一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法

1.本发明涉及灰霉病菌遗传操作技术领域，具体涉及一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法。


背景技术：

2.灰霉病菌是一种破坏性强、适应性广且普遍存在的死体营养型病原菌，自然条件下可侵染超过200多种果蔬类产品，造成农业作物的大规模减产。目前，农业生产上灰霉病无法根治，对于灰霉病的预防，也仍主要采用各类化学品类杀菌剂。初期这类杀菌剂的防效突出，但随着杀菌剂的大量施用，在造成各类严重环境问题的同时，更为严重的是也诱导了抗性灰霉菌株的产生。因此，针对灰霉病菌难以治理的瓶颈，亟需深入研究病原菌的致病机制，从分子水平上筛选灰霉病菌的致病靶标因子，对于实现抗性作物育种与绿色防治策略的开发都具有重要的科学意义和应用价值。
3.灰霉病菌是一种典型的丝状真菌。关于丝状真菌分子层面的遗传操作，包括基因沉默、基因敲除、基因转入等主要采用携带目标质粒的农杆菌侵染实现。而所常选择的受体目标菌受体常为分生孢子与原生质体两类。分生孢子作为真菌的繁殖体结构具有着较厚的细胞壁结构，使得农杆菌在侵染时难度加大，从而造成遗传转化的阳性率低，实验耗费大；而后者原生质体虽然细胞壁薄，农杆菌较易实现侵染，但真菌原生质体的制备获得过程却极为繁琐，得率也极低，且转化后期也容易出现坏死不生长的现象。目前，灰霉病菌的遗传操作主要采用原生质体，效果低下周期极长。


技术实现要素：

4.本发明提供一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，通过将分生孢子经液体培养，产生细胞壁更为薄弱的液生孢子，从而使农杆菌的侵染效率极大提高，降低了遗传转化的操作难度，极大提高了遗传转化效率。
5.一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，包括下列步骤：灰霉菌株分生孢子的制备：从自然感病番茄果实上分离菌株，纯化培养后，采取ctab法提取基因组dna，然后采用its引物进行扩增，测序后于ncbi网站进行数据比对后，为botrytis cinerea b05.10菌株，再次转接菌株于新的培养基中，培养7-10天至产孢，获得分生孢子；引物序列为：its1：tccgtaggtgaacctgcgg；its4：tcctccgcttattgatatgc；bcste12基因质粒载体构建：将获得的灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除，采用pzp-hph-knock质粒为骨架，通过酶切连接，构建bcste12基因敲除的质粒载体pzp-hph-bcste12-knock；侵染菌液的制备：将质粒载体pzp-hph-bcste12-knock转入到agl1农杆菌菌株中，在验证单克隆正确的情况下进行扩大培养，吸取500ul体积的培养的agl1农杆菌菌液，加入到含200μm浓度as及100μm浓度mes的im液体培养基中，同时添加3μl体积的silwetl-77，于常规条件下摇床培养8h左右，作为侵染菌液待用；
液生孢子的制备：将获得的分生孢子与新鲜配制灭菌的吐温80溶液混合，制备分生孢子悬浮液，并用血球计数板计数，配制成相应浓度，接种1ml菌液于100ml液体pdb溶液中，于28℃恒温摇床中培养8-12小时，用1ml移液枪汲取摇床培养后的菌液，然后枪头覆盖灭菌过滤纸，作为菌丝过滤装置，过滤去除菌丝，将菌液推入到2ml离心管中，收集孢子液，收集完毕后真空干燥并浓缩液体，并用纯水重新调整孢子液浓度，获得液生孢子；诱导共培养：将侵染菌液和液生孢子进行等体积混合，并进行涡旋混匀，于室温下进行诱导30min，获得混合液，然后取100ul的混合液涂布于平铺硝酸纤维素膜的co-im固体培养基上，并于27℃倒置培养48h；转膜：将诱导共培养步骤中培养完成的硝酸纤维素膜转移至含有潮霉素与头孢霉素的pda固体平板上，并放回至27℃光照培养箱中倒置进行培养，直到平板上长出白色或灰色菌落；验证：将白色或灰色菌落转移至新的含抗性的pda平板上记为
△
bcste12，平板划出九宫格，每个挑取的菌落都作好数字标记，取菌块提取基因组，用验证引物进行pcr验证，待验证完成对平板上相应编号菌落进行多次传代培养，并进一步进行southern blot 验证。
6.更具体地，所述侵染菌液的制备步骤中，agl1农杆菌菌液浓度od600为0.6-0.8。
7.更具体地，所述bcste12基因质粒载体构建步骤中，灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除后，采用引物，扩增出两个侧翼序列bcste12-f与bcste12-r，对侧翼进行酶切位点分析，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-f，纯化回收后，采用连接酶连接二者，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-r，纯化回收后，采用连接酶连接二者；侧翼序列bcste12-f所用引物为：l: ccctcgagagcaagttagaacgaaagggg，r: ggctcgagcatatgcgccattcaattga, 扩增长度为1228bp；侧翼序列bcste12-r所用引物为：l: gctctagaagttcgcgccgaactccccgt, r：gctctagatccaaagaatacctacgcgct扩增长度为1247bp。
8.更具体地，所述液生孢子的制备步骤中，吐温80溶液的体积浓度为0.05%，分生孢子悬浮液浓度为2x108/ml，液生孢子浓度为2x106/ml。
9.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，建立灰霉病菌更为高效的遗传转化体系，从而为更快更高效鉴定更多灰霉病菌致病相关基因，为灰霉病菌致病机制的探究及绿色防治提供技术支持。
附图说明
10.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：附图1为本发明灰霉菌株及its序列图；附图2为本发明bcste12基因-质粒载体构建策略图；附图3为本发明过滤菌丝收集液生孢子操作图；附图4为本发明分生孢子与液生孢子转化效率对比图；附图5为本发明遗传转化体系操作流程图。
具体实施方式
11.下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
12.实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为相关领域技术人员所熟知的常规实验手段。
实施例
13.一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，整个遗传操作流程图如附图5所示，包括下列步骤：灰霉菌株分生孢子的制备：从自然感病番茄果实上分离菌株，纯化培养后，采取ctab法提取基因组dna，然后采用its引物进行扩增，测序后于ncbi网站进行数据比对后，为botrytis cinerea b05.10菌株，再次转接菌株于新的培养基中，培养7-10天至产孢，获得分生孢子；引物序列为：its1：tccgtaggtgaacctgcgg；its4：tcctccgcttattgatatgc；附图1为灰霉菌株及its序列图，菌落呈现灰霉菌典型的蓬松灰色形态。
14.bcste12基因质粒载体构建：将获得的灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除，采用pzp-hph-knock质粒为骨架，通过酶切连接，构建bcste12基因敲除的质粒载体pzp-hph-bcste12-knock；以ncbi数据库中b05.10菌株基因组信息为模板，寻找ste12基因序列，并获取基因cds上游与下游长度在1000bp左右的侧翼序列，对获得的侧翼序列进行酶切位点分析（上游-1228-0，下游2427-3674），避免序列中存在质粒载体端的酶切位点，分析完成后设计特异性的引物，并在两条引物端加上质粒载体上合适的酶切位点，以b05.10菌株中的基因组dna作为模板扩增出两个侧翼序列bcste12-f与bcste12-r，相同的内切酶先酶切质粒载体和左端侧翼bcste12-f，纯化回收后，采用连接酶连接二者，转化大肠杆菌后，验证阳性单克隆，并提取连上一个侧翼的质粒载体待用，同样的手段酶切连接连上左翼的质粒载体和右翼片段，转化后获得完整带两个侧翼的敲除质粒pzp-hph-bcste12-knock；侵染菌液的制备：将质粒载体pzp-hph-bcste12-knock转入到agl1农杆菌菌株中，在验证单克隆正确的情况下进行扩大培养，吸取500ul体积的培养的agl1农杆菌菌液，加入到含200μm浓度as及100μm浓度mes的im液体培养基中，同时添加3μl体积的silwetl-77，于常规条件下摇床培养8h左右，作为侵染菌液待用；液生孢子的制备：将获得的分生孢子与新鲜配制灭菌的吐温80溶液混合，制备分生孢子悬浮液，并用血球计数板计数，配制成相应浓度，接种1ml菌液于100ml液体pdb溶液中，于28℃恒温摇床中培养8-12小时，用1ml移液枪汲取摇床培养后的菌液，然后枪头覆盖灭菌过滤纸，作为菌丝过滤装置，过滤去除菌丝，将菌液推入到2ml离心管中，收集孢子液，收集完毕后真空干燥并浓缩液体，并用纯水重新调整孢子液浓度，获得液生孢子；附图3为本发明过滤菌丝收集液生孢子操作图，采用过滤装置可过滤除去生长起来的菌丝，并可收集到大量的液生孢子。
15.诱导共培养：将侵染菌液和液生孢子进行等体积混合，并进行涡旋混匀，于室温下
进行诱导30min，获得混合液，然后取100ul的混合液涂布于平铺硝酸纤维素膜的co-im固体培养基上，并于27℃倒置培养48h；转膜：将诱导共培养步骤中培养完成的硝酸纤维素膜转移至含有潮霉素与头孢霉素的pda固体平板上，并放回至27℃光照培养箱中倒置进行培养，直到平板上长出白色或灰色菌落；验证：将白色或灰色菌落转移至新的含抗性的pda平板上记为
△
bcste12，平板划出九宫格，每个挑取的菌落都作好数字标记，取一小部分菌块提取基因组，用验证引物进行pcr验证，待验证完成对平板上相应编号菌落进行多次传代培养，并进一步进行southern blot 验证。
16.通过验证可以得出液生孢子的转化效率，在同等条件下，相同时间内，其他实验条件参数也保持一致，可以得出分生孢子和液生孢子的转化分子数量，从而比较其转化效率，通过附图4所示，本发明液生孢子的转化效率远远高于传统的分生孢子。
17.优化地，所述侵染菌液的制备步骤中，agl1农杆菌菌液浓度od600为0.6-0.8。
18.优化地，所述bcste12基因质粒载体构建步骤中，灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除后，采用引物，扩增出两个侧翼序列bcste12-f与bcste12-r，对侧翼进行酶切位点分析，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-f，纯化回收后，采用连接酶连接二者，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-r，纯化回收后，采用连接酶连接二者；侧翼序列bcste12-f所用引物为：l: ccctcgagagcaagttagaacgaaagggg，r: ggctcgagcatatgcgccattcaattga, 扩增长度为1228bp；侧翼序列bcste12-r所用引物为：l: gctctagaagttcgcgccgaactccccgt, r：gctctagatccaaagaatacctacgcgct扩增长度为1247bp。
19.bcste12基因左臂含ecori、hindiii、xhol等载体上所含酶切位点，右臂含hindiii、sali等载体酶切位点，因此，选择xhol酶切位点加入到左臂两端，xbai和psti酶切位点加入右臂两端，连接时先连接左臂，后连接右臂。所用引物为左臂：l: ccctcgagagcaagttagaacgaaagggg，r: ggctcgagcatatgcgccattcaattga, 扩增长度为1228bp，右臂引物为：l: gctctagaagttcgcgccgaactccccgt, r：gctctagatccaaagaatacctacgcgct扩增长度为1247bp。
20.附图2为发明bcste12基因-质粒载体构建策略图。
21.优化地，所述液生孢子的制备步骤中，吐温80溶液的体积浓度为0.05%，分生孢子悬浮液浓度为2x108/ml，液生孢子浓度为2x106/ml。
22.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。