一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法与应用

1.本发明涉及农作物种植技术领域，尤其涉及一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法与应用。


背景技术：

2.苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)苦瓜专化型寄生引起的土传病害，致病机理主要存在导管堵塞和毒素的作用。由于枯萎病病原菌具有寄主专化性，各分化型对不同瓜类作物的侵染力和致病力存在差异，部分瓜类专化型菌株还存在不同的生理小种，防治十分困难。目前生产上防治枯萎病的方法主要采用嫁接、土壤消毒、轮作等防治措施，但存在操作困难、投入成本高、防治效果不理想不彻底及环境污染等问题，利用品种抗性是最有效和环保的措施。因此，抗苦瓜枯萎病品种选育是解决这一产业瓶颈问题的重要途径之一。
3.抗病资源是抗病育种的前提和基础，客观、快速地筛选抗枯萎病种质是抗枯萎病育种过程中最重要的环节。枯萎病抗性鉴定主要通过人工病圃鉴定和苗期接种鉴定。然而传统的田间病圃筛选耗时长，成本高，过于依赖自然发病条件，如果环境条件不适合发病或者土壤菌落分布不均匀，容易造成抗性鉴定结果不准确。苦瓜苗期接种鉴定方法简便、迅速、容易操作，并且不受季节影响。目前，苦瓜上常用的抗性鉴定分级标准基本都是参考其他瓜类的分级标准，将子叶作为重要的分级标准，然而由于苦瓜种苗的特殊性，与其他瓜类最大的不同就是子叶不生长，后期会逐渐萎蔫黄化，这是造成苦瓜苗期鉴定结果与人工病圃鉴定存在显著差异的原因之一。因此探索一套适用于苦瓜枯萎病抗性鉴定的标准对于评价苦瓜种质的抗病性，培育抗病新品种具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法与应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法，包括如下步骤:
7.(1.1)将苦瓜幼苗伤根后，得到伤根的苦瓜幼苗，将所述伤根的苦瓜幼苗置于苦瓜枯萎病孢子悬浮液中，浸泡25～35min，得到侵染苦瓜枯萎病的幼苗；
8.(1.2)将所述侵染苦瓜枯萎病的幼苗接种于育苗基质中，进行培养，记录幼苗的病情等级和死亡株数，并计算幼苗的病情指数和死亡率，筛选病情指数《55且死亡率≤25％的幼苗对应的种质，得到抗苦瓜枯萎病的种质。
9.作为优选，所述苦瓜幼苗为两叶一心的苦瓜幼苗；
10.所述两叶一心的苦瓜幼苗的培养方法为：
11.(2.1)将苦瓜种子进行浸种，得到浸种的苦瓜种子；
12.(2.2)将所述浸种的苦瓜种子置于28～32℃条件下发芽，得到发芽的种子；
13.(2.3)将所述发芽的种子播种于育苗基质中，培养至两叶一心期，得到两叶一心的
苦瓜幼苗；
14.所述浸种的步骤为：将苦瓜种子在50～60℃水中浸泡10～15min，之后转入28～32℃水中浸泡8～10h。
15.作为优选，所述苦瓜幼苗伤根的方法为：清洗伤根；
16.所述清洗伤根为：用水清洗苦瓜幼苗的根部，至根部出现伤口或断裂。
17.作为优选，所述苦瓜枯萎病孢子悬浮液中的活孢子数为0.5～1.5
×
106个/ml。
18.作为优选，步骤(1.2)所述培养的温度为28～30℃。
19.作为优选，所述病情等级分为6级，分别为0级、1级、3级、5级、7级、9级；
20.所述0级为幼苗无病症；
21.所述1级为幼苗的对生真叶开始出现病症；
22.所述3级为幼苗1片对生真叶黄化，其余互生真叶正常；
23.所述5级为幼苗2片对生真叶黄化或其中1片对生真叶已经干枯，维管束开始变色；
24.所述7级为幼苗互生真叶开始黄化，维管束变浅褐色；
25.所述9级为幼苗全株叶片黄化萎蔫或枯死，维管束变褐色。
26.作为优选，所述病情指数的计算公式为：
27.病情指数＝100
×
∑(病情等级
×
幼苗株数)/(最高病情等级
×
幼苗总株数)。
28.作为优选，所述病情指数的分级为：
29.病情指数＝0为免疫；
30.0.01≤病情指数＜15.00为高抗；
31.15.00≤病情指数＜35.00为抗；
32.35.00≤病情指数＜55.00为中抗；
33.55.00≤病情指数＜75.00为感病；
34.病情指数≥75.00为高感。
35.作为优选，所述死亡率＝(死亡株数/总株数)
×
100％。
36.本发明还提供了所述的筛选方法在筛选抗苦瓜枯萎病种质中的应用。
37.本发明提供了一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法与应用。
38.利用本发明的方法可以筛选得到抗苦瓜枯萎病的种质，为苦瓜优良种质的筛选提供了依据。
39.利用本发明的方法从30份苦瓜中，筛选得到了1份高抗枯萎病的种质，6份抗枯萎病的种质，12份中抗枯萎病的种质，还筛选得到感病枯萎病的种质3份，高感枯萎病的种质8份。
附图说明
40.图1为苦瓜枯萎病苗期叶片症状分级。
41.图2为苦瓜枯萎病苗期维管束症状分级。
42.图3为苦瓜苗期枯萎病不同抗性种质资源苗期接种鉴定生长情况。
具体实施方式
43.本发明提供了一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法，包括如下步骤:
44.(1.1)将苦瓜幼苗伤根后，得到伤根的苦瓜幼苗，将所述伤根的苦瓜幼苗置于苦瓜枯萎病孢子悬浮液中，浸泡25～35min，得到侵染苦瓜枯萎病的幼苗；
45.(1.2)将所述侵染苦瓜枯萎病的幼苗接种于育苗基质中，进行培养，记录幼苗的病情等级和死亡株数，并计算幼苗的病情指数和死亡率，筛选病情指数《55且死亡率≤25％的幼苗对应的种质，得到抗苦瓜枯萎病的种质。
46.在本发明中，所述苦瓜幼苗为两叶一心的苦瓜幼苗；所述两叶一心的苦瓜幼苗的培养方法为：(2.1)将苦瓜种子进行浸种，得到浸种的苦瓜种子；(2.2)将所述浸种的苦瓜种子置于28～32℃条件下发芽，得到发芽的种子；(2.3)将所述发芽的种子播种于育苗基质中，培养至两叶一心期，得到两叶一心的苦瓜幼苗；所述浸种的步骤为：将苦瓜种子在50～60℃水中浸泡10～15min，之后转入28～32℃水中浸泡8～10h。在本发明中，步骤(2.2)中所述的温度优选为30℃。在本发明中，步骤(2.2)所述发芽在催芽箱中进行。
47.在本发明中，所述苦瓜幼苗伤根的方法为：清洗伤根；所述清洗伤根为：用水清洗苦瓜幼苗的根部，至根部出现伤口或断裂。
48.在本发明中，所述苦瓜枯萎病孢子悬浮液中的活孢子数为0.5～1.5
×
106个/ml，优选为1.0
×
106个/ml。在本发明中，所述苦瓜枯萎病孢子悬浮液的制备方法为：将苦瓜枯萎病菌株转接至pda平板培养基中，28℃活化5～7d，待菌丝长至培养皿的2/3时，挑取菌丝块接种于pdb培养基中，28℃，120rpm摇床中震荡培养7d，菌液用两层纱布过滤，滤去菌丝，滤液在4000rpm条件下离心20min，弃上清液，用无菌水溶解沉淀的孢子，制备成母液；用血球计数板计算母液中孢子的浓度，利用无菌水将其制备成0.5～1.5
×
106个/ml的悬浮液，得到苦瓜枯萎病孢子悬浮液。
49.在本发明中，步骤(1.2)所述培养的温度为28～30℃，优选为29℃。
50.在本发明中，所述病情等级分为6级，分别为0级、1级、3级、5级、7级、9级；
51.所述0级为幼苗无病症；
52.所述1级为幼苗的对生真叶开始出现病症；
53.所述3级为幼苗1片对生真叶黄化，其余互生真叶正常；
54.所述5级为幼苗2片对生真叶黄化或其中1片对生真叶已经干枯，维管束开始变色；
55.所述7级为幼苗互生真叶开始黄化，维管束变浅褐色；
56.所述9级为幼苗全株叶片黄化萎蔫或枯死，维管束变褐色。
57.在本发明中，所述病情指数的计算公式为：
58.病情指数＝100
×
∑(病情等级
×
幼苗株数)/(最高病情等级
×
幼苗总株数)。
59.作为优选，所述病情指数的分级为：
60.病情指数＝0为免疫(i)；
61.0.01≤病情指数＜15.00为高抗(hr)；
62.15.00≤病情指数＜35.00为抗(r)；
63.35.00≤病情指数＜55.00为中抗(mr)；
64.55.00≤病情指数＜75.00为感病(s)；
65.病情指数≥75.00为高感。
66.在本发明中，所述死亡率＝(死亡株数/总株数)
×
100％。
67.本发明还提供了所述的筛选方法在筛选抗苦瓜枯萎病种质中的应用。
68.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
69.在本发明实施例中所述的30份苦瓜种质来源如表1所示。
70.表1苦瓜种质与来源
[0071][0072][0073]
实施例1
[0074]
苦瓜种子浸种催芽：先用55℃的温水将苦瓜种子浸种15min，待水温降至30℃时，继续浸泡10h使其充分吸水膨胀，洗净后，用湿毛巾包好放置于30℃的催芽箱中催芽。
[0075]
播种、育苗：将发芽的种子播种于育苗基质内，做好苗期水肥管理，待苦瓜幼苗长至两叶一心期，采用浸根法接种苦瓜枯萎病。
[0076]
枯萎病菌孢子悬浮液的制备：将枯萎病菌株转至pda平板上于28℃活化6d，这时菌丝长至培养皿2/3，之后进行液体培养基震荡培养。挑小块菌丝块接种于150ml灭菌的pdb培养基中，在28℃恒温和120rpm的摇床中震荡培养7d，菌液用两层灭菌纱布滤去菌丝，滤液在4000rpm条件下离心20min，去上清液，用无菌水洗出沉淀的孢子制成母液。用血球计数板计算孢子液浓度，将母液用无菌水调到浓度为1
×
106个/ml的孢子悬浮液，得到枯萎病菌孢子悬浮液。
[0077]
病原菌侵染处理：将苦瓜幼苗小心从育苗基质里取出，并用流水清洗根系上育苗土，通过清洗达到自然伤根的目的。将清洗好的苦瓜幼苗每30株绑一扎，置于枯萎病菌孢子悬浮液中浸泡30min，保证所有根系全部淹没在枯萎病菌孢子悬浮液中。浸泡完成后，将苦瓜幼苗取出重新种植与装有灭菌育苗基质的穴盘中，放在温室大棚种培养，温度保持在28
℃。
[0078]
抗病性调查：接种后第10天和第15天分别进行一次接种调查，根据苦瓜枯萎病病情分级标准确定等级，记录死亡株数，再根据各发病等级株数计算病情指数和死苗率，综合评价苦瓜种质对枯萎病的抗性分级。
[0079]
苦瓜枯萎病病情等级的分级标准为如表2所示。
[0080]
表2苦瓜枯萎病病情等级的分级标准
[0081][0082][0083]
各级苦瓜幼苗叶片症状如图1所示，各级苦瓜幼苗维管束症状如图2所示。
[0084]
病情指数的计算公式为：病情指数＝100
×
∑(病情等级
×
幼苗株数)/(最高病情等级
×
幼苗总株数)。
[0085]
所述病情指数的分级为：
[0086]
病情指数＝0为免疫(i)；
[0087]
0.01≤病情指数＜15.00为高抗(hr)；
[0088]
15.00≤病情指数＜35.00为抗(r)；
[0089]
35.00≤病情指数＜55.00为中抗(mr)；
[0090]
55.00≤病情指数＜75.00为感病(s)；
[0091]
病情指数≥75.00为高感。
[0092]
死亡率＝(死亡株数/总株数)
×
100％。
[0093]
最终得到的病情指数以及死亡率如表3所示，苦瓜苗期枯萎病的不同抗性种质资源如图3所示。筛选病情指数《55且死亡率≤25％的幼苗对应的种质，得到抗苦瓜枯萎病的种质
[0094]
表3苦瓜枯萎病病菌对不同苦瓜种质的影响
[0095][0096][0097]
表3显示，30份苦瓜种质中，高抗枯萎病种质1份，抗枯萎病种质6份，中抗枯萎病种
质12份，感病枯萎病种质3份，高感枯萎病种质8份。
[0098]
实施例2
[0099]
将筛选得到的19份抗枯萎病的苦瓜种质种植于广西农业科学院蔬菜研究所科研基地中，每份材料种植30株。观察这19份苦瓜种质在田间对枯萎病的抗性情况。结果表明：2份表现为高抗，发病株数和死苗株数均为0；5份表现为抗病，发病株数分别为1、2、3、1、2，死苗株数全部为0；其余12份表现为中抗。
[0100]
由以上实施例可知，本发明提供了一种抗苦瓜枯萎病种质的筛选方法与应用。利用本发明的方法可以筛选得到具有抗苦瓜枯萎病的种质，为苦瓜优良种质的筛选提供了依据。本发明的方法从30份苦瓜中，筛选得到了1份高抗枯萎病的种质，6份抗枯萎病的种质，12份中抗枯萎病的种质，还筛选得到感病枯萎病的种质3份，高感枯萎病的种质8份。为苦瓜的种质创新和新品种选育提供了依据。
[0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。