中，存储器32存储可由操作者选择的不同操作模式。例如，所存储的操作模式可以包括用于执行与特定治疗部位相关联的一组调节参数的指令。不同的部位可以具有不同的相关的调制参数。控制器16可以被配置为基于选择来执行适当的指令，而不是让操作者手动输入模式。在另一个实施方案中，存储器32存储用于不同类型治疗的操作模式。例如，激活可以与相对于与抑制或阻断组织功能相关联的刺激压力或频率范围不
同的刺激压力或频率范围相关联。在具体的实例中，当能量施加装置是超声换能器时，时间平均功率(时间平均强度)和峰正压在1 mw/cm
2-30,000 mw/cm
2 (时间平均强度)和0.1 mpa-7 mpa (峰值压力)的范围内。在一个实例中，在感兴趣区域中时间平均强度小于35 w/cm2，以避免与热损伤和消融/空化相关联的水平。在另一个具体实例中，当能量施加装置是机械致动器时，振动的振幅在0.1-10 mm的范围内。所选频率可以取决于能量施加的模式，例如超声或机械致动器。
67.在另一个实施方案中，存储器32存储校准或设置模式，其允许调节或修改调制参数以实现期望的结果。在一个实例中，刺激以较低能量参数开始，并且自动地或在接受到操作者输入时递增地增加。以这种方式，操作者可以在改变调制参数时实现对诱导的作用的调谐。
68.系统还可以包括成像装置，例如成像换能器40，当能量施加装置12在来自控制器16的指令下以成像模式操作时通过获取成像数据来促进聚焦能量施加装置12。能量施加装置12可以包括超声治疗换能器42，当在来自控制器16的指令下以治疗模式操作时其能够将聚焦超声能量施加到感兴趣区域22内的靶。能量施加装置12可以包括用于控制成像换能器40和/或超声治疗换能器42的控制电路。处理器30的控制电路可以集成到能量施加装置12 (例如，经由集成控制器16)或者可以是单独的部件。成像换能器40还可以被配置为获取图像数据以辅助在空间上选择期望的或靶向的感兴趣区域并将所施加的能量聚焦在靶组织或结构的感兴趣区域上。
69.在一个实施方案中，成像设备(换能器40)可以与能量施加设备12集成或与其相同，使得施加不同的超声参数(频率、孔径或能量)以用于选择(例如，在空间上选择)感兴趣区域并且用于将能量聚焦到所选择的感兴趣区域以用于靶向和随后的神经调制。在另一个实施方案中，存储器32存储一个或多个用于在空间上选择器官或组织结构内的感兴趣区域的靶向或聚焦模式。空间选择可以包括选择器官的子区域以识别对应于感兴趣区域的器官体积。在空间上选择可以依赖于如本文所提供的图像数据。在一个实施方案中，可以将控制器16编程为自动识别或基于图像数据来选择感兴趣区域。在实施方案中，图像数据可以在显示器36上显示，并且操作者可以指定对应于感兴趣区域的图像的部分。基于用户输入，控制器16可以选择感兴趣区域。基于空间选择，能量施加装置12可以聚焦在对应于感兴趣区域的所选体积上。例如，能量施加装置12可以被配置为首先以成像模式操作以施加成像模式能量，该成像模式能量用于捕获要用于识别感兴趣区域的图像数据。成像模式能量不在适于优先激活的水平和/或施加调制参数。然而，一旦识别感兴趣区域，控制器16然后可以根据与如本文所提供的与神经调制相关联的调制参数在治疗模式中操作。
70.控制器16还可以被配置为接受与靶向的生理结果相关的输入作为对调制参数的选择的输入。例如，当使用成像模态来评估组织特性时，控制器16可以被配置为接受特性的计算的指数或参数。基于该指数或参数是高于还是低于预定的阈值，可以修改调制参数。在一个实施方案中，参数可以是受影响组织的组织位移的度量或受影响组织的深度的度量。其它参数可以包括评估一个或多个感兴趣分子的浓度(例如，评估相对于阈值或基线/对照的浓度变化、变化率、确定浓度是否在期望的范围内中的一个或多个)。此外，能量施加装置12可以在控制器16的控制下操作，以a)获取组织的图像数据，其可以用于在空间上选择靶组织内的感兴趣区域，b)将调制能量施加到感兴趣区域，以及c)获取图像数据，以确定靶向
的生理结果已经发生(例如，经由位移测量)。在这样的实施方案中，成像装置、评估装置20和能量施加装置12可以是相同的装置。
71.在另一个实现中，还可以由控制器16存储期望的调制参数组。以这种方式，可以确定受试者特异性参数。此外，可以随着时间评估这样的参数的有效性。如果特定的参数组随时间而不太有效，则受试者可能对激活的途径产生不敏感性。如果系统10包括评估装置20，则评估装置20可以向控制器16提供反馈。在某些实施方案中，可以从用户或评估装置20接受指示靶生理结果的特性的反馈。控制器16可以被配置为引起能量施加装置根据调制参数施加能量，并且基于反馈动态地调节调制参数。例如，基于反馈，处理器16可以实时地并且响应于来自评估装置20的反馈自动地改变调制参数(例如，超声波束或机械振动的频率、幅度或脉冲宽度)。
72.所公开的技术可以用于评估神经调制作用，其进而可以用作用于选择或修改神经调制参数的输入或反馈。所公开的技术可以使用组织状况或功能的直接评估作为靶向的生理结果。评估可以在神经调制之前(即，基线评估)、期间和/或之后发生。
73.评估技术可以包括功能磁共振成像、扩散张量磁共振成像、正发射断层摄影或声学监测、热监测中的至少一个。评估技术还可以包括蛋白质和/或标记物浓度评估。来自评估技术的图像可以由系统接受用于自动或手动评估。基于图像数据，也可以修改调制参数。例如，器官大小或位移的变化可以用作局部神经递质浓度的标志，并用作局部细胞暴露于调制神经递质的表型的替代标志，并有效地用作ibd途径的预测作用的标志。局部浓度可以指能量施加的聚焦场内的浓度。
74.除此之外或作为另外一种选择，系统可以评估组织中或血液中循环的一种或多种分子的存在或浓度。组织中的浓度可以称为局部浓度或驻留浓度。组织可以通过细针抽吸物获取，并且可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适的技术进行对感兴趣分子(例如，代谢分子、代谢途径的标志物、肽递质、儿茶酚胺)的存在或水平的评估。如本文所提供的，感兴趣分子可以是ibd生物标志物中的一种或一种或多种，其可以是细胞因子(tnf-α、il-1 β)、核周抗嗜中性粒细胞抗体、抗酿酒酵母抗体、钙防卫蛋白、c反应蛋白或抗鞭毛蛋白抗体。
75.在其它实施方案中，靶向的生理结果可以包括但不限于组织位移、组织大小变化、一种或多种分子的浓度变化(局部、非局部或循环浓度)、基因或标记物表达的变化、传入活性和细胞迁移等。例如，组织位移(例如，相邻动脉的血管位移)可以作为向组织施加能量的结果而发生。通过评估组织位移(例如，经由成像)，可以估计其它作用。例如，某一位移可以是分子浓度的特定变化的特性。
76.图23是用于神经调制腹腔丛的方法50的流程图。在方法50中，在步骤52获取受试者的图像数据，以识别受试者的可能包括待调制的期望的外周神经节的区域。例如，虽然使用超声图像使单个神经节可视化可能是有挑战性的，但是可以使用一个或多个可视化的解剖界标的识别来识别感兴趣区域。这样的视觉界标可以包括识别腹主动脉和与邻近腹腔丛的外周神经节的动脉的一个或多个接合处。在一个实例中，感兴趣区域可以定位为包括腹主动脉与肝动脉或与脾动脉的接合处。在另一实例中，可以基于与这样的接合处的相对位置(例如，间隔开1-10 mm)来选择感兴趣区域。在步骤54，能量施加装置被定位成使得能量脉冲聚焦在期望的感兴趣区域，并且在步骤56，脉冲发生器将多个能量脉冲施加到靶组织
的感兴趣区域，以优先激活位于感兴趣区域中的腹腔丛中的至少一部分外周神经节，例如，以刺激神经节释放神经递质和/或诱导改变的神经递质释放和/或诱导改变的活性，如本文所提供的。在实施方案中，感兴趣区域包含腹腔丛或腹腔丛的至少一部分。在实施方案中，感兴趣区域包含腹腔丛的外周神经节。在某些实施方案中，所述方法可以包括评估刺激作用的步骤。例如，可以使用组织功能或状况的状态的一个或多个直接或间接评估。基于所评估的组织功能，可以修改(例如，动态地或可调节地控制)一个或多个能量脉冲的调制参数以实现靶向的生理结果。
77.在一个实施方案中，可以在施加能量脉冲之前和之后进行评估，以评估感兴趣分子的浓度变化、粪便特性(粪便稠度、粪便血液存在)。在一个实施方案中，评估可以包括dai确定。如果评估标记高于或低于阈值，则可以对调制参数进行适当的修改。例如，如果标记在期望的生理结果内或与期望的生理结果相关联，则在神经调制期间施加的能量可以逐步回到支持期望的结果的最小水平。如果相对于阈值的特性变化与标志的不足变化相关联，则可以改变某些调制参数，包括但不限于调制幅度或频率、脉冲形状、刺激模式和/或刺激位置。
78.此外，所评估的特性或状况可以是值或指数(例如，dai)，例如，流速、浓度、细胞群(例如，白细胞位置或特性的变化)或其任何组合，其进而可以通过合适的技术分析。例如，超过阈值的相对变化可以用于确定调制参数是否被修改。可以经由测量的临床结果来评估期望的调制，例如组织结构尺寸(例如结肠组织特征)增加的存在或不存在或者一种或多种释放的分子的浓度变化(例如相对于神经调制之前的基线浓度)。在一个实施方案中，期望的调制可以涉及浓度增加超过阈值，例如相对于基线浓度增加超过约50%、100%、200%、400%、1000%。对于阻断治疗，评估可以涉及追踪分子浓度随时间的降低，例如，感兴趣分子浓度降低至少10%、20%、30%、50%或75%。此外，对于某些受试者，期望的阻断治疗可以涉及在可能倾向于增加分子浓度的其它临床事件的背景下保持特定分子的相对稳定的浓度。也就是说，期望的阻断可以阻断潜在的增加。可以在从治疗开始的某个时间窗口内(例如约5分钟内、约30分钟内)测量增加或减少或其它诱导的和可测量的作用。在某些实施方案中，如果确定神经调制是期望的，则神经调制的变化是停止施加能量脉冲的指令。在另一个实施方案中，如果不期望神经调制，则改变神经调制的一个或多个参数。例如，调制参数的变化可以是脉冲重复频率的增加，例如10-100 hz的频率的逐步增加以及对期望的特性的评估，直到实现期望的神经调制。在另一个实现中，可以改变脉冲宽度。在其它实施方案中，可以一起、并行或串行地改变两个或更多个参数。如果在多个参数改变之后不期望神经调制，则可以改变能量施加的焦点(即，部位)。
79.在一个实例中，本技术可以用于治疗具有改进的ibd样症状学的受试者，以改进粪便稠度、总出血/腹泻和结肠组织完整性。在ibd中，各种病因学因素扰乱肠中免疫细胞的微妙稳态，例如t1、t2、t17、treg，其可以在自持周期中经由激活的巨噬细胞和树突细胞产生炎性细胞因子级联。一些值得注意的候选物包括肿瘤坏死因子-α (tnf-α)、干扰素-γ (ifn-γ)、白细胞介素-(il-)17、il-22、il-1、il-6、il-8、il-12和il-18。这些炎性细胞因子可以引起良性局部炎性反应，但不受控的过度产生可以引起组织损伤、难以超声凝固、死亡和/或低血压。考虑到这一点，经由胆碱能抗炎途径(cap)可以完成减轻肠道炎症和组织损伤中失调的细胞因子水平。靶向腹腔丛促进选择性区分脾(“全身”)相对于肠(“局部”)胆
碱能抗炎途径，以及激活肠系膜内不同位置的肠cap，所述位置包含肠系膜上神经节、腹腔神经节、肠系膜下神经节、背根神经节或肠肌丛。在某些实施方案中，所公开的技术允许在不激活脾cap的情况下或在相对较低地激活脾cap的情况下激活肠cap。本技术提供了优于已显示需要脾/脾神经节作为肠神经元激活途径的电迷走神经刺激装置的优点。本技术精确调制肠途径而不是脾途径。在某些实施方案中，激活可以是全身性/脾、局部/肠或混合/组合刺激。针对ibd治疗优化，可以进一步描述选择靶向特异性外周神经节相对于直接激活肠肌丛的cap刺激位点，以及选择特定超声刺激参数(包括刺激的功率、持续时间和剂量时间)。
80.本技术证明，当聚焦超声分别每天施加一次或两次时，在给定的轻微(5%)和更严重(7%) dss中ibd症状减轻。靶向腹腔丛导致聚焦超声对ibd症状学的功效。腹腔丛是一组负责从胰腺、肝、肾、胆囊、脾和肠发送信息的神经。存在四个与腹腔丛相关的主神经节，并且所公开的实例靶向腹腔丛的上部，包含腹腔神经节和肠系膜上神经节。肠系膜上神经节负责神经支配肠，这使其成为聚焦超声治疗ibd的理想靶。左腹腔神经节和右腹腔神经节两者也都起肠神经支配的作用，但是这些神经节也与肝活性有关。在大鼠中，测量肠系膜上神经节距腹腔神经节大约3mm。假定换能器的直径为约20 mm，焦点为1mm，换能器在该神经丛上的精确放置是成功的因素。偏离靶的聚焦超声可以解释为什么一些动物用聚焦超声比其它动物表现出好得多的粪便稠度、血性粪便和结肠长度。出于类似的考虑，在异氟烷麻醉下呼吸的动物可能引起胸部运动和换能器焦点的改变，随后误靶向腹腔丛。此外，这也可以解释用聚焦超声观察到的重量减轻，因为特定腹部位置的神经调制可以导致胃肠系统内肠降血糖素途径的直接激活。因此，考虑呼吸诱导的运动可以改进靶向。此外，这样的可变性可以指出使用具有更靶向(聚焦)和更少扩散作用的相对较小换能器的优点。
81.所公开的实施方案的技术作用包括用于在腹腔丛上非侵入性聚焦超声的技术，以减小ibd的作用，例如血性粪便，以改进粪便稠度并保护组织长度和完整性。本技术可以用于治疗对药物干预或对增加药物或外科手术干预无响应的患者。
82.本书面描述使用实例(包括最佳模式)并且还使本领域任何技术人员能够实践所公开的实施方案，包括制造和使用任何装置或系统，以及执行任何结合的方法。可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这样的其它实例旨在处于权利要求的范围内。
再多了解一些
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