一种抑制稻粒黑粉病菌的杀菌剂剂量筛选方法

1.本发明涉及杀菌剂抑菌检测领域，具体涉及一种抑制稻粒黑粉病菌的杀菌 剂剂量筛选方法。


背景技术：

2.水稻稻粒黑粉病(rice kernel smut,rks)是由黑粉病菌(tilletia barclayana) 引起的一种水稻上的重要真菌性病害，会产生大量黑色粉状冬孢子而影响水稻 种子的产量和品质，在亚州、美洲和非洲水稻种植区广泛发生。一般病粒率达 10％～15％，严重时达70％～80％以上，产量损失达10％～20％，甚至达50％ 以上，现已成为水稻种植区的主要病害之一。
3.目前，主要通过化学杀菌剂来实现稻粒黑粉病的防治，如市面上广泛使用 的化学防治药剂：30％苯醚甲
·
丙环唑(爱苗)、10％苯醚
·
甲环唑(世高)和嘧 菌酯
·
丙环唑等。
4.公知的，在明确化学药剂的防治效果之前，首先需完成抑菌活性的研究， 而对峙培养法是检测供试杀菌剂与病原菌是否存在拮抗作用的一种方法。基于 操作方法的不同，对峙培养法可分为菌饼法、菌液法、划线法和滤纸片法4 种形式，这4种形式在真菌和细菌杀菌剂的筛选上广泛适用。然而，由于稻粒 黑粉病菌的菌落较小，呈凸起状分散排布，且各个菌株的菌落形态和大小不一 样(见图2)，且如图3所示，稻粒黑粉菌的菌落会随杀菌剂浓度的增加，呈 现菌落变小，数量变多的趋势，无法准确测量直径或统计菌落数量，因此，很 难用以上4种形式开展测试，需积极寻找或创造新的对峙试验方法，从而筛选 出稳定性强、抑菌效果明显的杀菌剂，明确杀菌剂抑菌浓度ec
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，从而实现 减量化学防治的目标，促进农业可持续发展。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种抑制稻粒黑粉病菌的杀菌剂剂量筛选 方法，可以明确杀菌剂的最低剂量。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.一种抑制稻粒黑粉病菌的杀菌剂剂量筛选方法，该方法采用菌落鲜重法进 行抑菌率测定，从而筛选出杀菌剂的有效抑菌浓度，其中：
8.抑菌率(％)＝(对照菌落鲜重－处理菌落鲜重)/对照菌落鲜重
×
100。
9.进一步地，以稻粒黑粉病菌的次生小孢子作为接种物，采用菌落鲜重法测 定杀菌剂对稻粒黑粉病菌的抑制效果，最终确定其ec
50
值。
10.进一步地，以稻粒黑粉病菌的次生小孢子作为接种物，采用菌落鲜重法测 定25％丙环唑乳油对稻粒黑粉病菌的抑制效果，确定其ec
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值，从而明确25％ 丙环唑乳油的最低剂量。
11.上述方案中，采用菌落鲜重法实现了杀菌剂对稻粒黑粉病菌的抑制效果的 测定，从而可以确定各杀菌剂的ec
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值，明确各杀菌剂的最低剂量，使得杀 菌剂用量减少，适合稻
粒黑粉菌杀菌剂室内筛选的推广运用。
附图说明
12.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它 特征、目的和优点将会变得更明显：
13.图1为稻粒黑粉病菌次生担孢子形成过程(
×
400)；
14.图中：a冬孢子萌发产生菌丝和担子；b箭头所示由担子产生初生担孢子； c初生孢子萌发产生的次生担孢子；d次生担孢子形成新的菌丝。
15.图2为不同稻粒黑粉病菌株单孢形成菌落形态。
16.图3为稻粒黑粉病菌株对杀菌剂的敏感性。
17.图4为杀菌剂对稻粒黑粉病菌初筛结果。
18.图5为不同杀菌剂浓度对各菌株的抑制情况。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域 的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是， 对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
20.1、菌株的分离与纯化
21.将不同地方采集到的稻粒黑粉病谷粒，在超净工作台中用70％酒精消毒， 再用5％的次氯酸钠溶液消毒，然后用无菌水漂洗3次，用镊子剖开颖壳刀， 夹取少量黑粉菌冬孢子(厚垣孢子)至于装有无菌水的ep管中，制成冬孢子 悬液。
22.吸取50ml冬孢子悬液，滴在pda培养皿中间，用接种棒涂抹均匀。12h 左右，可见冬孢子开始萌发，产生菌丝和担子(图1a)，担子上会产生初生 担孢子(图1b)，接种2d后，初生担孢子分散出去，形成次生孢子(图1c)， 再由次生孢子形成新的菌丝(图1d)，接种14d后，在培养皿表面看到菌落 形成(图2)，分离得到不同稻粒黑粉病菌株ar-22、la-9、ms-2、ms-25 和ms-27。如图2所示，菌落呈圆形或不规则状，中部凸起，密集状散布排列， 部分菌落有白色菌丝覆盖或有色素沉积。
23.2、稻粒黑粉病菌株对杀菌剂的敏感性测试
24.将供试药剂：25％丙环唑乳油(敌力脱，先正达(中国)投资有限公司)作 为杀菌剂，加入灭菌后冷却至约45℃的pda培养基中混匀制成含药平板，使 其杀菌剂浓度分别为1μg/ml和5μg/ml。以供试菌株la-9进行敏感性测试。 将菌株la-9从pda上刮下，用无菌水制成悬液，经两层纱布过滤后，收集 孢子悬液。吸取100μl次生孢子悬液均匀涂布在含药平板上，7d后观察菌落 形态。如图4所示，稻粒黑粉菌的菌落会随着杀菌剂浓度的增加，呈现菌落变 小，数量变多的趋势，说明稻粒黑粉病菌株对25％丙环唑乳油敏感。
25.3、杀菌剂抑菌浓度初筛
26.为测试杀菌剂的有效抑菌率，将杀菌剂浓度分别配置成为5μg/ml、50μg /ml、100μg/ml和200μg/ml，以供试菌株la-9和ms-2进行抑菌性测试， 在显微镜下用血球计数板统计la-9和ms-2菌悬液中次生孢子的数量，按照 105孢子/ml为标准制成次生孢子悬液，以无菌
水平板作为对照，吸取100ul 次生孢子悬液均匀涂布在含药平板上，7d后观察菌落形态。图5所示，杀菌 剂浓度在5～50μg/ml直接能完全抑制菌株的生长繁殖，说明杀菌剂室内鉴定 完全抑菌浓度《50μg/ml。
27.4、杀菌剂对不同菌株的抑菌效果
28.将杀菌剂按照一定浓度加入到冷却至约45℃的pda培养基中混匀制成 含药平板，使其杀菌剂浓度分别为0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml 和50μg/ml。将各分离菌株的次生孢子悬液调剂为105孢子/ml的浓度，吸取 100ul悬液均匀分布在含药平板上。以加100μl无菌水的平板为对照。每个 平板有3个重复。
29.平板在28℃、12h荧光灯～12h黑暗下交替培养。培养7天后，拿出平板， 用盖玻片轻轻挂下培养皿上的菌落，放在称量纸上，分别测定每个培养皿中菌 落鲜重。利用不同浓度下的菌落鲜重绘制回归方程，计算ec
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(抑制率为50％ 所需杀菌剂有效浓度)的值。
30.结果显示，稻粒黑粉病各菌株对25％丙环唑敏感性有明显差异(图5)， 菌株la-9毒力较强，ms-25对丙环唑最敏感。表1所示，以定量的次生孢子 形成的菌落鲜重代替抑菌圈直径，进行抑菌率测定，求得ec
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值。25％丙环 唑对五种菌株分离物的抑菌范围从《0.2到19.45μg/ml。菌株la-9的ec
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为 19.45μg/ml，菌株ar-22、ms-2和ms-27的ec
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均《5μg/ml，敏感菌株 ms-25的ec
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《0.2μg/ml。说明菌落鲜重法更能反应杀菌剂对稻粒黑粉病菌 的抑菌率，25％丙环唑对稻粒黑粉病有较好的抑菌效果，有待于进一步田间试 验进行研究。
31.表1丙环唑对不同菌株的毒力测定
32.33.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限 于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形 或修改，这并不影响本发明的实质内容。