一种造血干细胞的提取和保存方法与流程

1.本发明涉及造血干细胞技术领域，具体为一种造血干细胞的提取和保存方法。


背景技术：

2.造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞，造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体；因此在科学研究中对造血干细胞进行研究使十分有必要的。一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，随着医学和生物技术的发展，我我们发现在胎盘中含有大量的造血干细胞，且胎盘在分娩后大多作为废弃物处理，因此我们选用胎盘来进行造血干细胞研究，不会对被研究者造成损伤，且胎盘中造血干细胞的含量和增值能力也具有明显的优势。传统的从胎盘中提取造血干细胞的方法步骤较为繁琐，这样不仅造成造血干细胞的提取成本高，且提取效率较低。且由于传统的提取方法存在一定的缺陷，容易造成干细胞的死亡，且死亡后的干细胞还会影响其他干细胞的存活。现有的造血干细胞保存方式仍有一定的缺陷，不仅保存方法操作过程复杂，而且干细胞安全难以保证，使造成细胞的存活率低。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种造血干细胞的提取和保存方法，以解决上述过程中所提到的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种造血干细胞的提取方法，包括以下步骤：
5.步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录；
6.步骤二：胎盘检测，胎盘送至实验室后，核验储存箱上的标签、箱内温度，将胎盘取出进行预清理后，对胎盘和母血进行病原微生物检测；
7.步骤三：胎盘清洗，通过清洗液对胎盘进行前期的清洗处理，收集清洗后的液体a，用灌洗液对胎盘脐静脉、脐动脉内的血液进行灌洗，收集灌洗的液体，从而得到液体b；
8.步骤四：胎盘溶解，在无菌环境下使用消毒后的医用剪刀将胎盘剪碎，然后将剪碎的胎盘浸入酶解液内消化胎盘组织，将酶解后的胎盘组织液收集，从而得到液体c；
9.步骤五：将液体a、液体b和液体c混合得到混合液，将混合液经过2-3 次过滤，从而得到过滤后的溶液，将过滤后的溶液静止6-9h，取出上清液，从而得到细胞悬液；
10.步骤六：将细胞悬液加入离心机中进行第一次离心，取出离心后的上清液a，将上清液a与羟乙基淀粉后加入培养基中放置30-50min，将培养基中混合后的上清液a加入离心机中进行第二次离心，取出上清液b，将上清液b和和淋巴细胞分离液混合后加入培养基中静置1-2h，将混合后的上清液b加入离心机中第三次离心，取出上清液，从而制备得到造血干细胞。
11.优选的，步骤一中储存箱的温度控制在4-8℃，胎盘需要在24h内送至实验室。
12.优选的，步骤二中预清理方式为，先采用75％酒精喷洒在胎盘外表面，再采用生理盐水清洗胎盘外表面的残留血液和血块。
13.优选的，步骤二中病原微生物检测为：肝炎病毒及相应抗体、性病检测、艾滋病毒抗体检测、遗传性溶血性疾病、有核白细胞及单个核细胞计数、造血干/祖细胞定量检测、组织配型、造血干/祖细胞定性检测。
14.优选的，步骤三中清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为 1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/l。
15.优选的，步骤三中灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素c、1-5mgamd3100、2支肝素钠注射液、 2支硝酸甘油注射液、30-70ml质量分数为8％-12％的pbs缓冲液和1ldeme 培养液制得，灌洗时以每秒钟3滴灌洗液的速度进行灌洗3-5h。
16.优选的，步骤四中胎盘碎块的长宽均小于5-10mm，胎盘组织在酶解液内消化时间为30-40min。
17.优选的，步骤六中上清液a与羟乙基淀粉的配比为1:6，上清液b和和淋巴细胞分离液的配比为1:4。
18.优选的，步骤六中第一次离心时间10-20min，离心机转速为500-800r/min，第二次离心时间10-20min，离心机转速为离心机转速为1200-1400r/min，第三次离心时间20-40min，离心机转速为1200-1400r/min。
19.一种造血干细胞的保存方法，包括以下步骤：
20.步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1
×
106～1
×
107个/ml，再将造血干细胞冻存液缓慢的注入冷冻袋中；
21.步骤二：先将装有造血干细胞冻存液的冷冻袋放置在4℃的环境下，静置 30min，再将其以2℃/min的降温速度降至-26℃，冷冻保存1-2h后，再以2℃/min 的降温速度降至-56℃，冷冻保存1-2h后，再以10℃/min的降温速度降至-96℃，冷冻保存1h，再以10℃/min的降温速度降至-196℃，最后将其置于-196℃的液氮中长期保存。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的造血干细胞提取过程严谨，提取前通过对胎盘进行低温储存转运，同时做好标签记录，保证胎盘的质量，再通过对胎盘和母血进行病原微生物检测，保证了造血干细胞的健康；提取过程通过对胎盘进行清洗、灌洗和胎盘组织酶解消化，使用设备简单，操作步骤方便，不仅提高了胎盘中造血干细胞的提取效率，而且对造血干细胞的损伤小，数量多，活性强；对造血干细胞进行冻存时，分成多次阶段性降温，尽可能的保证造血干细胞的活性，提高了造血干细胞的保存质量。
具体实施方式
23.对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例一：一种造血干细胞的提取方法，包括以下步骤：
25.步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录；
26.步骤二：胎盘检测，胎盘送至实验室后，核验储存箱上的标签、箱内温度，将胎盘取出进行预清理后，对胎盘和母血进行病原微生物检测；
27.步骤三：胎盘清洗，通过清洗液对胎盘进行前期的清洗处理，收集清洗后的液体a，用灌洗液对胎盘脐静脉、脐动脉内的血液进行灌洗，收集灌洗的液体，从而得到液体b；
28.步骤四：胎盘溶解，在无菌环境下使用消毒后的医用剪刀将胎盘剪碎，然后将剪碎的胎盘浸入酶解液内消化胎盘组织，将酶解后的胎盘组织液收集，从而得到液体c；
29.步骤五：将液体a、液体b和液体c混合得到混合液，将混合液经过2-3 次过滤，从而得到过滤后的溶液，将过滤后的溶液静止6-9h，取出上清液，从而得到细胞悬液；
30.步骤六：将细胞悬液加入离心机中进行第一次离心，取出离心后的上清液a，将上清液a与羟乙基淀粉后加入培养基中放置30-50min，将培养基中混合后的上清液a加入离心机中进行第二次离心，取出上清液b，将上清液b和和淋巴细胞分离液混合后加入培养基中静置1-2h，将混合后的上清液b加入离心机中第三次离心，取出上清液，从而制备得到造血干细胞。
31.优选的，步骤一中储存箱的温度控制在4℃，胎盘需要在24h内送至实验室。
32.优选的，步骤二中预清理方式为，先采用75％酒精喷洒在胎盘外表面，再采用生理盐水清洗胎盘外表面的残留血液和血块。
33.优选的，步骤二中病原微生物检测为：肝炎病毒及相应抗体、性病检测、艾滋病毒抗体检测、遗传性溶血性疾病、有核白细胞及单个核细胞计数、造血干/祖细胞定量检测、组织配型、造血干/祖细胞定性检测。
34.优选的，步骤三中清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为 1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/l。
35.优选的，步骤三中灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素c、1-5mgamd3100、2支肝素钠注射液、 2支硝酸甘油注射液、30-70ml质量分数为8％-12％的pbs缓冲液和1ldeme 培养液制得，灌洗时以每秒钟3滴灌洗液的速度进行灌洗3-5h。
36.优选的，步骤四中胎盘碎块的长宽均小于5-10mm，胎盘组织在酶解液内消化时间为30min。
37.优选的，步骤六中上清液a与羟乙基淀粉的配比为1:6，上清液b和和淋巴细胞分离液的配比为1:4。
38.优选的，步骤六中第一次离心时间10min，离心机转速为500r/min，第二次离心时间10min，离心机转速为离心机转速为1200r/min，第三次离心时间20min，离心机转速为1200r/min。
39.一种造血干细胞的保存方法，包括以下步骤：
40.步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1
×
106～1
×
107个/ml，再将造血干细胞冻存液缓慢的注入冷冻袋中；
41.步骤二：先将装有造血干细胞冻存液的冷冻袋放置在4℃的环境下，静置 30min，再将其以2℃/min的降温速度降至-26℃，冷冻保存1-2h后，再以2℃/min 的降温速度降至-56℃，冷冻保存1-2h后，再以10℃/min的降温速度降至-96℃，冷冻保存1h，再以10℃/min的降温速度降至-196℃，最后将其置于-196℃的液氮中长期保存。
42.实施例二：一种造血干细胞的提取方法，包括以下步骤：
43.步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录；
44.步骤二：胎盘检测，胎盘送至实验室后，核验储存箱上的标签、箱内温度，将胎盘取出进行预清理后，对胎盘和母血进行病原微生物检测；
45.步骤三：胎盘清洗，通过清洗液对胎盘进行前期的清洗处理，收集清洗后的液体a，用灌洗液对胎盘脐静脉、脐动脉内的血液进行灌洗，收集灌洗的液体，从而得到液体b；
46.步骤四：胎盘溶解，在无菌环境下使用消毒后的医用剪刀将胎盘剪碎，然后将剪碎的胎盘浸入酶解液内消化胎盘组织，将酶解后的胎盘组织液收集，从而得到液体c；
47.步骤五：将液体a、液体b和液体c混合得到混合液，将混合液经过2-3 次过滤，从而得到过滤后的溶液，将过滤后的溶液静止6-9h，取出上清液，从而得到细胞悬液；
48.步骤六：将细胞悬液加入离心机中进行第一次离心，取出离心后的上清液a，将上清液a与羟乙基淀粉后加入培养基中放置30-50min，将培养基中混合后的上清液a加入离心机中进行第二次离心，取出上清液b，将上清液b和和淋巴细胞分离液混合后加入培养基中静置1-2h，将混合后的上清液b加入离心机中第三次离心，取出上清液，从而制备得到造血干细胞。
49.优选的，步骤一中储存箱的温度控制在4℃，胎盘需要在24h内送至实验室。
50.优选的，步骤二中预清理方式为，先采用75％酒精喷洒在胎盘外表面，再采用生理盐水清洗胎盘外表面的残留血液和血块。
51.优选的，步骤二中病原微生物检测为：肝炎病毒及相应抗体、性病检测、艾滋病毒抗体检测、遗传性溶血性疾病、有核白细胞及单个核细胞计数、造血干/祖细胞定量检测、组织配型、造血干/祖细胞定性检测。
52.优选的，步骤三中清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为 1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/l。
53.优选的，步骤三中灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素c、1-5mgamd3100、2支肝素钠注射液、 2支硝酸甘油注射液、30-70ml质量分数为8％-12％的pbs缓冲液和1ldeme 培养液制得，灌洗时以每秒钟3滴灌洗液的速度进行灌洗3-5h。
54.优选的，步骤四中胎盘碎块的长宽均小于5-10mm，胎盘组织在酶解液内消化时间为35min。
55.优选的，步骤六中上清液a与羟乙基淀粉的配比为1:6，上清液b和和淋巴细胞分离液的配比为1:4。
56.优选的，步骤六中第一次离心时间15min，离心机转速为650r/min，第二次离心时间15min，离心机转速为离心机转速为1300r/min，第三次离心时间30min，离心机转速为1300r/min。
57.一种造血干细胞的保存方法，包括以下步骤：
58.步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1
×
106～1
×
107个/ml，再将造血干细胞冻存液缓慢的注入冷冻袋中；
59.步骤二：先将装有造血干细胞冻存液的冷冻袋放置在4℃的环境下，静置 30min，
再将其以2℃/min的降温速度降至-26℃，冷冻保存1-2h后，再以2℃/min 的降温速度降至-56℃，冷冻保存1-2h后，再以10℃/min的降温速度降至-96℃，冷冻保存1h，再以10℃/min的降温速度降至-196℃，最后将其置于-196℃的液氮中长期保存。
60.实施例三：一种造血干细胞的提取方法，包括以下步骤：
61.步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录；
62.步骤二：胎盘检测，胎盘送至实验室后，核验储存箱上的标签、箱内温度，将胎盘取出进行预清理后，对胎盘和母血进行病原微生物检测；
63.步骤三：胎盘清洗，通过清洗液对胎盘进行前期的清洗处理，收集清洗后的液体a，用灌洗液对胎盘脐静脉、脐动脉内的血液进行灌洗，收集灌洗的液体，从而得到液体b；
64.步骤四：胎盘溶解，在无菌环境下使用消毒后的医用剪刀将胎盘剪碎，然后将剪碎的胎盘浸入酶解液内消化胎盘组织，将酶解后的胎盘组织液收集，从而得到液体c；
65.步骤五：将液体a、液体b和液体c混合得到混合液，将混合液经过2-3 次过滤，从而得到过滤后的溶液，将过滤后的溶液静止6-9h，取出上清液，从而得到细胞悬液；
66.步骤六：将细胞悬液加入离心机中进行第一次离心，取出离心后的上清液a，将上清液a与羟乙基淀粉后加入培养基中放置30-50min，将培养基中混合后的上清液a加入离心机中进行第二次离心，取出上清液b，将上清液b和和淋巴细胞分离液混合后加入培养基中静置1-2h，将混合后的上清液b加入离心机中第三次离心，取出上清液，从而制备得到造血干细胞。
67.优选的，步骤一中储存箱的温度控制在6℃，胎盘需要在24h内送至实验室。
68.优选的，步骤二中预清理方式为，先采用75％酒精喷洒在胎盘外表面，再采用生理盐水清洗胎盘外表面的残留血液和血块。
69.优选的，步骤二中病原微生物检测为：肝炎病毒及相应抗体、性病检测、艾滋病毒抗体检测、遗传性溶血性疾病、有核白细胞及单个核细胞计数、造血干/祖细胞定量检测、组织配型、造血干/祖细胞定性检测。
70.优选的，步骤三中清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为 1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/l。
71.优选的，步骤三中灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素c、1-5mgamd3100、2支肝素钠注射液、 2支硝酸甘油注射液、30-70ml质量分数为8％-12％的pbs缓冲液和1ldeme 培养液制得，灌洗时以每秒钟3滴灌洗液的速度进行灌洗3-5h。
72.优选的，步骤四中胎盘碎块的长宽均小于5-10mm，胎盘组织在酶解液内消化时间为40min。
73.优选的，步骤六中上清液a与羟乙基淀粉的配比为1:6，上清液b和和淋巴细胞分离液的配比为1:4。
74.优选的，步骤六中第一次离心时间20min，离心机转速为800r/min，第二次离心时间20min，离心机转速为离心机转速为1400r/min，第三次离心时间40min，离心机转速为1400r/min。
75.一种造血干细胞的保存方法，包括以下步骤：
76.步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1
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106～1
×
107个/ml，再将造血干细胞冻存液缓慢的注入冷冻袋中；
77.步骤二：先将装有造血干细胞冻存液的冷冻袋放置在4℃的环境下，静置 30min，再将其以2℃/min的降温速度降至-26℃，冷冻保存1-2h后，再以2℃/min 的降温速度降至-56℃，冷冻保存1-2h后，再以10℃/min的降温速度降至-96℃，冷冻保存1h，再以10℃/min的降温速度降至-196℃，最后将其置于-196℃的液氮中长期保存。
78.实验结果对比表
79.细胞存活率1个月3个月6个月12个月实施例一98.2597.5496.8792.52实施例二98.7597.8596.9294.35实施例三98.3597.2596.7593.56
80.本发明的造血干细胞提取过程严谨，提取前通过对胎盘进行低温储存转运，同时做好标签记录，保证胎盘的质量，再通过对胎盘和母血进行病原微生物检测，保证了造血干细胞的健康；提取过程通过对胎盘进行清洗、灌洗和胎盘组织酶解消化，使用设备简单，操作步骤方便，不仅提高了胎盘中造血干细胞的提取效率，而且对造血干细胞的损伤小，数量多，活性强；对造血干细胞进行冻存时，分成多次阶段性降温，尽可能的保证造血干细胞的活性，提高了造血干细胞的保存质量。通过实施例1-3中得到的造血干细胞中1个月、3个月、6 个月、12个月的细胞存活率均高于92.5％，且实施例1-3中的造血干细胞彼此之间的细胞存活率相差不大，其中实施例二相对较好。
81.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。