一种布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型及其构建方法和应用

1.本发明涉及小鼠模型构建技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.近几年来，随着全球变暖不断进展，生物群落的生存环境发生了巨大改变，加上全球化进程的不断深化，可能是导致近年各种全球性传染病肆虐的原因之一。呼吸道传播是传染病传播的主要途径之一，且呼吸道是与外界直接连通，是多种病原体侵犯机体的途径。在当前呼吸道传染病全球肆虐的大背景下，在诊疗过程和临床死亡病例报告中，我们发现大多数的呼吸道重症感染患者和死亡病例均存在细菌和病毒的混合感染。因此混合感染或许是患者病程加重的一个重要因素。有学者研究证实sars-cov-2感染患者接受抗生素治疗并不会改善细菌共感染患者死亡率或疾病进展，甚至还有可能增加患者的病死率。这使得临床上重症呼吸道混合感染患者的治疗一直是一个难以解决的难题，目前对于大多数急性重症患者，只能使用激素冲击疗法和对症治疗。因此从免疫学的角度研究细菌-病毒在肺部共感染导致的过度免疫炎症反应不仅能为降低当前感染性肺炎临床病死率提供干预方案，甚至也能为未知的大流行提供部分诊疗依据。
3.近年来布鲁氏菌传播呈“死灰复燃”的态势，布鲁氏菌具有高感染率，高致病率，感染后潜伏期长，很难完全治愈的特点，且多会留下严重的后遗症。甲型流感病是传播范围最广，致病能力最强的流感病毒亚型，且繁殖速度快和经常在多物种之间存在交叉感染，变异性最强，常常导致地区局部和全球范围内的大流行。研究机体对不同病原体的免疫机制，寻找有效的防控措施，需要建立理想的动物模型。因此有必要提供一种布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型及其构建方法，以便于研究布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染机制和防控措施。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型及其构建方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型的构建方法，于小鼠麻醉后，采用肺递送方式感染甲型流感病毒，10～14h后，采用肺递送方式感染布鲁氏菌。
7.优选的，所述甲型流感病毒为甲型h1n1流感病毒株为pr8株。
8.优选的，所述布鲁氏菌为布鲁氏菌s2菌株。
9.优选的，所述布鲁氏菌s2菌株的接种量为107cfu/只。
10.优选的，所述甲型h1n1流感病毒株为pr8株的接种量为103pfu/只。
11.本发明还提供了一种按照所述的构建方法得到的布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染
小鼠模型。
12.本发明还提供了一种所述的布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型在研究流感病毒和布鲁氏菌共感染发病性状和致病机理中的应用。
13.本发明提供的布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型聚焦于急性肺损伤。真实环境中布鲁氏菌和流感以气溶胶感染为常见的传播途径，且气溶胶具有严重致病性和高隐蔽性特点被用作生物战剂。因此本发明使用布鲁氏菌疫苗株s2通过ld50和mid计算出合适的攻毒剂量，以最大不致死剂量107cfu/只气溶胶感染c57bl/6n小鼠，攻毒后第2～4天为急性期，呼吸系统和全身症状明显，所有小鼠均全身多脏器带菌。说明该剂量s2在小鼠体内的毒力明显，可用于共感染模型的建立及后续的机制研究。
14.使用甲型流感病毒pr8株通过ld50和组织tcid50测定毒株毒力，以最大不致死剂量103pfu/只气溶胶感染c57bl/6n小鼠，感染后第3天，小鼠出现明显体重减轻，组织tcid50达到9.190e
±
2.074/g，并出现抱团、竖毛、寒颤等症状。此后体重逐渐降低、症状逐渐加重，多于感染后7～8天开始恢复，说明该剂量pr8在小鼠体内的毒力明显，可用于共感染模型的建立及后续的机制研究。遂使用上述毒株和剂量前后间隔12小时，采用肺递送方式攻毒建立布鲁氏菌-甲型流感共感染模型。
15.本发明构建的布鲁氏菌-甲型流感病毒共感染小鼠模型较为理想，可用于探究布鲁氏菌和流感病毒共感染导致急性肺损伤和细胞因子风暴的协同致病机制，筛选共感染急性肺损伤和细胞因子风暴的特征性指标，为早期诊断、预防和临床干预治疗提供候选靶标。
附图说明
16.图1为攻毒后小鼠随时间的体重变化和生存曲线；
17.图2为小鼠攻毒后第三天的肺组织病理变化；
18.图3为攻毒后第三天肺脏载菌量和病毒载量测定；
19.图4为攻毒后第三天各细胞因子变化情况；
20.图5为攻毒后第三天小鼠肺部nlrp6相关基因相对表达量；
21.图6为小鼠攻毒后第三天肺部细菌/病毒载量及焦亡相关基因相对表达量；
22.图7为攻毒后第三天wt小鼠和基因敲除小鼠肺病理切片。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
24.实施例1
25.1材料
26.1.1实验动物：spf级4周龄雌性野生型c57bl/6n(wild-type mice，wt，体重10～12g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号(scxk(京)2016-0011)。
27.1.2细胞系：实验所用的mdck细胞系购自atcc，军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所细胞库提供。mdck细胞培养于dmem培养基，培养基内加入10％血清与100u/ml青霉素-链霉素，培养细胞传代使用胰蛋白酶，均购自gibco。
28.1.3病毒株：本研究中使用的甲型h1n1流感病毒株为pr8株(a/pr/8/1934)，毒种由
军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病毒库提供，h1n1流感病毒株接种于9～11日龄spf级鸡胚，扩增并建立病毒库保存于实验室-80℃。病毒滴度通过mdck细胞感染半数致死剂量计算(reed-muench法)。本研究中所有涉及到病毒的实验均在生物安全二级实验室进行。
29.1.4菌株：猪种布鲁氏菌疫苗株s2购自新疆天康生物股份有限公司。
30.1.5主要仪器和试剂
31.96微孔细胞培养板；鸡红细胞；二氧化碳孵箱；电热恒温水浴锅；低温高速离心机；trizol；75％乙醇；rnase free dh2o；核酸浓度监测仪nanodrop 2000；pcr仪；荧光实时定量pcr仪；超净工作台；冰箱与超低温冰箱；电子分析天平；电热恒温鼓风干燥箱dgg-9023a型；tryptic soy agar培养基；tryptic soy broth培养基；brucella selective supplement；泊洛沙姆188sigma美国；细胞因子检测试剂盒；小动物喉镜北京慧荣和科技有限公司；手持式液体气溶胶肺递送装置北京慧荣和科技有限公司；酶标仪；紫外-可见分光光度计uv8000 analytik jena ag公司；组织匀浆仪roche。
32.2方法与结果
33.2.1菌液制备：取20μl布鲁氏菌s2甘油菌接种于20ml的tsb培养基中，于37℃摇床200rpm振荡培养16h左右至对数中期(od
600nm
≈1.6)，20倍稀释转接于20ml的tsb中，继续于振荡培养8h左右至对数中期，离心集菌，用0.05％泊洛沙姆的生理盐水洗菌2次后再次重悬，调od
600nm
使得菌浓度约为2
×
108cfu/ml(全菌浓度)用于后期小鼠感染模型建立。另取少量菌液进行梯度稀释后涂板计数，计算实际菌浓度(活菌浓度)。
34.2.2感染模型建立
35.1)实验分组：分4组，每组10只小鼠，采用肺递送的接种方式：接种布鲁氏菌s2组；接种流感病毒h1n1 pr8株；接种s2和pr8组；接种pbs。将所有小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，待夹捏小鼠四肢瘫软和巩膜反应消失，进行后续攻毒实验。
36.2)攻毒剂量和攻毒时间：两次攻毒间隔12h。
37.p组(pr8)小鼠接种50μl pbs和50μl pr8(103pfu)；
38.b组(brucella)小鼠接种50μl s2(107cfu)和50μl pbs；
39.g组(co-infection)小鼠接种50μl pr8(103pfu)和50μl s2(107cfu)；
40.d组(control)接种100μl pbs。
41.3)实验动物攻毒：将进入麻醉状态的小鼠安置在肺递送装置专用的实验台上，借助镊子，夹住小鼠舌头，向口外牵拉，打开喉镜，顺小鼠口咽方向探伸，可见到随呼吸一张一合的会厌，在会厌张开时，用备好的手持式气溶胶肺递送装置深入咽喉到达气管，并快速推进一个卡扣。注意避免引起小鼠呛咳反应或窒息而死。小鼠接种完毕，头高位放置，以免液体通过小鼠气管鼻腔倒流，保证接种剂量的准确。接种后3h左右小鼠苏醒，观察小鼠有无死亡。实验过程中给予小鼠充足的食物和水，每天12h光照。在感染后每天记录小鼠体重变化及死亡情况至第14天，并记录症状(耸毛、呼吸困难、强迫性腹部呼吸、被触摸或外部刺激后反应迟钝)。
42.结果：与空白对照组相比，单pr8感染组小鼠攻毒后第三天开始出现抱团、耸毛、寒战，第六天出现个别呼吸困难、强迫性腹部呼吸、反应迟钝等，至感染后第8天，死亡率达10％，其余存活小鼠逐渐恢复；单s2感染组小鼠攻毒后第一天即出现抱团、竖毛、寒战等临
床表现，多于第4～5天开始恢复，无小鼠死亡。共感染组小鼠感染后第二天即出现明显临床症状，第六天组内一半小鼠死亡，其余全部小鼠均出现濒死症状，感染后第八天死亡率达到80％，其余存活小鼠体重逐渐恢复(如图1所示)。
43.2.3小鼠组织器官病理检测在感染后第3天无菌分离肺脏，将小鼠肺组织置于4％的甲醛溶液中，固定48h；将固定后的样本送至病理室做he染色或荧光染色，在病理室用专用的显微镜拍照。
44.结果：于共感染后第三天摘眼球处死小鼠，取小鼠肺组织做病理切片发现：与对照组相比，共感染组感染后第三天即出现明显的肺泡壁断裂、肺泡融合和肺大疱形成，镜下几乎无完整结构的肺泡，炎性细胞浸润肺泡壁，肺泡壁增厚明显。单pr8感染组第三天时出现肺泡壁增厚断裂，肺大疱形成，肺泡内伴有炎症细胞浸润，但仍存在大量结构完整肺泡。第六天时肺部炎症开始消退，肺泡内少有浸润，留下已经形成的肺大疱无法恢复。单s2感染组在感染后第三天出现大量炎性细胞浸润肺泡壁增厚，但仅有轻度肺泡结构破坏(如图2所示)。
45.2.4布鲁氏菌s2菌在小鼠肺脏的定居力和检测
46.在感染后第三天，每组取10只小鼠，无菌分离肺脏，称重，匀浆，5倍梯度稀释成不同浓度，将不同稀释度的菌液涂布于添加布鲁氏菌选择性添加剂(brucella selective supplement)的tsa培养基，每个稀释度设3个重复，37℃恒温倒置培养3～4天，计数。
47.2.5组织tcid50测定
48.将匀浆后的组织悬液经0.45μm滤器过滤，用无抗无血清培养基10倍比梯度稀释，分别接种于长满单层mdck细胞的96微孔细胞培养板上，每孔100μl，空白对照孔加100μl培养基，最后每孔用培养基补至200μl体系。37℃恒温培养3～5天，观察细胞病变，培养第5天，每孔吸出50μl至血凝板，并加入pbs阴性对照和空白对照孔。随后每孔加入50μl新鲜鸡红细胞，常温静置15分钟，观察红细胞凝集情况。根据血凝试验结果(reed-muench法)测定组织tcid50。
49.2.6qrt-pcr检测流感病毒rna：
50.1)小鼠肺组织匀浆200μl trizol 300μl立即涡旋，静置5min；
51.2)加入200μl氯仿，震荡涡旋15s，4℃静置5min，12000rpm(13400g，4℃)离心10min；
52.3)此时样品分为三层，分别为上层水相，中间层白膜层，下层有机相层，将上述样品的上清液(200μl)小心的吸至新的rnase-free ep管内，加入200μl异丙醇，轻柔颠倒混匀，冰盒静置10min(室温静置20-30min)；
53.4)12000rpm(13400g，4℃)离心10min，弃上清液；
54.5)加1ml 75％乙醇(depc水配置)，震荡混匀，7600rpm(4℃)离心5min，弃上清；
55.6)室温静置15min，晾干沉淀物(或酒精灯周围2-3min)；
56.7)加20μl rnase free dh2o，溶解沉淀物；
57.8)使用nanodrop 2000测定rna浓度，按照以下体系和条件进行反转录：
[0058][0059]
反应条件：25℃5min，42℃30min，85℃5s，4℃无限；
[0060]
9)按照以下反应体系和条件进行qpcr:
[0061][0062]
反应条件：95℃10min，95℃15s、60℃60s、40个循环。
[0063]
表1 q-pcr引物：
[0064][0065]
结果：单独分析两种病原体的增殖情况：感染后第3天共感染组布鲁氏菌s2平板计数为(7.974
±
0.2242)cfu/g显著高于单感染组(6.643
±
0.4695)，且差异具有统计学意义(p《0.05)。共感染组流感病毒pr8的tcid50结果(6.490
±
0.3742)tcid50/g和q-pcr结果(7.673
±
0.9367)均显著低于单感染组tcid50(9.190
±
0.8466)和q-pcr(13.70
±
2.589)，差异具有统计学意义(p《0.05)，结果如图3所示。
[0066]
2.7细胞因子检测
[0067]
将匀浆后的肺组织4℃3000rpm离心5min，收集上清，-20℃保存备用。按照细胞因子检测试剂盒说明书，测感染后第三天肺组织匀浆液细胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-6、il-1β、il-18、il-10、ip-10)的变化。
[0068]
结果：感染后第三天的细胞因子变化(如图4所示)：与阴性对照组(5850
±
1096)相比，共感染组ifn-γ显著升高(10682
±
3088)，差异具有统计学意义(p《0.05)。但与单pr8感染组和单s2染组(10005
±
2557，10198
±
1900)相比，共感染组升高不显著，无统计学差异(p》0.05)。与阴性对照组相比，共感染组tnf-α显著升高(6696
±
1593)，差异具有统计学意义(p《0.05)。与单s2感染组(1473
±
1663)相比，共感染组升高显著，有统计学差异(p《0.05)。与阴性对照组(6665)相比，共感染组il-6显著升高(75891
±
1.525)，差异具有统计学意义(p《0.05)。与单pr8感染组和单s2感染组(95529
±
16934，44538
±
6522)相比，共感染组升高不显著，无统计学差异(p》0.05)。与阴性对照组(416.0
±
295.2)相比，共感染组il-1β显著
升高(731.6
±
126.1)，差异具有统计学意义(p《0.05)。但与单pr8感染组和单s2感染组(578.7
±
331.8，508.1
±
110.3)相比，共感染组升高不显著，无统计学差异(p》0.05)。与阴性对照组(5850
±
1096)相比，共感染组il-18显著升高(294715
±
124928)，差异具有统计学意义(p《0.05)。与单pr8感染组和单s2感染组(101425
±
16307，129342
±
55117)相比，共感染组升高显著，存在统计学差异(p》0.05)。与阴性对照组(1622
±
696.6)相比，共感染组il-10显著降低(767.2
±
95.15)，差异具有统计学意义(p《0.05)。与单pr8感染组和单s2感染组(2169
±
1358，1042
±
253.6)相比，共感染组也显著降低，存在统计学差异(p》0.05)。与阴性对照组(7635
±
1659)相比，共感染组ip-10显著降低(2775
±
179.1)，差异具有统计学意义(p《0.05)。与单pr8感染组和单s2感染组(5261
±
1980，4655
±
3554)相比，共感染组也显著降低，存在统计学差异(p》0.05)。
[0069]
2.8数据统计分析
[0070]
所有的数据统计后用graphpad prism 8.0.2软件作图分析，数据统计表示为平均值
±
标准差，各组之间采用单因素方差分析(anova)，动物存活率采用kaplan-meier survival analysis。显著性差异表示为*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001，****p《0.0001。
[0071]
通过实施例1可知，(1)与两个不致死模型(单独感染模型)相比，共感染组小鼠均于感染后第2天出现明显的体重减轻及呼吸道和全身症状，感染后第6天，共感染组小鼠出现反应迟缓、强迫腹式呼吸、后肢瘫痪等濒死状态，并与感染后7～9天出现集中死亡趋势，死亡率80-90％。(2)为探索疾病早期小鼠体内两种病原体之间的相互作用，于感染后第3天解剖小鼠取肺组织研磨均浆进行肺部细菌病毒载量测定。发现相对于单感染组，共感染组小鼠肺部的布鲁氏菌载量显著升高，差异具有统计学意义，提示甲型流感病毒的感染促进了布鲁氏菌的增殖和侵袭。但与之相反，与单感染组相比，共感染组流感病毒载量显著降低，差异具有统计学意义。提示布鲁氏菌的感染可能抑制流感的增殖和侵袭。结合小鼠的的临床表现，在共感染中细菌的大量增殖可能是导致共感染预后不良的主要因素。(3)在布鲁氏菌的急性感染阶段，巨噬细胞通过内吞作用大量捕获侵入的布鲁氏菌并通过溶酶体和活性氧作用清除大量被捕获的布鲁氏菌，但近期研究表明，布鲁氏菌、沙眼衣原体、冠状病毒等胞内寄生性病原体采用不同的策略参与宿主细胞自噬途径，甚至进化出了操纵自噬相关基因(autophagy related gene，atg)表达和功能的机制，以确保其胞内生命周期的完成。所以我们推测由于流感病毒的感染，导致肺泡巨噬细胞清除致病菌功能的受损，并上调了非经典途径的细胞自噬途径，这都可能是布鲁氏菌在共感染组中侵袭和增殖能力增强的潜在机制。考虑到巨噬细胞清除功能受损，结合共感染组小鼠严重的临床症状，考虑在共感染的早期就发生了强烈的过度免疫反应和炎症反应，这种过度的炎症免疫反应既不能有效的清除病原菌，还将导致机体的免疫性损伤。当免疫损伤累及肺组织，肺泡上皮细胞作为流感病毒的宿主，可能提前发生焦亡或坏死，因此病毒在肺泡上皮细胞内的复制受到影响，病毒载量低于单流感感染组。(4)为明确感染小鼠的免疫状态，寻找免疫失衡关键点，我们测定了小鼠肺组织中多种与病毒和细菌感染相关的代表性细胞因子。与单一感染相比，共感染小鼠tnf-α、il-18、ip-10和il-10的表达均存在显著差异，提示该类细胞因子或许使导致免疫状态失衡的关键因子。il-18r广泛表达于各种免疫细胞上，与il-18结合参与免疫细胞的激活和焦亡程序，其异常增高常常反映了免疫细胞的异常状态。提示共感染小鼠在疾病初期，即发生了大量的细胞组织坏死和剧烈的炎症反应，该结论与之前的临床症状和肺组织
病理高度吻合。(5)单独感染组ip-10显著升高，但共感染组小鼠ip-10升高幅度更加显著，提示共感染组小鼠募集了更多的免疫细胞。然而，虽然募集了更多的炎性细胞和免疫细胞，但这些细胞似乎并没能发挥正常的清除病原体作用，一个重要的证据就是il-10的变化。il-10是机体最重要的免疫调节因子，主要由活化的单核巨噬细胞和dc产生。我们发现，与空白组相比，单病毒组il-10升高显著，单细菌组变化无显著性。然而共感染组小鼠il-10显著降低，此前未有研究观察到此现象。但不可否认的是il-10如此明显的降低提示其在共感染中存在重要的致病机制。结合ip-10结果，提示虽然机体趋化到局部的巨噬细胞数量增加，但其免疫功能或已经受损，无法发挥正常的免疫清除功能。并且其影响可能更加深远，因为il-10不仅能负调控固有免疫反应，也能调控获得性免疫向th2方向倾斜，巨噬细胞功能受损很有可能也影响着获得性免疫的功能。
[0072]
实施例2
[0073]
1材料与方法
[0074]
1.1按照实施例1的方法构建共感染小鼠模型。
[0075]
1.2单细胞测序建库测序及数据分析部分由上海欧易生物医学科技有限公司完成。采用10x genomics官方软件cellranger对高通量测序产生的原始数据进行分析，随后使用seurat软件包在cellranger初步质控结果的基础上，对数据进行进一步质控和处理。利用基因表达量进行pca(主成分)线性降维分析，通过tsne(非线性降维)将pca结果在二维空间进行可视化。通过singler包基于单细胞参考表达定量公共数据集，将待鉴定的细胞表达谱与参考数据集计算相关性，把参考数据集中相关性较高的细胞类型赋予待鉴定细胞，一定程度摒除了人为主观因素的干扰。使用seurant包中的findallmarkers函数进行marker基因鉴定，找到每种细胞分类相对于其他细胞群差异基因上调表达的基因，这些基因就是每种细胞分类潜在的marker基因。通过vlnplot和featureplot函数对鉴定得到的marker基因进行可视化。使用seurat包中的findmarkers函数进行差异显著基因筛选，根据p值小于0.05以及差异倍数大于1.5倍的条件筛选出显著差异基因。
[0076]
2结果
[0077]
2.1中性粒细胞和巨噬细胞是布鲁氏菌-流感病毒共感染致病过程的主要参与细胞
[0078]
经过质量控制后，细胞数目为：s2 pr8组6518个、单s2组6348个、单pr8组7327个、pbs组7645个。经过降维聚类、差异表达基因分析及各类细胞在全肺细胞所占百分比分析显示：
[0079]
pbs组：单核细胞21.51％、中性粒细胞5.25％、巨噬细胞31.4％、dc4.02％、cd4 t细胞3.38％、b细胞2.38％、自然杀伤细胞(nk)1.49％、nkt细胞0.66％、血管内皮细胞(bec)26.47％、淋巴管内皮细胞(lec)0.63％、成纤维细胞14.39％、肺泡ⅱ型上皮细胞3.21％、无纤毛上皮细胞(clara)2.04％、神经胶质细胞(muller)0.49％。
[0080]
单s2组：单核细胞45.7％、中性粒细胞29％、巨噬细胞1.01％、dc 2.5％、cd4 t细胞2.04％、b细胞1.23％、nk0.49％、nkt细胞0.77％、bec5.91％、lec0.03％、成纤维细胞7.1％、肺泡ⅱ型上皮细胞1.43％、clara0.15％、muller0.06％。
[0081]
单pr8组：单核细胞38.18％、中性粒细胞12.44％、巨噬细胞10.34％、dc 6.13％、cd4 t细胞5.81％、b细胞1.41％、nk1.69％、nkt细胞1.32％、bec19.94％、lec0.12％、成纤
维细胞7.01％、肺泡ⅱ型上皮细胞6.87％、clara0.6％、muller0.54％。
[0082]
s2 pr8组：单核细胞32.98％、中性粒细胞40.1％、巨噬细胞0.6％、dc 2.74％、cd4 t细胞1.67％、b细胞1.15％、nk0.21％、nkt细胞0.52％、bec9.4％、lec0.03％、成纤维细胞7.27％、肺泡ⅱ型上皮细胞2.84％、clara0.34％、muller0.14％。
[0083]
与pbs组相比，这些显著变化细胞可能参与机体对布鲁氏菌和流感病毒抗感染的过程。与单s2组和单pr8组相比，可见共感染组中性粒细胞和巨噬细胞比例变化最显著：共感染组中性粒细胞显著升高，巨噬细胞显著降低。进而推测中性粒细胞和巨噬细胞是共感染急性肺损伤致死过程的主要参与细胞。
[0084]
2.2中性粒细胞亚群分析
[0085]
通过tsne分析，将参与其中的中性粒细胞分为3个cluster对各cluster在中性粒细胞中所占百分比进行统计分析，结果显示：
[0086]
pbs组：cluster c2占0.91％；cluster c7占2.44％；cluster c8占1.9％；
[0087]
pr8组：cluster c2占4.63％；cluster c7占4.5％；cluster c8占3.31％；
[0088]
s2组：cluster c2占12.95％；cluster c7占7.27％；cluster c8占8.78％；
[0089]
s2 pr8组：cluster c2占17.41％；cluster c7占11.54％；cluster c8占11.15％；
[0090]
可见pr8和s2的感染可导致中性粒细胞cluster c2、c7、c8均显著升高，提示中性粒细胞参与了pr8和s2的抗感染免疫和免疫致病机制。共感染组中性粒细胞各亚型占比几乎等于单感染之和，提示两种病原体对中性粒细胞的刺激产生的叠加效应，可能是共感染组病情加重的机制之一。
[0091]
通过拟时序分析，与pbs组相比，pr8组cluster c2多处于分化起点，c7处于分化点后，c8处于分化点附近；s2组趋势与pr8组相似。与pr8组相比共感染组增加了4个异常的分化点，clusterc2和c8处于这些异常分化点上，c7仍处于分化点后。提示s2的共感染可能使c2和c7异常分化为病理性亚型。与s2组相比共感染组没有产生异常分化点，提示pr8的共感染未导致中性粒细胞异常分化。
[0092]
进一步分析top10的差异表达基因：与pbs组相比，两个单感染组中ccl4和ngp均显著变化，且变化趋势相反，提示两者可能相互抑制。结合第一部分对免疫状态的分析，两单感染组小鼠后期病情均好转，提示该剂量攻毒后诱导了机体可自控可自愈的免疫反应，而非导致免疫失衡。中性粒细胞中这些基因的变化可能是可自控的。
[0093]
与两个单感染组相比，随着流感病毒的加入使得ifnd1、s100ag、s100a11显著变化；随着布鲁氏菌加入使得ccrl2、cs1dc5、camp显著变化；同时流感和布鲁氏菌均可使ccl3、cxcl2、ccl4、s100a6、s100a8、retnlg、ngp显著变化，且ccl3、cxcl2、ccl4变化趋势相同，s100a6、s100a8、retnlg、ngp变化趋势相似，但这两类基因变化趋势相反，符合单感染组变化趋势。结合第一部分对免疫状态的分析，共感染组小鼠后期多死亡，提示该剂量攻毒后，这些异常变化的基因可能参与共感染免疫失衡、中性粒细胞过度激活导致的免疫损伤和中性粒细胞的异常分化。
[0094]
结合实施例1中细胞因子结果，重点关注了变化最突出的il-18和tnf-α以及相关通路内关键因子的基因表达情况，以期推断在不同感染条件下，信号通路激活的异同。结果显示：
[0095]
pr8组的变化特点：caspase-1，4与tnf-α和il-18变化趋势相似，caspase-9与
gsdme变化趋势相似，提示可能在病毒感染后，机体启动的信号通路中caspase-1，4与tnf-α和il-18参与相同激活通路，caspase-9与gsdme参与相同激活通路。
[0096]
s2组的变化特点：il-18和il-1β、gsdmd趋势相似，tnf-α与caspase-4趋势相似，提示il-1β和gsdmd与il-18参与相同激活通路，caspase-4与tnf-α参与相同激活通路。
[0097]
s2 pr8组的变化特点：共感染组caspase-9与gsdme变化趋势相似，tnf-α与caspase-4变化趋势相似，这两者表现出了pr8组的特点。但gsdmd的变化趋势却维持了s2组的特点。这表明共感染中caspase-9与gsdme和tnf-α与caspase-4的表达具有流感病毒感染的特点，但gsdmd的变化与流感关系有待进一步确认。所以这两种病原体的感染不仅是简单的叠加作用，而且具有更深层次的免疫机制。随着布鲁氏菌的加入，共感染组tnf-α与caspase-4趋势相似，il-18与il-1β趋势相似，但gsdmd的变化趋势却失去了s2组的特点，进一步提示了在共感染时gsdmd的调控出现了不同于两个单感染组的额外变化，目前尚不知这种变化是否有利于机体抵抗病原体。
[0098]
综上，推测在小鼠肺部的中性粒细胞中caspase-9和gsdme与流感病毒感染密切相关，il-1β和il-18与布鲁氏菌感染密切相关，但gsdmd与流感病毒-布鲁氏菌共感染可能存在一定的关系。
[0099]
2.3巨噬细胞细胞亚群分析
[0100]
通过tsne分析，将参与其中的中性粒细胞分为5个cluster，对各cluster在中性粒细胞中所占百分比进行统计分析，结果显示：
[0101]
pbs组：cluster c4占22.63％；cluster c16占4.07％；cluster c19占2.84％；cluster c27占1.2％；cluster c29占0.66％；
[0102]
pr8组：cluster c4占6.24％；cluster c16占2.27％；cluster c19占1.33％；cluster c27占0.18％；cluster c29占0.32％；
[0103]
s2组：cluster c4占0.87％；cluster c16占0.08％；cluster c19占0.02％；cluster c27占0.02％；cluster c29占0.02％；
[0104]
s2 pr8组：cluster c4占0.48％；cluster c16占0％；cluster c19占0％；cluster c27占0％；cluster c29占0.12％；
[0105]
可见pr8和s2的感染可导致巨噬细胞cluster c4、c16、c19、c27、c29均显著降低，提示巨噬细胞可能参与了pr8和s2的抗感染免疫和免疫致病机制。相比pbs组，三个感染组巨噬细各亚型占比均显著降低，共感染组巨噬细胞占比最少，表明两种病原体均可导致巨噬细胞降低，两者共感染导致的巨噬细胞进一步降低可能是共感染组病情加重的机制之一。
[0106]
通过拟时序分析：与pbs组相比，pr8组和s2组巨噬细胞无异常分化点，仅有各亚型数量减少，其中s2组数量明显减少，但各细胞亚型仍能检测到。与pr8和s2组相比，共感染组巨噬细胞计数极低，仅c4和c29可以检测到。因此拟时序分析的作用较局限。
[0107]
进一步分析top10的差异表达基因：与pbs组相比，两个单感染组中histh1b、histh1h2ae、histh1h2ap、mki67、stmn1、hmgb2均显著变化，变化趋势相同，提示这些共同趋势的基因可能与巨噬细胞参与机体抗感染和细胞死亡模式有关。结合实施例1中对免疫状态的分析，两单感染组小鼠后期病情均好转，提示该剂量攻毒后诱导了机体可自控可自愈的免疫反应，而非导致免疫失衡。巨噬细胞中这些基因的变化可能是可自控的。
[0108]
与两个单感染组相比，流感病毒和布鲁氏菌均使hbb-bs显著变化，且在单感染组中未明显变化，提示该基因可能是共感染致病机制的关键基因。除hbb-bs外，流感病毒和布鲁氏菌也能分别促使其他9种不同基因发生显著变化。结合实施例1对免疫状态的分析，共感染组小鼠后期多死亡，提示该剂量攻毒后，该基因可能参与巨噬细胞大量减少导致的免疫失衡、巨噬细胞减少抗原提呈减少导致的特异性免疫反应缺陷，以及巨噬细胞大量病理性死亡导致的局部炎症和致死性免疫损伤。
[0109]
结合实施例1细胞因子结果，重点关注了变化最突出的il-18和tnf-α以及相关通路内关键因子的基因表达情况，以期推断在不同感染条件下，信号通路激活的异同。结果显示：
[0110]
pr8组的变化特点：tnf-α、caspase-4、gsdmd和il-1β变化趋势相似，il-18、caspase-9与gsdme变化趋势相似，提示可能在病毒感染后，机体启动的信号通路中tnf-α、caspase-4、gsdmd和il-1β参与相同激活通路，il-18、caspase-9与gsdme参与相同激活通路。
[0111]
s2组的变化特点：caspase-1，3、gsdmd、il-1β趋势相似，tnf-α、gsdme和il-18趋势相似。
[0112]
s2 pr8组的变化特点：随着流感病毒的加入，共感染组gsdmd、il-18、tnf-α变化趋势相似，il-1β与caspase-1变化趋势相似。流感感染的变化特点消失，但il-18、tnf-α的变化趋势维持了s2组的特点。这表明共感染中的巨噬细胞在这些基因表达不具有流感病毒感染的特点，同时pr8组和s2组均存在gsdme和il-18的相似关系，在共感染组也不复存在。这样复杂的变化说明这两种病原体的感染不仅是简单的叠加作用，而且具有更深层次的免疫机制。随着布鲁氏菌的加入，共感染组tnf-α与il-1β、gsdmd、caspase-1，3，4趋势相似，il-18与caspase-9趋势相似。有趣的是gsdmd的变化趋势表现出了类似pr8组的特点，进一步提示了在共感染时gsdmd的调控出现了不同于两个单感染组的额外变化，目前尚不知这种变化是否有利于机体抵抗病原体。
[0113]
综上，推测在小鼠肺部的巨噬细胞中tnf-α、caspase-4、gsdmd与流感病毒感染密切相关，caspase-1，3、gsdmd与布鲁氏菌感染密切相关，但gsdmd与布鲁氏菌-流感病毒共感染可能存在一定的关系。
[0114]
由实施例2可知，在采用了10
×
genomics单细胞转录组测序技术对布鲁氏菌-流感病毒共感染小鼠肺组织进行转录组分析后，发现在所有肺组织细胞中，中性粒细胞和巨噬细胞在共感染中变化最为显著。这或许是共感染小鼠肺炎重症化和死亡率升高的原因之一。
[0115]
通过结合实施例1的结果，我们定义单感染组为非致死性轻症肺炎模型，共感染组为可能致死的重症肺炎模型，并界定单感染组小鼠的各差异基因的表达处于可调控范围内，而共感染组处于异常不可调控范围。
[0116]
实施例3
[0117]
1材料和方法
[0118]
spf级4周龄nlrp6-/-敲除c57bl/6n小鼠，体重10-12g，购自赛业生物技术有限公司(cyagen)。
[0119]
表1 q-pcr引物：
[0120][0121]
其余材料和方法同实施例1。
[0122]
2结果
[0123]
2.1流感感染上调nlrp6介导的细胞焦亡是导致共感染小鼠死亡的重要原因
[0124]
细胞焦亡是由炎症小体参与的依赖炎性半胱氨酸酶(caspase)的一种新的细胞程序性死亡方式。焦亡细胞同时具有凋亡和坏死的细胞特征，主要表现为annexinv染色阳性，细胞核皱缩、细胞膜成孔，进一步导致细胞肿胀破裂、释放细胞内容物，分泌炎性细胞因子，引起炎性反应。因此细胞焦亡又称为细胞的炎性坏死。本实验前期发现：共感染导致的急性肺损伤小鼠肺部细胞因子表达谱中il-1β和il-18的显著升高，提示过度的细胞焦亡，可能是共感染的一个重要特点。nlrp6是近年来新发现的nlrs蛋白家族成员，且它是该蛋白家族中唯一被证实可以对机体产生负调控作用的蛋白，近年来成为研究的热点。nlrp6在病原体感染诱导宿主天然免疫应答中发挥重要作用。对于不同病原体甚至在不同器官或细胞中，nlrp6表现出了截然相反的功能。
[0125]
根据实施例2的单细胞测序的结果，认为gsdmd以及其相关分子可能在共感染致死的过程中发挥重要作用。gsdmd介导的细胞焦亡是近年来发现的一种重要的机体抗菌免疫防御机制，细胞焦亡发生时能够参与多种疾病的发生、发展。因此本实施例研究了nlrp6和gsdmd在共感染急性肺损伤中的作用。
[0126]
在本实施例中观察到在共感染wt小鼠中nlrp6充分上调，但单一感染模型中nlrp6只在有限的范围内上调。布鲁氏菌和流感病毒的感染均可一定程度上调nlrp6的表达，但共感染组nlrp6的升高幅度远远的高于单感染组，这让我们有理由相信，正是nlrp6以及相关分子的过度表达，是共感染导致小鼠死亡率升高的重要原因之一。随即我们测定了nlrp6的下游焦亡基因gasdermin和nlrp6炎性小体asc相关基因pycard，如图5所示，共感染组gasdermin和pycard相对于其他两个单感染组均显著升高，提示共感染组在感染早期即出现明显的细胞焦亡现象。
[0127]
2.2nlrp6-/-小鼠抵抗了布鲁氏菌的感染，但发生了无法控制的流感感染
[0128]
为进一步探索nlrp6的在肺部共感染中功能，我们构建了nlrp6-/-基因敲除小鼠的共感染模型，与wt小鼠相比，布鲁氏菌的增殖能力被显著抑制，nlrp6-/-小鼠几乎没有发生明显的细菌感染症状。然而，流感病毒在nlrp6-/-小鼠体内发生了大量增殖。在nlrp6-/-小鼠肺脏中，病毒增殖的趋势与wt小鼠上完全相反：wt和nlrp6-/-小鼠单感染组的病毒表达量几乎无异。这说明nlrp6的缺失并不影响早期病毒的增殖。但nlrp6-/-共感染组小鼠病毒载量显著升高，而wt小鼠共感染组病毒载量显著降低，说明共感染有效促进nlrp6表达升高，而nlrp6升高抑制了病毒在体内的复制，提示布鲁氏菌的感染或许可能通过一定程度上调nlrp6增强机体抗病毒免疫反应。结果如图6所示。
[0129]
肺部病理切片显示，共感染组和单布鲁氏菌组nlrp6-/-小鼠仅有轻微病变，然而单甲流感染组出现明显肺泡融合和组织浸润(如图7所示)。
[0130]
由实施例3可知，布鲁氏菌和甲型流感病毒在小鼠肺部共感染时，最终导致小鼠死亡的主要原因是共感染引起的免疫系统过度反应和免疫失衡，并非病原体的直接作用。
[0131]
在wt小鼠共感染模型中观察到，与两个单感染组相比，共感染组nlrp6显著上调，肺部细菌载量升高，但病毒载量却显著降低的。在敲除nlrp6后，共感染组细菌载量显著降低，而病毒载量显著升高。这说明机体可能在受到细菌病毒挑战后，通过上调nlrp6相关的免疫反应有效地控制了病毒感染但却无法控制布鲁氏菌感染。与此相对的，nlrp6表达量的降低使得细菌感染被有效控制，但无法控制病毒感染。因此nlrp6的过度升高或降低都将导致免疫系统失衡，使机体丧失针对入侵病原体的控制能力。
[0132]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。