作为STING调节剂的杂环化合物的制作方法

作为sting调节剂的杂环化合物
技术领域
1.本披露涉及用作sting调节剂的杂环化合物以及其衍生物。本披露还涉及合成方法以及此类化合物在治疗多种疾病(包括癌症)中的用途。


背景技术：

2.先天免疫系统专门针对不同危险信号进行快速作用。它通过产生可溶性生物活性分子(例如细胞因子或趋化因子)来提供针对细菌、病毒、寄生虫和其他传染性威胁的第一道防线。通过响应上述的这些损伤相关的分子模式(damp)或病原体相关的分子模式(pamp)，先天免疫系统能够提供保护，抵抗对宿主的广泛威胁。
3.最近已经证明，胞质dna的主要传感物是环状gmp-amp合酶(cgas)。cgas催化环状二核苷酸2
’‑3’‑
cgamp(与er跨膜衔接蛋白sting(干扰素基因的刺激因子)牢固结合的非典型第二信使)的生成。cgamp结合的sting经历构象变化，易位至核周区室，并诱导关键转录因子irf-3和nf-kb的激活。这导致i型干扰素的强烈诱导和促炎性细胞因子(例如il-6、tnf-α和ifn-γ)的产生。
4.i型干扰素和促炎性细胞因子可以通过增强树突状细胞和巨噬细胞摄取、加工、呈递和交叉呈递抗原至t细胞的能力，来强烈增强t细胞激活。可以诱导i型干扰素产生的化合物可在疫苗中用作佐剂，增强对抗原的特异性免疫反应。可以诱导干扰素产生的化合物在治疗人类癌症中具有潜在用途。
5.相比之下，发现在患有多种形式的自身免疫性疾病的患者中产生过量的i型干扰素。人类的遗传证据和来自动物模型研究的支持证实了该假设，即抑制sting导致i型干扰素的量减少(其是导致自身免疫性疾病的原因)(crow yj等人,nat,genet.[自然遗传学]2006,38,917-920；stetson db等人,cell[细胞]2008,134,587-598)。因此，sting的抑制剂为患有慢性i型干扰素、以及具有与感染或复杂自身免疫性疾病相关的促炎性细胞因子产生的患者提供治疗。结合sting的化合物可以充当拮抗剂，并且可以用于治疗例如自身免疫性疾病。
[0006]
设想用激活剂或抑制剂靶向sting可能是治疗疾病和病症(其中对i型ifn途径的调节是有益的，包括炎性、过敏性和自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症、癌症前期综合征)的有前途的方法，并且作为免疫原性组合物或疫苗佐剂。
[0007]
本发明的化合物调节sting的活性，因此可在治疗疾病、障碍和/或病症(其中sting的调节是有益的，例如对于炎症、过敏性和自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症、癌症前期综合征)中提供治疗效果，并且作为疫苗佐剂。


技术实现要素：

[0008]
本发明的一个目的是提供用作sting调节剂的化合物以及其衍生物。
[0009]
方面1：一种具有式(i)的化合物，
nrr’、-(och2ch2)
n1-nrr’或-o-(ch2och2)
n1-nrr’。
[0011]
方面3：根据方面2所述的化合物，其中r1、r2、r3、r6、r7和r8各自独立地选自由以下组成的组：氢或-c
1-8
烷基。
[0012]
方面4：根据方面1-3中任一项所述的化合物，其中r4是氢。
[0013]
方面5：根据方面1-4所述的化合物，其中r3和r8是氢。
[0014]
方面6：根据方面1-5中任一项所述的化合物，其中r1、r2、r6和r7各自独立地选自甲基或乙基。
[0015]
方面7：根据方面1-6中任一项所述的化合物，其中r1和r6各自是乙基；并且/或者r2和r7各自是甲基。
[0016]
方面8：根据方面1-7中任一项所述的化合物，其中r5选自-o-(ch2)
n1-nhr、或-(och2ch2)
n1-nhr；n1是2、3或4；r选自氢、ch3、-c(＝o)or9、或-c(＝o)-ch
2-or9；r9选自氢、nh2、或-c(ch3)3。
[0017]
方面9：根据方面8所述的化合物，其中r选自氢、-ch3、、或-c(＝o)oc(ch3)3。
[0018]
方面10：根据方面1-9中任一项所述的化合物，其中式(i)是
[0019]
方面11：根据方面10所述的化合物，其中式(ii)是
其中r选自ch3、
[0020]
方面12：根据方面1所述的化合物，其中该化合物是
或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药。
[0021]
在第二方面，本文披露的是一种药物组合物，该药物组合物包含本文披露的化合物、或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
[0022]
在第三方面，本文披露的是一种治疗可以受sting调节影响的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文披露的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药。
[0023]
该疾病选自炎症、过敏性和自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症、或癌症前期综合征。
[0024]
在第四方面，本文披露的是本文的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药在制备用于治疗可以受sting调节影响的疾病的药物中的用途。
[0025]
该疾病是炎症、过敏性和自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症、或癌症前期综合征。
具体实施方式
[0026]
以下术语在整个说明书中具有指示的含义：
[0027]
除非在本文件的其他地方具体定义，否则本发明中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
[0028]
以下术语在整个说明书中具有指示的含义：
[0029]
如本文使用的，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则例如“一个/一种(a/an)”和“该(the)”在内的词语的单数形式包括它们相应的复数指代物。
[0030]
除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
[0031]
术语“烷基”包括选自直链和支链的饱和烃基团的烃基团，该烃基团包含从1至18个，例如从1至12个，进一步例如从1至10个，更进一步例如从1至8个，或从1至6个，或从1至4个碳原子。包含从1至6个碳原子的烷基基团(即c
1-6
烷基)的实例包括但不限于：甲基、乙基、1-丙基或正丙基(“n-pr”)、2-丙基或异丙基(“i-pr”)、1-丁基或正丁基(“n-bu”)、2-甲基-1-丙基或异丁基(“i-bu”)、1-甲基丙基或仲丁基(“s-bu”)、1,1-二甲基乙基或叔丁基(“t-bu”)、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基基团。
[0032]
术语“丙基”包括1-丙基或正丙基(“n-pr”)、2-丙基或异丙基(“i-pr”)。
[0033]
术语“丁基”包括1-丁基或正丁基(“n-bu”)、2-甲基-1-丙基或异丁基(“i-bu”)、1-甲基丙基或仲丁基(“s-bu”)、1,1-二甲基乙基或叔丁基(“t-bu”)。
[0034]
术语“戊基”包括1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基。
[0035]
术语“己基”包括1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。
[0036]
术语“亚烷基”是指通过从烷烃中去除两个氢原子的二价烷基基团。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
[0037]
术语“卤素”包括氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。
[0038]
术语“烯基”包括选自直链和支链烃基团的烃基团，该烃基团包含至少一个c＝c双键和从2至18个，例如从2至8个，进一步例如从2至6个碳原子。烯基基团(例如c
2-6
烯基)的实例包括但不限于：乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基、和己-1,3-二烯基基团。
[0039]
术语“亚烯基”是指通过从烯烃中去除两个氢的二价烯基基团。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丁烯基等。
[0040]
术语“炔基”包括选自直链和支链烃基团的烃基团，该烃基团包含至少一个c≡c三键和从2至18个，例如从2至8个，进一步例如从2至6个碳原子。炔基基团(例如c
2-6
炔基)的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丁炔基、2-丁炔基、和3-丁炔基基团。
[0041]
术语“亚炔基”是指通过从炔烃中去除两个氢的二价炔基基团。亚烯基包括但不限于亚乙炔基等。
[0042]
术语“环烷基”包括选自饱和环状烃基团的烃基团，该烃基团包含单环和多环(例如二环和三环)基团(包括稠合的、桥接的或螺环烷基)。
[0043]
例如，环烷基基团可以包含从3至12个，例如从3至10个，进一步例如3至8个，进一步例如3至6个、3至5个或3至4个碳原子。甚至进一步例如，环烷基基团可以选自包含从3至12个，例如从3至10个，进一步例如3至8个、3至6个碳原子的单环基团。单环环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基和环十二烷基基团。特别地，饱和单环环烷基基团(例如c
3-8
环烷基)的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、和环辛基基团。在优选实施例中，环烷基是包含3至6个碳原子的单环(简写为c
3-6
环烷基)，包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、和环己基。二环环烷基基团的实例包括具有从7至12个环原子、具有稠合二环排列(选自[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]和[6,6]环系统)或具有桥接的二环排列(选自二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷、和二环[3.2.2]壬烷)的那些。二环环烷基基团的另外实例包括具有二环排列(选自[5,6]和[6,6]环系统)的那些。
[0044]
术语“螺环烷基”包括含有碳原子的环状结构，并且由至少两个共享一个原子的环形成。
[0045]
术语“稠合的环烷基”包括如本文所定义的二环环烷基基团，其是饱和的并且由两个或多个共享两个相邻原子的环形成。
[0046]
术语“桥接的环烷基”包括含有碳原子的环状结构，并且由两个共享两个彼此不相邻的原子的环形成。术语“7元至10元桥接的环烷基”包括含有7至12个碳原子的环状结构，并且由两个共享两个彼此不相邻的原子的环形成。
[0047]
稠合的环烷基、稠合的环烯基或稠合的环炔基的实例包括但不限于二环[1.1.0]丁基、二环[2.1.0]戊基、二环[3.1.0]己基、二环[4.1.0]庚基、二环[3.3.0]辛基、二环[4.2.0]辛基、萘烷以及苯并3元至8元环烷基、苯并c
4-6
环烯基、2,3-二氢-1h-茚基、1h-茚基、1,2,3,4-四氢萘基、1,4-二氢萘基等。优选的实施例是8元至9元稠合环，其是指上述实例中含有8至9个环原子的环状结构。
[0048]
单独使用或与其他术语组合使用的术语“芳基”包括选自以下的基团：(a)5元和6元碳环芳香族环，例如苯基；(b)二环系统(例如7元至12元二环系统)，其中至少一个环是碳环和芳香族的，例如萘基和茚满基；以及，(c)三环系统(例如10元至15元三环系统)，其中至少一个环是碳环和芳香族的，例如芴基。
[0049]
术语“芳香族烃环”和“芳基”在贯穿此文的披露内容中可互换使用。在一些实施例中，单环或二环芳香族烃环具有5至10个成环碳原子(即c
5-10
芳基)。单环或二环芳香族烃环的实例包括但不限于苯基、萘-1-基、萘-2-基、蒽基、菲基等。在一些实施例中，芳香族烃环是萘环(萘-1-基或萘-2-基)或苯基环。在一些实施例中，芳香族烃环是苯基环。
[0050]
具体地，术语“二环稠合芳基”包括如本文所定义的二环芳基环。典型的二环稠合芳基是萘。
[0051]
术语“杂芳基”包括选自以下的基团：(a)5元、6元或7元芳香族单环，其包含选自氮(n)、硫(s)、和氧(o)的至少一个杂原子(例如从1至4个、或在一些实施例中从1至3个、在一些实施例中从1至2个杂原子)，其中其余环原子是碳；(b)7元至12元二环，其包含选自n、o和s的至少一个杂原子(例如从1至4个、或在一些实施例中从1至3个、或在其他实施例中1或2个杂原子)，其中其余环原子是碳，并且其中至少一个环是芳香族的且至少一个杂原子存在于芳香族环中；以及(c)11元至14元三环，其包含选自n、o和s的至少一个杂原子(例如从1至4个、或在一些实施例中从1至3个、或在其他实施例中1或2个杂原子)，其中其余环原子是碳，并且其中至少一个环是芳香族的且至少一个杂原子存在于芳香族环中。
[0052]
当杂芳基基团中的s和o原子的总数超过1时，那些杂原子彼此不相邻。在一些实施例中，杂芳基基团中的s和o原子的总数不超过2。在一些实施例中，芳香族杂环中的s和o原子的总数不超过1。当杂芳基基团含有一个以上的杂原子环成员时，这些杂原子可以是相同的或不同的。杂芳基基团的一个或多个环中的氮原子可被氧化以形成n-氧化物。
[0053]
具体地，术语“二环稠合杂芳基”包括如本文所定义的7元至12元，优选地7元至10元，更优选地9元或10元稠合二环杂芳基环。典型地，二环稠合杂芳基是5元/5元、5元/6元、6元/6元、或6元/7元二环。基团可以通过任一环附接到分子的其余部分。
[0054]“杂环基”、“杂环”或“杂环的”是可互换的，并且包括非芳香族杂环基基团(其包含一个或多个选自氮、氧或任选地氧化的硫的杂原子作为环成员，其中其余环成员是碳)，包
括单环、稠合环、桥接环、和螺环，即含有单环杂环基、桥接杂环基、螺杂环基、和稠合杂环基团。
[0055]
本文披露的术语“至少一个取代基”包括例如从1至4个、例如从1至3个、进一步如1或2个取代基，条件是满足价理论。例如，本文披露的“至少一个取代基f”包括从1至4个、例如从1至3个、进一步如1或2个取代基f。
[0056]
术语“二价”是指能够与两个其他部分形成共价键的连接基团。例如，“二价环烷基基团”是指通过从相应环烷烃中去除两个氢以形成连接基团而获得的环烷基基团。应当以相似的方式理解术语“二价芳基基团”、“二价杂环基基团”或“二价杂芳基基团”。
[0057]
本文披露的化合物可以含有不对称中心，因此可以作为对映异构体存在。“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此不可重叠的镜像。当本文披露的化合物具有两个或更多个手性中心时，它们可以另外以非对映异构体存在。对映异构体和非对映异构体属于更广泛的立体异构体类别。旨在包括所有可能的立体异构体，例如基本上纯的拆分的对映异构体、其外消旋混合物以及非对映异构体的混合物。旨在包括所有本文披露的化合物和/或其药学上可接受的盐的立体异构体。除非另外具体说明，否则提及一种异构体适用于任何可能的异构体。每当未指定异构体的组成时，均包括所有可能的异构体。
[0058]
当本文披露的化合物含有烯烃双键时，除非另外说明，否则此类双键意在包括e和z几何异构体。
[0059]
当本文披露的化合物含有二取代的环系统时，在这种环系统上发现的取代基可以采用顺式和反式形成。顺式形成意指两个取代基均位于碳上2个取代基位置的上侧，而反式意指它们位于相对侧。例如，二取代的环系统可以是环己基环或环丁基环。
[0060]
将反应产物彼此分离和/或与起始材料分离可能是有利的。通过本领域的普通技术，将每个步骤或一系列步骤的所需产物分离和/或纯化(以下称为分离)至所需均匀度。典型地，此类分离涉及多相萃取、从溶剂或溶剂混合物中结晶、蒸馏、升华或色谱法。色谱法可以涉及许多方法，包括例如：反相和正相；尺寸排阻；离子交换；高、中、低压液相色谱方法和装置；小规模分析；模拟移动床(“smb”)和制备型薄层或厚层色谱，以及小规模薄层和快速色谱的技术。本领域技术人员可以选择并且应用最有可能实现所需分离的技术。
[0061]“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心但不是彼此的镜像的化合物的立体异构体。可根据它们的物理化学差异通过本领域技术人员公知的方法如色谱法和/或分级结晶将非对映异构体混合物分离成其单个非对映异构体。对映异构体可以如下分离：通过与适当的光学活性化合物(例如，手性助剂，如手性醇或莫舍酸氯化物(mosher's acid chlorid))反应将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，分离这些非对映异构体，并将单独的非对映异构体转化(例如，水解)成对应的纯对映异构体。还可以使用手性hplc柱分离对映异构体。
[0062]
单一立体异构体(例如基本上纯的对映异构体)可以通过使用如下方法拆分外消旋混合物而获得：使用光学活性拆分剂形成非对映异构体(eliel,e.和wilen,s.stereochemistry of organic compounds.[有机化合物的立体化学]new york:john wiley&sons,inc.[纽约：约翰威利父子出版公司],1994；lochmuller,c.h.等人“chromatographic resolution of enantiomers:selective review.[对映异构体的色谱拆分：选择性综述]”j.chromatogr.[色谱杂志],113(3)(1975):第283-302页)。本发明的手
性化合物的外消旋混合物可以通过任何合适的方法分离和分开，该方法包括：(1)与手性化合物形成离子型非对映异构体盐，并通过分级结晶或其他方法分离；(2)与手性衍生试剂形成非对映异构体化合物，分离这些非对映异构体并转化为纯立体异构体；以及(3)直接在手性条件下分离基本上纯的或富集的立体异构体。参见：wainer,irving w.编辑drug stereochemistry:analytical methods and pharmacology.[药物立体化学：分析方法和药理学]new york:marcel dekker,inc.[纽约：马塞尔德克尔公司],1993。
[0063]
本文披露的化合物中的一些可以存在氢的不同附接点，称为互变异构体。例如，包括羰基-ch2c(o)-基团(酮形式)的化合物可经历互变异构以形成羟基-ch＝c(oh)-基团(烯醇形式)。在适用的情况下，也旨在包括单独的酮和烯醇形式以及其混合物。
[0064]“前药”是指活性剂的衍生物，其需要在体内转化以将该活性剂释放。在一些实施例中，该转化是一种酶转化。前药时常是(尽管不是必需的)药理上无活性的，直到被转化为活性剂。
[0065]“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内合适用于与人和低等动物的组织接触，而没有不适当的毒性、刺激、过敏应答等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐可以在本文披露的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而分别制备，或通过使酸性基团与合适的碱反应而分别制备。该术语还包括本发明化合物的立体异构体(例如对映异构体和/或非对映异构体)、互变异构体和前药的盐。
[0066]
另外，如果以酸加成盐获得本文披露的化合物，则可以通过碱化酸式盐的溶液来获得游离碱。相反，如果产物是游离碱，则可以按照由碱化合物制备酸加成盐的常规程序，通过将游离碱溶解在合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液，来生产加成盐(例如药学上可接受的加成盐)。本领域技术人员将识别可以用于制备无毒的药学上可接受的加成盐而无需过度实验的多种合成方法。
[0067]
本文中的术语“施用(administration，administering)”和“治疗(treating，treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物的、治疗的、诊断的药剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还意指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞进行的细胞的体外和离体处理。本文中的术语“受试者”包括任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、和兔)，最优选人。
[0068]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响这种疾病、障碍或症状的治疗的活性成分(例如化合物)的量。术语“治疗有效量”可以随化合物，疾病，障碍，和/或疾病或障碍的症状，疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在一些实施例中，“治疗有效量”是本文披露的至少一种化合物和/或至少一种其立体异构体、互变异构体或前药、和/或至少一种其药学上可接受的盐如本文所定义的有效“治疗”受试者的疾病或障碍的量。在组合疗法的情况下，术语“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
[0069]
术语“疾病”是指任何疾病、不适、病、症状或适应症，并且可以与术语“障碍”或“病症”互换。
[0070]
在整个本说明书和随附权利要求书中，除非上下文另外要求，否则术语“包含(comprise)”以及例如“包含(comprises和comprising)”等变体旨在指定其后特征的存在，但不排除一个或多个其他特征的存在或添加。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有(containing)”或“包括(including)”来取代，或者有时用“具有(having)”取代。
[0071]
在整个本说明书和随附权利要求书中，术语“c
n-m”指示包括端点的范围，其中n和m是整数，并且指示碳的数目。实例包括c
1-8
、c
1-6
等。
[0072]
除非在本文件的其他地方具体定义，否则本发明中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
[0073]
通用合成
[0074]
本文披露的化合物(包括其盐)可以使用已知的有机合成技术制备并且可以根据众多可能的合成途径中的任何途径来合成。
[0075]
可以在有机合成领域的技术人员可以容易地选择的合适的溶剂中进行用于制备本文披露的化合物的反应。合适的溶剂可以在进行反应的温度(例如，范围从溶剂的沸腾温度的温度)下基本上不与起始材料、中间体或产物反应。给定反应可以在一种溶剂或多种溶剂的混合物中进行。
[0076]
适当的保护性基团的选择可以由本领域技术人员容易地确定。
[0077]
可以根据本领域中已知的任何适合的方法(例如，nmr、uv、hplc、lc-ms和tlc)监测反应。化合物可以通过多种方法(包括hplc和正相硅胶色谱法)纯化。
[0078]
将手性分析型hplc用于不同手性实例的保留时间分析，根据所用的柱、流动相和溶剂比例，将条件分为以下方法。
[0079]
方案i
[0080]
例如，具有式(i)的化合物可以如方案i所示形成。化合物(ii)可以用化合物(i)烷基化以给出化合物(iii)[即，式(i)]，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8如本文所述定义。
[0081]
方案ii
[0082]
例如，具有式(ii)的化合物可以如方案ii所示形成，其中r5如本文所述定义。可以将化合物(i)还原然后乙酰化以给出化合物(ii)；可以将化合物(ii)与丙二腈反应然后用碱性甲醇处理以给出化合物(iii)；可以将化合物(iii)与醛(iv)缩合以给出化合物(v)；可以将化合物(v)与pocl3反应以给出化合物(vi)；可以将化合物(vi)水解以给出化合物(vii)；可以将化合物(vii)脱氯以给出化合物(viii)。可以将化合物(ix)用化合物(x)取代以给出化合物(xi)；可以将化合物(xi)还原以给出化合物(xii)；可以将化合物(xii)酰化以给出化合物(xiii)；可以将化合物(xiii)皂化以给出化合物(xiv)；可以将化合物(xiv)偶联以给出化合物(xv)；可以将化合物(xv)脱保护以给出化合物(xvi)；可以将化合物(xvi)脱氨基以给出化合物(xvii)；可以将化合物(xvii)上的羟基基团转化为离去基团以给出化合物(xviii)；可以将化合物(xviii)与化合物(viii)反应以提供化合物(xiv)[即，式(ii)]。
[0083]
方案iii
[0084]
例如，具有式(ii)的化合物可以如方案iii所示形成，其中r5如本文所述定义。可以使用过渡金属催化反应，将化合物(i)与化合物(ii)偶联以给出化合物(iii)；可以使用过渡金属催化反应，将化合物(iii)与化合物(iv)偶联以给出化合物(v)；可以通过cadogan反应，将化合物(v)分子内芳基化以给出化合物(viii)。可以通过方案ii所示的方法获得化合物(xviii)，然后将其与化合物(viii)反应以给出化合物(xiv)[即，式(ii)]。
[0085]
缩写nmr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核磁共振dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲亚砜lc-ms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
液相色谱质谱仪hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
高效液相色谱法uv
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
紫外线pe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
石油醚ea
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酸乙酯boc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
叔丁氧基羰基dcm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二氯甲烷hatu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐dipea、diea
ꢀꢀꢀ
n,n-二异丙基乙胺dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n,n-二甲基甲酰胺
et
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙基ac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酰基thf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四氢呋喃bu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
丁基mtbe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甲基叔丁醚dppf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1,1
’‑
二茂铁二基-双(二苯基膦)ipa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
异丙醇tfa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三氟乙酸
[0086]
实例1-aa
[0087]
叔丁基(e)-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0088]
步骤1：1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-异硫氰酸羰基酯
[0089]
在氮气下，向1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸(12.7g，82.5mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(0.1ml)在二氯甲烷(150ml)中的溶液中滴加乙二酰氯(10.5g，82.5mmol)并且然后将混合物在0℃搅拌1h。将溶剂在真空下蒸发并且将粗品与二氯甲烷(50ml x 2)共蒸发两次。将粗材料溶解在无水丙酮(20ml)中，然后在0℃，滴加至kscn(8.0g，82.5mmol)在丙酮(100ml)中的溶液中。将混合物在0℃搅拌10min。添加另外的kscn(1.6g)并且将混合物搅拌20min。将己烷(100ml)添加至反应混合物中并且将双相混合物在真空中浓缩至体积的三分之一。将己烷添加(200ml)和浓缩的过程重复两次，然后添加己烷(200ml)并且通过过滤除去固体。将固体用己烷(50ml)冲洗。将合并的滤液浓缩并且将残余物通过柱色谱法(pe/etoac＝6/1)纯化以给出标题化合物(10.0g，62％)。
[0090]
步骤2：甲基(e)-6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)氨基)-5-硝基烟酸酯
[0091]
将甲基6-氯-5-硝基烟酸酯(2.4g，11mmol)、叔丁基(e)-(4-氨基丁-2-烯-1-基)氨基甲酸酯(2.06g，11mmol)和n,n-二异丙基乙胺(2.84g，22mmol)在乙醇(60ml)中的溶液在55℃搅拌2h。将混合物冷却至室温并在减压下浓缩。将残余物溶解在乙酸乙酯(150ml)中，依次用水(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(pe/etoac＝5/1)纯化以给出标题化合物(3.3g，82％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.06(s,1h),8.90(d,j＝1.8hz,1h),8.74(d,j＝2.0hz,1h),6.96(s,1h),5.72-5.51(m,2h),4.22(s,2h),3.85(s,3h),3.51(s,2h),1.35(s,9h)。lc-ms(m h)

＝367.1。
[0092]
步骤3：甲基(e)-5-氨基-6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)氨基)烟酸酯
[0093]
在0℃，向甲基(e)-6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)氨基)-5-硝基烟酸酯(3.3g，9.0mmol)在甲醇(60ml)中的溶液中添加氨水(25％，1ml)和na2s2o4(15.7g，90mmol)在水(60ml)中的溶液并且将混合物在室温下搅拌4h。将混合物用水(200ml)稀释并且用乙酸乙酯(150ml x 4)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩以给出标题化合物(1.8g，59％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.02(s,1h),7.15(s,1h),6.97(s,1h),6.49(s,1h),5.63-5.57(m,2h),4.99(s,2h),4.02(s,2h),3.74(s,3h),3.53(s,2h),1.36(s,9h)。lc-ms(m h)

＝337.2。
[0094]
步骤4：甲基(e)-3-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸酯
[0095]
经20min的时间段，向甲基(e)-5-氨基-6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)氨基)烟酸酯(1.8g，5.34mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中缓慢滴加1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-异硫氰酸羰基酯(937mg，4.81mmol)在1,4-二噁烷(10ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌15min，然后添加n-(3-二甲基氨基丙基)-n
’‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(1.54g，8.01mmol)和三乙胺(1.35g，13.35mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入水中并且用乙酸乙酯(100ml x 4)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(dcm/meoh＝150/1至80/1，含有0.1％氨水)纯化以
给出标题化合物(940mg，35％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.93(s,1h),8.81(s,1h),8.17(s,1h),6.94(s,1h),6.71(s,1h),5.76-5.64(m,2h),4.79(s,2h),4.60(d,j＝6.9hz,2h),3.90(s,3h),3.50(s,2h),2.19(s,3h),1.43-1.28(m,12h)。lc-ms(m h)

＝498.2。
[0096]
步骤5：(e)-3-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸
[0097]
向甲基(e)-3-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸酯(760mg，1.53mmol)在甲醇(30ml)中的溶液中添加naoh(122mg，3.07mmol)在水(3ml)中的溶液并且将混合物在70℃搅拌过夜。将混合物用hcl(1n)中和至ph 7并且然后浓缩。将残余物溶解在甲醇(10ml)中并且将固体滤出。将滤液浓缩以给出标题化合物(700mg，94％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.25(s,1h),12.92(s,1h),8.79(s,1h),8.17(s,1h),6.95(s,1h),6.71(s,1h),5.73-5.64(m,2h),4.79(s,2h),4.60(d,j＝7.0hz,2h),3.50(s,2h),2.19(s,3h),1.43-1.10(m,12h)。lc-ms(m h)

＝484.2。
[0098]
步骤6：叔丁基(e)-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)氨基甲酸酯
[0099]
将(e)-3-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸(700mg，1.45mmol)、hatu(581mg，1.53mmol)、nh4cl(409mg，7.65mmol)和dipea(395mg，3.06mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(8ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入水(80ml)中并且用乙酸乙酯(80ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩以给出标题化合物(560mg，76％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.90(s,1h),8.76(s,1h),8.16(d,j＝12.6hz,2h),7.56(s,1h),6.94(s,1h),6.70(s,1h),5.77-5.64(m,2h),4.79(s,2h),4.61(d,j＝6.0hz,2h),3.51(s,2h),2.19(s,3h),1.44-1.18(m,12h)。lc-ms(m h)

＝483.2。
[0100]
步骤7：(e)-3-(4-氨基丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺盐酸盐
[0101]
向叔丁基(e)-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)氨基甲酸酯(560mg，1.16mmol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中添加在1,4-二噁烷中的hcl溶液(3ml，4m)并且将混合物在室温下搅拌2h。将沉淀物通过过滤收集并在真空下干燥以给出标题化合物(440mg，91％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.77(s,1h),8.21
ꢀ‑
8.16(m,2h),7.90(s,3h),7.58(s,1h),6.73(s,1h),6.05(s,1h),5.68(s,1h),4.86(s,2h),4.60(d,j＝7.4hz,2h),3.43(s,2h),2.19(s,3h),1.38
ꢀ‑
1.36(m,3h)。lc-ms(m h)

＝383.2。
[0102]
步骤8：(e)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3-(4-羟基丁-2-烯-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺
[0103]
向(e)-3-(4-氨基丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺盐酸盐(440mg，1.05mmol)在水(5ml)中的悬浮液中添加kbr(276mg，2.32mmol)和nano2(160mg，2.32mmol)并且将混合物在70℃搅拌2h。冷却至室温后，将沉淀物通过过滤收集并且干燥以给出标题化合物(400mg，99％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.75(s,1h),8.16(s,2h),7.52(s,1h),6.69(s,1h),5.82
ꢀ‑
5.75(m,2h),4.81(s,2h),4.61(s,2h),3.90(s,1h),3.39(s,2h),2.18(s,3h),1.35(s,3h)。lc-ms(m h)

＝384.2。
[0104]
步骤9：(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺
[0105]
向(e)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3-(4-羟基丁-2-烯-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺(400mg，1.04mmol)在thf(30ml)中的溶液中添加pbr3在二氯甲烷(4ml，1m)中的溶液并且将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物浓缩并且将残余物用
nahco3水溶液(1g在50ml水中)处理。通过过滤收集固体并且用乙酸乙酯(50ml)萃取滤液。将有机层与固体合并，在真空下浓缩并且通过柱色谱法(dcm/meoh＝50/1至20/1)纯化以给出标题化合物(190mg，41％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.92(s,1h),8.75(s,1h),8.16(d,j＝14.9hz,2h),7.55(s,1h),6.73(s,1h),6.05(s,1h),5.90(d,j＝6.8hz,1h),4.85(s,2h),4.60(d,j＝6.5hz,2h),4.13(d,j＝7.2hz,2h),2.18(s,3h),1.36(s,3h)。lc-ms(m h)

＝446.1,448.1。
[0106]
步骤10：1-乙基-3-甲基-1h-吡唑和1-乙基-5-甲基-1h-吡唑
[0107]
向3-甲基-1h-吡唑(50g，609mmol)在dmf(300ml)中的溶液中分批添加nah(60％，26.8g，670mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min。向混合物中添加eti(105g，673mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用水(1000ml)稀释，用etoac(800ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(1000ml x 3)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩以给出呈混合物的标题化合物(62g，93％)。lc-ms(m h)

＝111.1。
[0108]
步骤11：(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)硼酸
[0109]
在-78℃，向1-乙基-3-甲基-1h-吡唑和1-乙基-5-甲基-1h-吡唑(3.5g，31.5mmol)的混合物在thf(50ml)中的溶液中滴加n-buli(2.5m，4.0ml，10mmol)。将混合物在-78℃搅拌1h。向混合物中添加硼酸三异丙酯(1.9g，10mmol)。将混合物在-78℃搅拌1h，然后加温至室温，用饱和nh4cl溶液(10ml)稀释，然后用thf(30ml x 2)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物用mtbe(50ml)研磨。通过过滤收集固体并且在真空下干燥以给出标题化合物(0.7g，14％)。lc-ms(m h)

＝155.1。
[0110]
步骤12：3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺
[0111]
将甲基3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酸酯(5.0g，18mmol)在氢氧化铵(25％，100ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤收集固体，用水(50ml)洗涤并且在真空下干燥以给出标题化合物(4.0g，84％)。lc-ms(m h)

＝262.9,264.9。
[0112]
步骤13：叔丁基(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0113]
向叔丁基(3-羟基丙基)(甲基)氨基甲酸酯(7.0g，37mmol)在thf(150ml)中的溶液中分批添加nah(60％，2.8g，70mmol)。将混合物在室温下搅拌30min。向混合物中添加3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺(8.0g，30.4mmol)。将混合物在60℃搅拌1h。将混合物冷却至室温，然后用水(100ml)稀释，用etoac(100ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(pe/etoac＝1/1)纯化以给出标题化合物(12g，92％)。lc-ms(m h)

＝432.1。
[0114]
步骤14：叔丁基(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0115]
向叔丁基(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯(12g，27.8mmol)和(2-氯嘧啶-5-基)硼酸(4.8g，30.3mmol)在二噁烷(200ml)和水(40ml)中的混合物中添加k2co3(7.7g，55.7mmol)和pd(dppf)cl2(700mg，0.96mmol)。将混合物在80℃在n2下搅拌2h。将混合物冷却至室温并且在etoac(300ml)和水(200ml)之间分配。将有机层分离，用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(pe/etoac＝1/1)纯化以给出标题化合物(4.5g，34％)。lc-ms(m h)

＝466.1。
[0116]
步骤15：叔丁基(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0117]
向叔丁基(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯(4.5g，9.7mmol)和(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)硼酸(1.5g，9.7mmol)在二噁烷(50ml)和水(10ml)中的混合物中添加k2co3(4.0g，29mmol)和pd(dppf)cl2(350mg，0.5mmol)。将混合物在90℃在n2下搅拌2h。将混合物冷却至室温，用水(30ml)稀释，然后用etoac(30ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(30ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac)纯化以给出标题化合物(4.5g，86％)。lc-ms(m h)

＝540.2。
[0118]
步骤16：叔丁基(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0119]
向叔丁基(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯(4.5g，8.3mmol)在1,2-二氯苯(40ml)中的混合物中添加1,2-双(二苯基膦基)乙烷(6.3g，16mmol)。将混合物在160℃在n2下搅拌8h。将混合物冷却至室温并且倒入石油醚(250ml)中，通过过滤收集固体并且通过硅胶柱色谱法(dcm/meoh＝15/1)纯化以给出标题化合物(700mg，16％)。lc-ms(m h)

＝508.3。
[0120]
步骤17：叔丁基(e)-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯
[0121]
在70℃，将叔丁基(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯(11mg，0.02mmol)、(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺(12mg，0.024mmol)和k2co3(6mg，0.04mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(0.5ml)中的混合物搅拌2h。将溶剂蒸发并且将残余物通过制备型tlc(dcm/meoh＝10/1，含有0.1％氨水)纯化以给出实例1-aa(6mg，34％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ9.32(s,1h),8.67(s,1h),8.32(s,1h),8.13(s,1h),7.58(s,1h),6.84(s,1h),6.36(s,1h),6.06(s,1h),5.75(s,1h),5.41(s,2h),4.81(s,2h),4.70(s,2h),4.47(s,2h),4.08(s,2h),2.79(s,3h),2.27(s,3h),2.09(s,3h),1.92(s,2h),1.40(s,9h),1.27(d,j＝14.4hz,6h)。lc-ms(m h)

＝873.4。
[0122]
实例1-ab
[0123]
(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(3-(甲基氨基)丙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0124]
向叔丁基(e)-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸酯(6mg，0.007mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中添加在1,4-二噁烷中的hcl溶液(4m，0.5ml)并且将混合物搅拌2h。将混合物浓缩并且将残余物通过制备型hplc纯化以给出实例1-ab(1.0mg，18％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ9.32(s,1h),8.57(s,1h),8.31(s,1h),8.11(s,1h),7.52(s,1h),6.84(s,1h),6.36(s,1h),6.01-5.89(m,1h),5.81-5.72(m,1h),5.40-5.25(m,2h),4.83-4.69(m,4h),4.52-4.42(m,2h),4.10-4.01(m,2h),2.89-2.79(m,2h),2.58(s,3h),2.27(s,3h),2.12(s,3h),2.02-1.89(m,2h),1.46-1.36(m,3h),1.31-1.20(m,3h)。lc-ms(m h)

＝773.7。
[0125]
实例2-aa
[0126]
叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0127]
步骤1：叔丁基4-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0128]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从叔丁基4-(3-羟基丙基)哌嗪-1-甲酸酯和3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺制备标题化合物(10.0g，60％)。lc-ms(m h)

＝487.1。
[0129]
步骤2：叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0130]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基4-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯和(2-氯嘧啶-5-基)硼酸制备标题化合物(3.0g，28％)。lc-ms(m h)

＝521.2。
[0131]
步骤3：叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0132]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯和(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)硼酸制备标题化合物(2.3g，65％)。lc-ms(m h)

＝595.3。
[0133]
步骤4：叔丁基4-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0134]
以与实例1-aa步骤16中类似的方式，从叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯和1,2-双(二苯基膦基)乙烷制备标题化合物(500mg，23％)。lc-ms(m h)

＝563.3。
[0135]
步骤5：叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯
[0136]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基4-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡
啶-6-甲酰胺制备实例2-aa(280mg，34％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ9.21(s,1h),8.65(s,1h),8.23(s,1h),8.10(s,1h),7.51(s,1h),6.75(s,1h),6.31(s,1h),6.04(d,j＝14.5hz,1h),5.68(d,j＝15.0hz,1h),5.31(s,2h),4.75(s,2h),4.66-4.64(m,2h),4.46-4.44(m,2h),4.09(s,2h),3.49(s,4h),2.69-2.61(m,6h),2.22(s,3h),2.06(s,3h),1.97(s,2h),1.47(s,9h),1.35(s,3h),1.24(s,3h)。lc-ms(m h)

＝928.5。
[0137]
实例2-ab-hcl
[0138]
(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺盐酸盐
[0139]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸酯制备实例2-ab-hcl(200mg，77％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ9.59(s,1h),8.76(s,1h),8.45(s,1h),8.21(s,1h),7.74(s,1h),7.06(s,1h),6.64(s,1h),6.21(d,j＝15.1hz,1h),5.69(d,j＝15.1hz,1h),5.52-5.45(m,2h),4.90(2h under water peak),4.72-4.62(m,4h),4.36-4.30(m,2h),4.00-3.49(m,10h),2.45-2.34(m,5h),2.27(s,3h),1.48-1.35(m,6h)。lc-ms(m h)

＝828.5。
[0140]
实例1-ac
[0141]
(e)-8-(3-(2-(氨基氧基)-n-甲基乙酰胺基)丙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0142]
步骤1：叔丁基(e)-(2-((3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸酯
[0143]
向(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(3-(甲基氨基)丙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺(90mg，0.116mmol)、2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(33mg，0.175mmol)和diea(30mg，0.233mmol)在dmf(5ml)中的混合物中添加hatu(66mg，0.175mmol)。将混合物在室温下搅拌5h。将混合物用水稀释，用dcm/ipa(3/1，60ml x 2)萃取，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物用etoac研磨以给出标题化合物(60mg，55％)。lc-ms(m h)

＝946。
[0144]
步骤2：(e)-8-(3-(2-(氨基氧基)-n-甲基乙酰胺基)丙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0145]
向叔丁基(e)-(2-((3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸酯(60mg，0.0635mmol)在dcm/meoh(8ml/4ml)中的混合物中添加4m hcl在二噁烷(2.0ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物浓缩至干燥并且将残余物通过制备型hplc纯化以给出实例1-ac(18mg，33％)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ9.26(s,1h),8.65(s,1h),8.30-8.23(m,1h),8.11(s,1h),7.55-7.47(m,1h),6.83-6.76(m,1h),6.40-6.31(m,1h),6.06(d,j＝15.6hz,1h),5.78-5.55(m,1h),5.41-5.35(m,2h),4.82-4.58(m,4h),4.52-4.39(m,2h),4.36-4.30(m,2h),4.16-3.96(m,2h),3.45-3.32(m,2h),2.88(s,3h),2.25(s,3h),2.15-1.84(m,5h),1.39(t,j＝6.8hz,3h),1.23(t,j＝6.8hz,3h)。lc-ms(m h)

＝846.5。
[0146]
实例2-ac
[0147]
(e)-8-(3-(4-(2-(氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)丙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0148]
步骤1：叔丁基(e)-(2-(4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸酯
[0149]
向(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺盐酸盐(80mg，0.1mmol)、2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸(29mg，0.15mmol)和diea(52mg，0.4mmol)在dmf(5ml)中的混合物中添加hatu(57mg，0.15mmol)。将混合物在室温下搅拌15h。将混合物用水稀释，用dcm/ipa(3/1，60ml x 2)萃取，经na2so4干燥，过滤并浓缩。将残余物用ea/pe研磨以给出标题化合物(90mg，90％)。lc-ms(m h)

＝1001。
[0150]
步骤2：(e)-8-(3-(4-(2-(氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)丙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0151]
向叔丁基(e)-(2-(4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸酯(90mg，0.09mmol)在dcm/meoh(8ml/4ml)中的混合物中添加4m hcl在二噁烷
(2.0ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，浓缩至干燥并且将残余物通过制备型hplc纯化以给出实例2-ac(20mg，25％)。δ1h nmr(400mhz,cd3od)δ9.31(s,1h),8.68(s,1h),8.29(s,1h),8.14(s,1h),7.55(s,1h),6.83(s,1h),6.34(s,1h),6.10-5.95(m,1h),5.80-5.65(m,1h),5.40-5.32(m,2h),4.82-4.65(m,4h),4.62-4.35(m,4h),4.16-4.04(m,2h),3.65-3.52(m,2h),3.48-3.37(m,2h),2.55-2.32(m,6h),2.26(s,3h),2.08(s,3h),1.95-1.80(m,2h),1.45-1.20(m,6h)。lc-ms(m h)

＝901.5。
[0152]
实例3-aa
[0153]
叔丁基(e)-(4-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0154]
步骤1：叔丁基(4-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0155]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从叔丁基n-(4-羟基丁基)-n-甲基氨基甲酸酯和3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺制备标题化合物(4.56g，68％)。lc-ms(m-boc h)

＝348.0。
[0156]
步骤2：叔丁基(4-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0157]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基4-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丁基(甲基)氨基甲酸酯和(2-氯嘧啶-5-基)硼酸制备标题化合物(388mg，28％)。lc-ms(m-boc h)

＝380.1。
[0158]
步骤3：叔丁基(4-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0159]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基4-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丁基(甲基)氨基甲酸酯和(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)硼酸制备标题化合物(194mg，43％)。lc-ms(m h)

＝554.4。
[0160]
步骤4：叔丁基(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0161]
以与实例1-aa步骤16中类似的方式，从叔丁基(4-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯和1,2-双(二苯基膦基)乙烷制备标题化合物(100mg，6％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)12.69(s,1h),9.51(s,1h),8.42(s,1h),8.04(s,1h),7.64(s,1h),7.35(s,1h),6.80(s,1h),4.85-4.75(m,2h),4.31-4.24(m,2h),3.32-3.25(m,2h),2.80(s,3h),2.23(s,3h),1.88-1.71(m,4h),1.43-1.31(m,12h)。lc-ms(m h)

＝522.4。
[0162]
步骤5：叔丁基(e)-(4-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯
[0163]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺制备实例3-aa(120mg，68％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.84(s,1h),9.46(s,1h),8.66(d,j＝1.9hz,1h),8.41(d,j＝1.3hz,1h),8.13(s,1h),8.09(d,j＝1.8hz,1h),8.03(s,1h),7.59(s,1h),7.53(s,1h),7.38(s,1h),6.77(d,j＝0.4hz,1h),6.40(s,1h),5.99-5.93(m,1h),5.74(s,1h),5.25(s,2h),4.70(d,j＝5.5hz,2h),4.60(q,j＝
7.1hz,2h),4.45(q,j＝7.3hz,2h),4.09(t,j＝6.1hz,2h),3.07(t,j＝6.6hz,2h),2.69(s,3h),2.21-2.14(m,3h),2.05(s,3h),1.60-1.50(m,4h),1.32-1.29(m,9h),1.25(t,j＝7.1hz,4h),1.20(t,j＝7.1hz,3h)。lc-ms(m h)

＝887.6。
[0164]
实例3-ab-hcl
[0165]
(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(4-(甲基氨基)丁氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺盐酸盐
[0166]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-(4-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丁基)(甲基)氨基甲酸酯制备实例3-ab-hcl(80mg，78％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.48(s,1h),8.71(s,1h),8.54(s,2h),8.45(s,1h),8.21-8.01(m,3h),7.64-7.56(m,2h),7.42(s,1h),6.79(s,1h),6.40(s,1h),5.04-5.94(m,1h),5.75-5.65(m,1h),5.31-5.22(m,2h),4.77-4.70(m,2h),4.65-4.55(m,2h),4.49-4.39(m,2h),4.18-4.08(m,2h),2.89-2.79(m,2h),2.19(s,3h),2.10-1.98(m,5h),1.76-1.67(m,5h),1.28-1.16(m,6h)。lc-ms(m h)

＝787.5。
[0167]
实例4-aa
[0168]
叔丁基(e)-3-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0169]
步骤1：叔丁基3-(2-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0170]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺和叔丁基3-(2-羟乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备标题化合物(6.88g，91％)。lc-ms(m-boc h)

＝343.9。
[0171]
步骤2：叔丁基3-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0172]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基3-(2-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和2-氯嘧啶-5-基硼酸制备标题化合物(556mg，28％)。lc-ms(m-boc h)

＝378.1。
[0173]
步骤3：叔丁基3-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0174]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基3-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基硼酸制备标题化合物(230mg，36％)。lc-ms(m h)

＝552.3。
[0175]
步骤4：叔丁基3-(2-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0176]
以与实例1-aa步骤16中类似的方式，从叔丁基3-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备标题化合物(101mg，6％)。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ12.67(s,1h),9.52(s,1h),8.43(s,1h),8.04(s,1h),7.64(s,1h),7.36(s,1h),6.82(s,1h),4.88-4.75(m,2h),4.31-4.21(m,2h),4.04-3.93(m,2h),3.72-3.61(m,2h),3.00-2.85(m,1h),2.24(s,3h),2.20-2.05(m,2h),1.44-1.33(m,12h)。lc-ms(m h)

＝520.3。
[0177]
步骤5：叔丁基(e)-3-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0178]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基3-(2-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺制备实例4-aa(100mg，56％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.84(s,1h),9.47(s,1h),8.66(d,j＝1.9hz,1h),8.41(d,j＝1.3hz,1h),8.12(s,1h),8.09(d,j＝1.9hz,1h),8.02(s,1h),7.59(d,j＝1.2hz,1h),7.53(s,1h),7.39(s,1h),6.77(d,j＝0.5hz,1h),6.41(s,1h),6.03-5.92(m,1h),5.73-5.68(m,1h),5.24(d,j＝4.7hz,2h),4.72(d,j＝5.3hz,2h),4.60(q,j＝6.8hz,2h),4.51-4.43(m,2h),4.04(t,j＝6.3hz,2h),3.85(s,2h),3.45(s,2h),2.18(s,3h),2.05(s,3h),1.91-1.89(m,2h),1.34(s,9h),1.27-1.19(m,7h)。lc-ms(m h)

＝885.6。
[0179]
实例4-ab：(e)-8-(2-(氮杂环丁烷-3-基)乙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0180]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-3-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备实例4-ab(40mg，46％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.49(s,1h),8.57(s,1h),8.43(s,1h),8.30(s,1h),8.08-8.03(m,3h),7.56(s,1h),7.48-4.35(m,2h),6.84(s,1h),6.35(s,1h),5.90-5.80(m,2h),5.28-5.17(m,2h),4.81-4.63(m,4h),4.50-4.40(m,2h),4.05-3.91(m,4h),3.61-3.50(m,2h),2.81-2.74(m,1h),2.22(s,3h),2.06(s,3h),1.93(s,2h),1.36-1.29(m,3h),1.22-1.15(m,3h)。lc-ms(m h)

＝785.7。
[0181]
实例5-aa：叔丁基(e)-3-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0182]
步骤1：叔丁基3-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0183]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺和叔丁基3-(3-羟基丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备标题化合物(2.82g，96％)。lc-ms(m-boc h)

＝358.1。
[0184]
步骤2：叔丁基3-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0185]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基3-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和2-氯嘧啶-5-基硼酸制备标题化合物(174mg，92％)。lc-ms(m-boc h)

＝392.0。
[0186]
步骤3：叔丁基3-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0187]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基3-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基硼酸制备标题化合物(171mg，86％)。lc-ms(m h)

＝566.3。
[0188]
步骤4：叔丁基3-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧
啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0189]
以与实例1-aa步骤16中类似的方式，从叔丁基3-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备标题化合物(99mg，7％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.71(s,1h),9.53(s,1h),8.42(s,1h),8.04(s,1h),7.63(s,1h),7.35(s,1h),6.81(s,1h),4.88-4.75(m,2h),4.29-4.19(m,2h),4.01-3.90(m,2h),3.59-3.49(m,2h),2.66-2.56(m,1h),2.24(s,3h),1.88-1.80(m,4h),1.44-1.33(m,12h)。lc-ms(m h)

＝534.3。
[0190]
步骤5：叔丁基(e)-3-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯
[0191]
以与实例aa步骤17中类似的方式，从叔丁基3-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺制备实例5-aa(140mg，77％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.84(s,1h),9.46(s,1h),8.66(s,1h),8.40(s,1h),8.13(s,1h),8.09(s,1h),8.03(s,1h),7.58(s,1h),7.54(s,1h),7.38(s,1h),6.77(s,1h),6.40(s,1h),5.93(s,1h),5.70(s,1h),5.25(s,2h),4.70(s,2h),4.61(s,2h),4.45(s,2h),4.03(s,2h),3.82(s,2h),2.31(s,2h),2.18(s,3h),2.05(s,3h),1.55(s,4h),1.32(s,9h),1.28-1.18(m,7h)。lc-ms(m h)

＝899.7。
[0192]
实例5-ab：(e)-8-(3-(氮杂环丁烷-3-基)丙氧基)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0193]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-3-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)氮杂环丁烷-1-甲酸酯制备实例5-ab(45mg，36％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),8.65(s,1h),8.44(s,1h),8.33(s,1h),8.17(s,1h),8.10(s,1h),8.05(s,1h),7.59(s,1h),7.50(s,1h),7.40(s,1h),6.82(s,1h),6.36(s,1h),5.87(d,j＝13.5hz,1h),5.69(d,j＝15.9hz,1h),5.25(s,2h),4.76-4.62(m,4h),4.50-4.40(m,2h),4.05-3.96(m,2h),3.93-3.89(m,2h),3.53-3.45(m,2h),2.68-2.61(m,1h),2.21(s,3h),2.06(s,3h),1.59-1.55(m,4h),1.35-1.29(m,3h),1.21-1.15(m,3h)。lc-ms(m h)

＝799.7。
[0194]
实例6-aa：叔丁基(e)-4-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0195]
步骤1：叔丁基4-(2-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0196]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺和叔丁基4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸酯制备标题化合物(5.61g，63％)。lc-ms(m-boc h)

＝372.0。
[0197]
步骤2：叔丁基4-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0198]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基4-(2-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯和2-氯嘧啶-5-基硼酸制备标题化合物(331mg，90％)。lc-ms(m-boc h)

＝406.2。
[0199]
步骤3：叔丁基4-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0200]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基4-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯和1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基硼酸制备标题化合物(196mg，52％)。lc-ms(m h)

＝580.3。
[0201]
步骤4：叔丁基4-(2-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0202]
以与实例1-aa步骤16中类似的方式，从叔丁基4-(2-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯制备标题化合物(110mg，6％)。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ12.67(s,1h),9.50(s,1h),8.40(s,1h),8.02(s,1h),7.63(s,1h),7.34(s,1h),6.79(s,1h),4.85-4.72(m,2h),4.33-4.23(m,2h),4.00-3.89(m,2h),2.75-2.69(m,2h),2.22(s,3h),1.91-1.67(m,5h),1.47-1.31(m,12h),1.18-1.00(m,2h)。lc-ms(m h)

＝548.3。
[0203]
步骤5：叔丁基(e)-4-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
[0204]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基4-(2-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺制备实例6-aa(140mg，71％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.85(s,1h),9.48(s,1h),8.65(d,j＝1.8hz,1h),8.41(d,j＝1.2hz,1h),8.13(s,1h),8.09(d,j＝1.8hz,1h),8.02(s,1h),7.59(s,1h),7.53(s,1h),7.39(s,1h),6.78(d,j＝0.5hz,1h),6.40(s,1h),6.00-5.96(m,1h),5.73-5.70(m,1h),5.25(s,2h),4.72(s,2h),4.62(d,j＝7.2hz,2h),4.45(d,j＝6.9hz,2h),4.11-4.04(m,2h),3.86(s,2h),2.65(s,2h),2.18(s,3h),2.05(s,3h),1.52(s,4h),1.37(s,9h),1.27-1.17(m,9h)。lc-ms(m h)

＝913.6。
[0205]
实例6-ab：(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0206]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-4-(2-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸酯制备实例6-ab(90mg，79％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.49(s,1h),8.61(s,1h),8.42(s,1h),8.09-8.04(m,3h),7.60(s,1h),7.47(s,1h),7.40(s,1h),6.82(s,1h),6.37(s,1h),6.00-5.75(m,2h),5.32-5.22(m,2h),4.78-4.62(m,4h),4.53-4.42(m,2h),4.17-4.07(m,2h),3.11-2.99(m,2h),2.65-2.55(m,2h),2.21(s,3h),2.06(s,3h),1.70-1.50(m,4h),1.37-1.01(m,9h)。lc-ms(m h)

＝813.5。
[0207]
实例7-aa：叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0208]
步骤1：叔丁基4-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0209]
以与实例1-aa步骤13中类似的方式，从3-溴-5-氟-4-硝基苯甲酰胺和叔丁基4-(3-羟基丙基)哌啶-1-甲酸酯制备标题化合物(7.56g，83％)。lc-ms(m-boc h)

＝385.9。
[0210]
步骤2：叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0211]
以与实例1-aa步骤14中类似的方式，从叔丁基4-(3-(3-溴-5-氨基甲酰基-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯和2-氯嘧啶-5-基硼酸制备标题化合物(358mg，37％)。lc-ms(m-boc h)

＝420.1。
[0212]
步骤3：叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0213]
以与实例1-aa步骤15中类似的方式，从叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-氯嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯和1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基硼酸制备标题化合物(195mg，48％)。lc-ms(m h)

＝594.4。
[0214]
步骤4：叔丁基4-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0215][0216]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基4-(3-(5-氨基甲酰基-3-(2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)嘧啶-5-基)-2-硝基苯氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯制备标题化合物(97mg，5％)。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ12.68(s,1h),9.52(s,1h),8.42(s,1h),8.04(s,1h),7.63(s,1h),7.35(s,1h),6.81(s,1h),4.87-4.74(m,2h),4.30-4.20(m,2h),4.00-3.90(m,2h),2.83-2.63(m,2h),2.24(s,3h),1.91-1.83(m,2h),1.77-1.65(m,2h),1.57-1.47(m,3h),1.45-1.34(m,12h),1.09-0.99(m,2h)。lc-ms(m h)

＝562.3。
[0217]
步骤5：叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲
基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯
[0218][0219]
以与实例1-aa步骤17中类似的方式，从叔丁基4-(3-((6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯和(e)-3-(4-溴丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酰胺制备实例7-aa(110mg，59％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.86(s,1h),9.47(s,1h),8.66(s,1h),8.40(s,1h),8.14(s,1h),8.10(s,1h),8.02(s,1h),7.55(s,2h),7.38(s,1h),6.79(s,1h),6.39(s,1h),5.94(s,1h),5.72(s,1h),5.24(s,2h),4.70(s,2h),4.65(s,2h),4.45(s,2h),3.98(s,2h),3.83(s,2h),2.53(s,2h),2.18(s,3h),2.04(s,3h),1.60-1.44(m,4h),1.36(s,9h),1.30-1.21(dd,j＝30.9,4.6hz,8h),0.86(s,3h)。lc-ms(m h)

＝927.7。
[0220]
实例7-ab：(e)-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-8-(3-(哌啶-4-基)丙氧基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-6-甲酰胺
[0221]
以与实例1-ab中类似的方式，从叔丁基(e)-4-(3-((6-氨基甲酰基-9-(4-(6-氨基甲酰基-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)丁-2-烯-1-基)-2-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-8-基)氧基)丙基)哌啶-1-甲酸酯制备实例7-ab(45mg，49％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),8.66
(s,1h),8.43(s,1h),8.33(s,1h),8.17(s,1h),8.11(s,1h),8.05(s,1h),7.58(s,1h),7.51(s,1h),7.39(s,1h),6.83(s,1h),6.39(s,1h),5.93(d,j＝15.3hz,1h),5.77(d,j＝15.5hz,1h),5.29-5.22(m,2h),4.75-4.65(m,4h),4.50-4.42(m 2h),4.06-4.00(m,2h),3.20-3.12(m,2h),2.75-2.64(m,2h),2.22(s,3h),2.07(s,3h),1.62-1.59(m,4h),1.47-1.01(m,11h)。lc-ms(m h)

＝827.7。
[0222]
生物学活性
[0223]
在thp1-dual
tm
细胞中的sting细胞测定
[0224]
材料
[0225]
thp1-dual
tm
细胞通过两种诱导型报道构建体的稳定整合而衍生自人thp-1单核细胞细胞系。thp1-dual
tm
细胞的特征是在isg54(干扰素刺激基因)最小启动子联合五个干扰素(ifn)刺激的应答元件的控制下的lucia萤光素酶基因(一种新型的分泌型萤光素酶报道基因)。thp1-dual
tm
细胞还表达由ifn-β最小启动子驱动的分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)报道基因，该启动子与五个拷贝的nf-κb共有转录应答元件和三个拷贝的c-rel结合位点融合。结果，thp1-dual
tm
细胞允许通过监测seap的活性进行的nf-κb途径和通过评估lucia萤光素酶的活性进行的干扰素调节因子(irf)途径的同时研究。当使用quanti-blue
tm
(seap检测试剂)和quanti-luc
tm
(lucia萤光素酶检测试剂)时，两种报道蛋白均易于在细胞培养上清液中测量。
[0226]
已经鉴定出影响cdn识别和信号转导的人sting(hsting)的不同变体：
·
r232(r71-g230-r232-r293)：在人群中最普遍(约60％)。称为“野生型”或232r-rgr等位基因2。
·
haq(h71-a230-r232-q293)：含有三个非同义的单核苷酸取代；r71h、g230a和r293q。此等位基因(在约20％的人群中发现)对cdn的敏感性不如“野生型”等位基因2。
[0227]
细胞维持
[0228]
生长培养基：rpmi 1640、2mm l-谷氨酰胺、25mm hepes、10％热灭活胎牛血清(在56℃下30min)、100μg/ml normocin
tm
、pen-strep(100u/ml-100μg/ml)1.回收细胞(至少传代一次后)以后，在生长培养基中维持细胞并传代培养。(为维持选择压力，每隔一次传代将10μg/ml杀稻瘟素和100μg/ml zeocin
tm
添加至生长培养基中。)2.每3天通过接种7x105个细胞/ml使细胞传代。不允许细胞浓度超过2x106个细胞/ml。
[0229]
实验程序1.在平底96孔板(costar 3599)的每孔中添加180μl细胞悬液(约100,000个细胞)。2.然后以0.1％dmso/生长培养基中1nm-10μm的最终浓度范围、经10点连续稀释来添加化合物。3.在37℃、5％co2下，孵育板24h。4.使用以下参数设置bmg pherastar fsx仪器：注射50μl，终点测量，起始时间为4秒，且读数时间为0.1秒。5.将每孔10μl thp1-dual
tm
细胞培养基吸移至96孔白色不透明板(corning3903)
中。6.向每个孔中添加50μl quanti-luc测定溶液，并轻轻敲打板数次以进行混合。立即进行测量。
[0230]
表1.本文披露的化合物的细胞活性ec
50
(nm)
[0231]
应理解，如果本文引用任何现有技术出版物；这样的引用并不构成承认出版物形成任何国家的本领域公知常识的一部分。
[0232]
在此通过确认引用而引用的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容均通过引用以其整体并入本文。
[0233]
虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细地描述了前述
发明，本领域普通技术人员将清楚的是，可以实施某些微小修改或修饰。因此，说明和实例不应当被解释为限制本发明的范围。