4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及其有关物质的测定方法与流程

1.本发明涉及一种物质的测定方法，尤其涉及一种4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及其有关物质的测定方法。


背景技术：

2.罗沙司他(roxadustat)，化学名化学名为n-[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-异喹啉)羰基]甘氨酸，主要用于治疗慢性肾病和终末期肾病相关的贫血症。由美国菲布罗根公司研发，是一种低氧诱导因子脯氨酸羟化酶抑制剂(hif-phi)，能够在氧分压正常的情况下抑制hif-脯氨酰羟化酶，稳定hif-α，促进内源性促红细胞生成素erythropoietin，epo生成及改善铁吸收利用，综合调控促红细胞生成。在中国所进行的治疗透析依赖(dd-ckd)和非透析依赖(ndd-ckd)的慢性肾病患者贫血状况的两项iii期临床试验结果均达到了主要有效终点。
[0003]
4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯作为罗沙司他的起始物料，其分子式为c
17h13
no4，分子量为295.08，结构式为：
[0004][0005]
该起始物料的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品的质量，通过分析本品原料药的合成工艺路线，对杂质谱进行梳理，本品涉及以下5种杂质：
[0006]
杂质a：杂质b：杂质c：杂质d：和杂质e：
[0007]
以上杂质带入到原料药或制剂中，直接影响其质量、安全性、有效性，现有技术中未见针对4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及上述有关物质测定方法的报道。


技术实现要素：

[0008]
发明目的：本发明旨在提供一种稳定有效且操作简单的4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及其有关物质的测定方法，能够有效分离4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及多个杂质，且峰形良好并达到分离度的要求。
[0009]
技术方案：本发明所述的4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及其有关物质的测定方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)配制供试品溶液、对照溶液、分离度溶液、系统适用性溶液；
[0011]
(2)采用反相液相色谱法，流动相a为体积百分比为0.08％～0.12％三氟乙酸水溶液，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱，流动相b的起始体积百分比为20％～30％，采用高效液相色谱仪进行检测分析；
[0012]
所述有关物质包括：
[0013]
杂质a：杂质b：杂质c：杂质d：和杂质e：
[0014]
优选地，所述梯度洗脱程序为：0～30min，流动相a体积百分比由70％～80％降至5％～15％，流动相b的体积百分比由20％～30％升至85～95％；30～35min，流动相a的体积百分比为5％～15％，流动相b的体积百分比为85～95％。
[0015]
优选地，所述梯度洗脱程序为：0～30min，流动相a体积百分比由70％～80％降至5％～15％，流动相b的体积百分比由20％～30％升至85～95％；30～35min，流动相a的体积百分比为5％～15％，流动相b的体积百分比为85～95％；35～35.1min，流动相a体积百分比由5％～15％升至70％～80％，流动相b的体积百分比由85～95％降至20％～30％；35.1～45min，流动相a的体积百分比为70％～80％，流动相b的体积百分比为20％～30％。
[0016]
优选地，所述梯度洗脱程序为：0～30min，流动相a体积百分比由75％降至10％，流动相b的体积百分比由25％升至90％；30～35min，流动相a的体积百分比为10％，流动相b的体积百分比为90％；35～35.1min，流动相a体积百分比由10％升至75％，流动相b的体积百分比由90％降至25％；35.1～45min，流动相a的体积百分比为75％，流动相b的体积百分比为25％。
[0017]
优选地，所述液相检测采用的检测器为紫外吸收检测器，其检测波长为255～265nm和225～235nm。
[0018]
优选地，所述液相检测采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱温为30～40℃。
[0019]
优选地，所述流动相流速为0.8～1.2ml/min。
[0020]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)所述检测方法稳定有效且操作简单，能够有效分离4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及多个杂质，样品成分保留能力强，分离度好；(2)灵敏度高，杂质含量测定结果准确，在本发明的色谱条件下能够准确检测相关已知杂质，且主峰与杂质峰能够达到有效分离；(3)通过方法学验证，检测方法准确可行，专属性、重复性和线性良好。
附图说明
[0021]
图1为实施例1中空白溶液(260nm)的色谱图；
[0022]
图2为实施例1中空白溶液(230nm)的色谱图；
[0023]
图3为实施例1中分离度溶液(260nm)的色谱图；
[0024]
图4为实施例1中分离度溶液(230nm)的色谱图；
[0025]
图5为实施例1中供试品溶液(260nm)的色谱图；
[0026]
图6为实施例1中供试品溶液(230nm)的色谱图。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0028]
实施例1
[0029]
分离度考察
[0030]
高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为agilent eclipse xdb-c18柱(规格为4.6mm
×
150mm，填料粒径为3.5μm)，以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，按照下表1进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；检测波长为260nm和230nm；柱温为35℃。
[0031]
表1梯度洗脱
[0032]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0.0752530.0109035.0109035.1752545.07525
[0033]
溶液配制：
[0034]
供试品溶液：取4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯适量，精密称定，加稀释剂乙腈超声使溶解并稀释制成每1ml约含4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯0.5mg的溶液。
[0035]
对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，用乙腈稀释制成每1ml约含4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯0.5μg的溶液。
[0036]
杂质对照品贮备液：分别取杂质a对照品、杂质b对照品、杂质c对照品、杂质d对照品、杂质e对照品适量，分别加乙腈溶解并稀释制成每1ml约杂质d10μg，其余各杂质5μg的溶液。
[0037]
分离度溶液：取4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯供试品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，另取上述各杂质对照品贮备液适量，制成每1ml约杂质d1μg，其余各杂质0.5μg，4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯0.5mg的混合溶液。
[0038]
系统适用性溶液：取4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯对照品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，另取上述各杂质对照品贮备液适量，制成每1ml约杂质d1μg，其余各杂质0.5μg，4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯0.5mg的混合溶液。
[0039]
空白溶液：乙腈
[0040]
精密量取空白溶液、分离度溶液、供试品溶液进行测定。图谱见图1、图2、图3、图4、
图5、图6，检测结果见表2。结果表明，空白溶液无干扰，主成分与杂质之间以及各杂质之间均能有效分离，表明本方法专属性良好。
[0041]
表2分离度检测结果
[0042][0043]
实施例2
[0044]
定量限、检测限考察
[0045]
参照实施例1中方法配制主成分(4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯)对照品和杂质对照品贮备液，分别精密量取各杂质对照品贮备液适量，用乙腈逐步稀释测定，将信噪比约为10:1时作为定量限，将信噪比约为3:1时作为检测限。并将定量限浓度的溶液，连续进样6次，考察定量限溶液进样精密度。结果见表3、表4。结果表明本方法灵敏度良好。
[0046]
表3检测限与定量限
[0047][0048]
表4定量限进样精密度试验结果
[0049]
s/n杂质a杂质d杂质b杂质c杂质e主成分125.339.317.812.113.635.3231.747.521.614.421.842.9330.146.120.514.816.141.7444.766.830.820.917.959.8525.139.118.011.114.635.4639.358.826.217.918.352.3均值32.749.622.515.217.144.6保留时间杂质a杂质d杂质b杂质c杂质e主成分114.09314.85022.63023.7677.69017.800214.09314.85022.63023.7777.69017.800314.09714.85022.63323.7707.67317.800
414.09714.85022.63023.7737.67317.800514.09314.85022.63023.7737.67317.797614.09714.85022.63323.7677.66717.803均值14.09514.85022.63123.7717.67717.800rsd(％)0.020.000.010.020.130.01峰面积杂质a杂质d杂质b杂质c杂质e主成分10.03080.04640.02410.01390.03390.047720.03160.04580.02470.01360.04170.046830.02920.04500.02240.01560.03720.046840.03240.04820.02420.01480.04280.045450.03110.04710.02500.01260.03840.049060.03210.04630.02500.01460.03650.0458均值0.03120.04650.02420.01420.03840.0469rsd(％)3.682.364.037.398.682.78
[0050]
实施例3
[0051]
线性考察
[0052]
参照实施例1中方法配制主成分(4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯)对照品和杂质对照品贮备液，分别精密量取各杂质对照品贮备液适量，用乙腈稀释制成一系列浓度，作为各成分的线性溶液。检测结果见下表5。采用标准曲线法测定校正因子，取线性结果测得的校正因子，结果见表6。结果表明，采用本发明的色谱条件，各待测成分线性关系良好。
[0053]
表5线性考察结果
[0054][0055]
表6校正因子
[0056]
名称斜率校正因子主成分-260nm0.4762/主成分-230nm0.4102/杂质a0.31721.5杂质b0.23792.0杂质c0.15553.1杂质d0.59610.80杂质e-230nm0.25431.6
[0057]
实施例4
[0058]
溶液稳定性考察
[0059]
分别于不同时间取系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表7、表8。结果表明，系统适用性溶液和对照溶液在室温条件下放置51小时，各杂质峰面积及主峰峰面积与0小时比较，比值均在90.0％～110.0％之间，供试品溶液在室温条件下放置51小时内，各时间点各杂质含量与0小时比较，均无大于报告限杂质检出。表明在室温条件下，系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液至少放置51小时内稳定。
[0060]
表7有关物质溶液稳定性试验-系统适用性溶液
[0061][0062]
表8有关物质溶液稳定性试验-对照溶液
[0063]
时间峰面积比值0h0.2630/7h0.257297.8％14h0.260899.2％21h0.2654100.9％28h0.2687102.2％36h0.2718103.3％44h0.2744104.3％51h0.2778105.6％
[0064]
实施例5
[0065]
重复性考察
[0066]
精密称取4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯样品6份，分别加入杂质限度100％的杂质对照品溶液，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。分别精密量取各供试品溶液稀释1000倍，作为对照溶液。分别精密量取上述供试品溶液和对照溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以各杂质[(测的量-原有量)/加入量]计算回收率，结果见表9。结果表明，各杂质回收率均在80％～120％之间，rsd小于10.0％，表明本方法重复性良好。
[0067]
表9重复性计算表
[0068]
杂质名称平均回收率回收率rsd杂质a100.8％1.0％杂质b102.3％1.5％杂质c101.3％1.9％杂质d99.1％1.4％杂质e103.5％7.9％
[0069]
实施例6
[0070]
准确度考察
[0071]
精密称取4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯样品12份，分别加入杂质限度50％、100％、150％的杂质对照品溶液，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。分别精密量取各供试品溶液稀释1000倍，作为对照溶液。分别精密量取上述供试品溶液和对照
溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以各杂质[(测的量-原有量)/加入量]计算回收率，结果见表10。结果表明，各杂质回收率均在80％～120％之间，rsd小于10.0％，表明本方法准确度良好。
[0072]
表10准确度计算表
[0073]
杂质名称回收率范围平均回收率rsd杂质a99.80％～105.62％102.5％3.0％杂质b100.99％～109.20％104.2％2.2％杂质c95.44％～104.46％100.5％2.6％杂质d97.04％～103.38％100.1％3.0％杂质e90.74％～111.63％100.8％8.4％
[0074]
综上所述，本发明方法测定4-羟基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯及其有关物质，专属性强、灵敏度高、重复性和线性良好、准确度高。