一株耐酒精的鼠李糖乳杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐酒精的鼠李糖乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.l-乳酸是一种重要的有机酸，在食品、皮革、医药和化工等行业中被广泛应用，需求量巨大。微生物发酵法是生产l-乳酸比较常用的一种方法，该方法具有原料来源广、产物纯度高等优点。但仍存在一些不足，主要表现在l-乳酸产量低，产生菌对营养底物要求高，需要价格较贵的酵母粉或酵母膏作为氮源才能获得较高的l-乳酸产量，导致发酵成本增加，影响经济效益。因此，降低氮源的成本来生产l-乳酸具有很大的现实意义。
3.酒精广泛应用于国民经济的许多部门。现在,国际上发酵酒精的研究是将它作为清洁的液体燃料,在能源危机时可替代或部分替代汽油。随着能源危机的加剧,将生物资源等可再生资源转化成能源的最佳途径是生产燃料酒精,而且酒精作为燃料,具有对环境污染小等许多优点。然而,目前我国酒精生产面临的主要问题有:(1)发酵成本过高;(2)生产过程能耗过大;(3)酒精发酵强度低;(4)酒糟污染等制约着酒精的发展。针对传统酒精发酵中存在的问题,发展出酒精浓醪发酵技术,其具有提高发酵强度;降低能耗,降低酒精生产成本;减轻酒糟处理负荷等优点而逐渐成为研究热点。
4.酒精生产存在着另一难题是排放的酒糟难以处理。每生产1 t酒精约排放10～ 15 t酒糟,其中约有5%～ 8%的干物质主要是未被利用的碳水化合物、蛋白质等营养物质;且糟液的bod值为28,000～ 35,000 mg/l,cod值为35,000～ 50,000 mg/l,因此不经处理的酒糟直接排放,不仅使大量资源浪费,而且对生态环境也是严重的污染。若能将酒糟作为有用的原料来处理,将其可用的物质全部资源化,转化为有价值的产品,这样既解决了酒糟处理问题,又可相应的降低酒精生产成本。
5.玉米酒糟是生产燃料乙醇的主要副产物，它富含大量的营养物质，如粗纤维、脂肪、氨基酸、粗淀粉、矿物质、酶类和多种维生素，可以用于生产饲料、生产沼气、也可以作为微生物发酵的氮源，是一种可供开发利用的廉价理想原料。根据目前国内燃料乙醇的生产技术条件，每生产1t燃料乙醇需要消耗大约3t玉米，并同时产出大约10～12t的玉米酒糟。但其在使用过程中和储藏期间易氧化酸败而引起变质，限制了其在动物饲料中的广泛应用。如果将玉米酒糟直接排放，不仅使玉米酒糟中丰富的营养成分未被利用，造成资源的严重浪费，还会对生态环境造成严重污染。因此将玉米酒糟用作微生物发酵产l-乳酸的氮源，这样不仅能解决环境污染问题，还可以生产出价值更高的产品，使玉米酒糟变废为宝，增加玉米酒糟的附加值。


技术实现要素：

6.本发明目的是为提高l-乳酸产量，解决产生菌对营养底物要求高以及玉米酒糟未充分利用造成资源浪费的问题，而提供一株鼠李糖乳杆菌及其应用。
7.鼠李糖乳杆菌ak-0779，它的保藏编号为cctcc no：m 20211540。
8.鼠李糖乳杆菌ak-0779在提高l-乳酸产量方面的应用。
9.l-乳酸生产方法，它包括：1）配制发酵培养基；所述的发酵培养基按质量计组成为葡萄糖8~12%、玉米酒糟0.5~1.5%、酵母粉1.5~2%，余量为水；2）将鼠李糖乳杆菌ak-0779接种至步骤1）所述的发酵培养基中，发酵12~48h，得到l-乳酸；步骤1）所述的葡萄糖10%、玉米酒糟1%、酵母粉1.7%。
10.本发明提供了鼠李糖乳杆菌ak-0779，它的保藏编号为cctcc no：m 20211540。鼠李糖乳杆菌ak-0779在提高l-乳酸产量方面的应用。本发明优点在于：1）筛选出一株耐酒精产l-乳酸的菌株，并对其发酵培养基进行优化，提高l-乳酸的产量。不仅大大降低l-乳酸的生产成本，还解决了环境污染问题。鼠李糖乳杆菌ak-0779作为一种益生菌具有良好的抑制致病菌感染、耐酸胁迫、较高的肠道定植和体外抗氧化能力。用玉米酒糟代替部分酵母粉作为氮源优化培养基l-乳酸的产量平均值78.36 g/l；而酵母粉完全充当氮源时，l-乳酸产量为82.36 g/l，两种条件下l-乳酸产量相差不大，所以使用玉米酒糟代替部分酵母可以有效降低生产成本。同时，发酵后玉米酒糟的口感和风味均得到了改善，可更好的用做动物饲料，推动我国玉米深加工产业的发展。
附图说明
11.图1 初始菌株在胁迫条件下的存活情况及产酸情况结果；图2 筛选菌株驯化后的存活情况结果；图3 筛选菌株的菌落、菌体形态及16s rdna鉴定照片结果；图4 鼠李糖乳杆菌ak-0779的发酵特性结果；图5 鼠李糖乳杆菌ak-0779的发酵产酸稳定性结果；图6 鼠李糖乳杆菌ak-0779以玉米酒糟为基质发酵培养基优化结果(6a、6b、6c)；图7 酵母粉完全充当氮源及玉米酒糟替代部分酵母粉充当氮源的产l-乳酸情况；图8 鼠李糖乳杆菌ak-0779的模拟体外人工胃肠液耐受能力结果；图9 鼠李糖乳杆菌ak-0779黏附特性结果；图10 鼠李糖乳杆菌ak-0779的体外抗氧化能力结果。
具体实施方式
12.实施例1 筛选菌株的培养一、初始菌株的培养初始菌株为鼠李糖乳杆菌ak-0779，是从酸菜中筛选出来的。将其在mrs液体培养基进行活化传代，于37℃条件下培养24 h。
13.所述的mrs液体培养基（g/l）：含有蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵[（nh4）2hc6h5o7] 2.0 g，葡萄糖(c6h
12
o6·
h2o) 20.0 g，吐温80 1.0 m l，乙酸钠（ch3coona
· 3h2o）5.0 g，磷酸氢二钾（k2hpo4
· 3h2o）2.0 g，硫酸镁（mgso4·
7h2o）0.58 g，硫酸锰（mnso4·
h2o）0.25 g，蒸馏水1 l。
[0014]
二、初始菌株的酒精胁迫试验
将初始菌株接种于mrs液体培养基，37℃下培养24h；再接种到含有酒精体积分别为0%、5%、10%、15%的mrs液体培养基中培养24h（每隔4h在od
600 nm处测定其吸光度，）并利用稀释涂布平板法进行菌落计数，计算存活率（%）；按如下公式计算细菌存活率（取三次平行试验的平均值）：式中：a0为未加酒精处理的活菌数a1为加酒精处理后的活菌数。
[0015]
三、初始菌株的产酸能力测定将初始菌株接种于mrs液体培养基，37℃下培养。于发酵对数期每隔2h测定菌株的产l-乳酸能力。使用购买于南京建成生物工程研究所的l-乳酸试剂盒测定l-乳酸产量。
[0016]
四、初始菌株酒精胁迫及产酸能力测定结果根据初始菌株在胁迫条件下的存活情况及产l-乳酸情况可知，如图1所示，菌株ak-0779较其他初始菌株（6133、6141、6166、6167、乳杆菌1）具有良好的耐酒精及产l-乳酸能力；在初始葡萄糖浓度20 g/l的条件下，l-乳酸的产量达到13.46 g/l。因此，将鼠李糖乳杆菌atcc作为本研究的筛选菌株，用于下一步试验。
[0017]
实施例2 筛选菌株的驯化与鉴定对筛选菌株ak-0779进行5%的酒精胁迫驯化，驯化到第5代时，其存活率较未驯化前，有显著提高。将驯化后的筛选菌株在酒精体积分数为5%胁迫条件下生长时，其存活率为76.50%，如图2所示，说明其对胁迫条件的敏感性降低，能更好的在胁迫条件下生长。验证了驯化结果可靠。
[0018]
将经驯化后的筛选菌株送至上海生工公司进行16s rdna鉴定。筛选菌株在平板上的单菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，不透明，边缘整齐，颜色为乳白色，结果图3a所示。革兰氏染色呈阳性，短杆状，图3b所示。对其进行16s rdna测序以及在ncbi官网进行序列比对。结果发现该菌株与鼠李糖乳杆菌显示出最高的分子系统学上的亲缘关系，同源性高达99.65%，因此将其命名为鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）ak-0779，系统发育树如图3c所示。鼠李糖乳杆菌ak-0779于2021年12 月3日在（中国典型培养物保藏中心-武汉大学）进行保藏，保藏编号为（cctcc no：m 20211540 ak-0779）。
[0019]
实施例3 鼠李糖乳杆菌ak-0779发酵特性及产酸稳定性1、筛选菌株发酵特性的研究将驯化后的筛选菌株ak-0779接种到mrs液体培养基中，在37℃恒温培养箱中发酵0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h。用生理盐水进行10倍系列稀释，稀释适当浓度后涂布于mrs固体培养基中，记录菌落数。（取三次平行试验的平均值）并同时使用购买于南京建成生物工程研究所的l-乳酸试剂盒测定以上不同发酵时间的l-乳酸产量。
[0020]
2、筛选菌株产酸稳定性研究将驯化后的筛选菌株接种到mrs液体培养基中，传代10次，其中在第1代、第3代、第5代、第7代、第9代和第10代测定其产l-乳酸能力。每次实验作三个平行，求其平均值。对比传代不同次数对其产l-乳酸能力的影响。
[0021]
结果：在发酵特性及发酵产酸稳定性试验中，发现鼠李糖乳杆菌ak-0779在发酵第
12 h~48 h内能较好的维持活性，结果如图4所示，产l-乳酸13.46 g/l；在考察产酸稳定性的试验中，发现鼠李糖乳杆菌ak-0779具有良好的产酸稳定性，对比不同传代次数，产l-乳酸量无显著差异性，结果如图5所示。说明鼠李糖乳杆菌ak-0779在发酵和产酸过程中较稳定。
[0022]
实施例4 以玉米酒糟为基质发酵培养基优化ye发酵培养基（g/l）：葡萄糖20 g，酵母粉25 g，碳酸钙10 g，蒸馏水1 l 。
[0023]
从节约成本出发，对鼠李糖乳杆菌ak-0779的发酵ye培养基进行单因素试验且在ye培养基单因素试验基础上，对碳源添加量、玉米酒糟添加量及酵母粉添加量进行三因素三水平的box-behnken试验设计，以l-乳酸产量为响应值，通过design-expert 8.0软件对试验结果进行回归分析，建立回归方程，获得最佳培养条件，优化产l-乳酸的合成培养基。
[0024]
结果：采用design-expert 8.0trial 软件对试验数据优化分析，响应面试验因素水平如表1所示。结果表明产l-乳酸最佳的培养基工艺条件为葡萄糖添加量为10%、玉米酒糟添加量为1.0%、酵母粉添加量为1.7%，在该条件下得到的l-乳酸产量预测值为79.25g/l。响应面结果如图6所示。在此工艺参数下，进行3次验证重复试验，得到l-乳酸的产量分别77.72 g/l 、78.69 g/l 、78.67 g/l，平均值是78.36 g/l，相对误差为1.12%。符合预期结果。当酵母粉完全充当氮源时，l-乳酸产量为82.36 g/l，与玉米酒糟部分代替酵母粉充当氮源l-乳酸的产量相差不大，结果如图7所示，说明玉米酒糟可以有效替代部分酵母粉作为微生物发酵氮源，降低生产成本。
[0025]
实施例5 鼠李糖乳杆菌ak-0779益生特性研究一、抑菌能力试验利用牛津杯法进行菌株代谢产物的抑菌试验。将活化好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌液稀释至10
5 cfu/ml，取0.1 ml涂布到lb平板上，将已灭菌的牛津杯放于平板中，平行放置三个，取已活化好的驯化后的筛选菌株菌液100 μl放入牛津杯内，然后将平板慢慢放于37℃恒温培养箱，培养48 h，观察并测量抑菌圈直径大小，平行试验三次。
[0026]
二、抗生素敏感性试验采用微量肉汤稀释法，分别准确称取氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、链霉素及四环素5120 ug，溶解在1 ml已灭菌的mrs液体培养基中；然后用9 ml已灭菌的mrs液体培养基稀释10倍，此时浓度为512 μg/ml待用；已灭菌的5 ml ep管中每孔提前加入2 ml已灭菌的mrs液体培养基，吹打均匀后，在256-1 μg/ml 的范围内进行倍比稀释；然后每孔加入20 μl驯化后的筛选菌株菌液，并设置空白组不加入抗生素及对照组在mrs中接种；37℃培养24 h观察最低抑制浓度；96孔板中每孔加入200 μl在od
600 nm测定吸光度值。
[0027]
三、模拟人工胃肠液耐受试验（1）菌悬液的制备将驯化后的筛选菌株扩大培养的发酵液在3000 r/min条件下离心10 min，弃上清，用无菌pbs溶液洗涤两次，收集菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。
[0028]
（2）模拟人工胃液耐受能力取1 ml菌悬液并加入9 ml模拟人工胃液中（购自beijing biotechnology co.，ltd），37℃下静置培养，分别在培养第0 h、2 h、4 h取样，稀释涂布于固体培养基上，培养48 h，计算存活率。
[0029]
（3）模拟人工肠液耐受能力取1ml培养在人工胃液4 h的菌液，加入到9 ml的人工肠液中（购自beijing biotechnology co.，ltd），分别在培养第0 h、2 h、4 h取样，稀释涂布于固体培养基上，培养48 h，计算存活率。（取三次平行试验的平均值）式中：bn为人工胃肠液处理之后的活菌数b0为人工胃肠液处理之前的活菌数四、黏附特性的研究（1）菌悬液制备将驯化后的筛选菌株扩大培养的发酵液在3000 r/min条件下离心10 min，弃上清，用无菌pbs溶液洗涤两次，收集菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。对菌悬液浓度进行调整，使菌体悬液的吸光度（od
600 nm）达到1.0
±
0.02（c0）。
[0030]
（2）表面疏水性取3 ml菌悬液与0.6 ml的有机溶剂（二甲苯、乙酸乙酯、三氯甲烷）混匀后涡旋震荡2 min，室温下静置10 min，形成两相体系（水相和有机相），37
°
c孵育2 h、12 h。2 h、12 h后小心吸取水相，在od
600 nm处测定吸光度（c1），细胞表面疏水性按如下公式计算：（取三次平行试验的平均值）（3）自聚集能力按上述方法制备好的菌悬液，调整其od
600 nm处的吸光值为1.0
±
0.02（d
0 h）。取3 ml菌悬液旋涡震荡1 min，于37
°
c条件下孵育0 h、2 h、4 h、6 h。小心吸取静置后的上清液，测定其在od
600 nm处测定吸光度（d1），自聚集能力按如下公式计算：（取三次平行试验的平均值）（4）共聚集能力按上述方法制备驯化后的筛选菌株的菌悬液，调整其od
600 nm处的吸光值为1.0
±
0.02（e0）。以同样的方法制备致病菌（大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）的菌悬液，调整其od
600 nm处的吸光值为1.0
±
0.02（e1）。取1ml菌悬液和1ml致病菌的菌悬液混匀，常温下静置12 h，测定其在od
600 nm处测定吸光度（e
混
），共聚集能力按如下公式计算：（取三次平行试验的平均值）
五、体外抗氧化能力研究（1）羟自由基清除能力将驯化后的筛选菌株扩大培养的菌液在3000 r/min条件下离心10 min下，弃上清，用无菌pbs溶液洗涤两次，收集菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。分别测定驯化后的筛选菌株发酵上清液、菌悬液及无细胞提取液的羟自由基清除率：5 mmol/l 邻菲罗啉溶液配制：称取0.049 g邻菲罗啉，用蒸馏水定容至50 ml，现配现用；5 mmol/l 硫酸亚铁溶液配制：称取0.069 g硫酸亚铁，用蒸馏水定容至50 ml，现配现用；于37℃水浴70 min，536 nm处测定其吸光度。
[0031]
式中：as为待测样品的吸光值；ap为空白组的吸光值；ab为对照组的吸光值。
[0032]
（2）dpph自由基清除率将驯化后的筛选菌株扩大培养的菌液在3000 r/min条件下离心10 min下，弃上清，用无菌pbs溶液洗涤两次，收集菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。
[0033]
0.2 mmol/l dpph溶液配制：称取0.0078 g dpph，用无水乙醇定容至100 ml，分别测定驯化后的筛选菌株发酵上清液、菌悬液及无细胞提取液的dpph自由基清除能力，暗反应30 min后，在517 nm处测其吸光度。
[0034]
①
样品组：2 ml待测样品 2 ml dpph溶液
②
对照组：2 ml dpph溶液 2 ml无水乙醇
③
空白组：2 ml待测样品 2 ml无水乙醇按照下式计算dpph自由基清除率：式中：as为样品组的吸光值ab为空白组的吸光值ac为对照组的吸光值（3）超氧阴离子自由基清除率将驯化后的筛选菌株扩大培养的菌液在3000 r/min条件下离心10 min下，弃上清，用无菌pbs溶液洗涤两次，收集菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。分别测定驯化后的筛选菌株发酵上清液、菌悬液及无细胞提取液的超氧阴离子自由基清除率。
[0035]
取0.05 mol/l tris-hcl缓冲液（ph8.2）4.5 ml，置于25℃水浴中预热20 min，分别加入2.2 ml各待测样品和0.1 ml 25 mmol/l邻苯三酚溶液（以10 mmol/l hcl配制，调零
管用10 mmol/l hcl代替邻苯三酚的hcl溶液）。混匀后于25℃水浴中反应5 min，加1 ml 8 mol/l hcl终止反应，325 nm处测定吸光度。空白对照组以2.2 ml无菌生理盐水代替各待测样品。按照下式计算超氧阴离子自由基清除率超氧阴离子：式中：ab为空白组od值；as为样品组od值。
[0036]
结果：对鼠李糖乳杆菌ak-0779进行益生特性研究，包括对几种常见致病菌的抑制、对抗生素的敏感性、模拟人工胃肠液耐受性、黏附特性及体外抗氧化能力的测定。
[0037]
如表2所示，鼠李糖乳杆菌ak-0779均可以有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的生长；抗生素敏感性试验结果如表3所示，鼠李糖乳杆菌ak-0779对不同的抗生素具有不同的敏感性，对氨苄青霉素表现出较强的敏感性，对盐酸四环素和氯霉素敏感，对硫酸链霉素和卡那霉素表现出较强的抗性；模拟人工胃肠液试验结果如图8所示，鼠李糖乳杆菌ak-0779对胃液、肠液具有较强的耐受能力，能够在胃肠道中有效发挥益生作用；黏附特性试验中，其疏水性、自聚集能力和共聚集能力都表现出较高的趋势，结果如图9所示，表明鼠李糖乳杆菌ak-0779能更好的定植于肠道中，维持机体稳态；体外抗氧化结果如图10所示，dpph自由基清除率表现为：鼠李糖乳杆菌ak-0779的发酵上清液（95.93%）＞菌体悬液（42.33%）＞无细胞提取液（29.36%）；羟自由基清除率表现为：发酵上清液（155.47%）＞无细胞提取液（138.79%）＞菌体悬液（105.78%）；超氧阴离子自由基清除率表现为：发酵上清液（156.09%）＞无细胞提取液（67.98%）＞菌体悬液（13.86%）。
[0038]
综上结果表明，鼠李糖乳杆菌ak-0779与其他从东北酸菜中分离出的多株菌株比较，具有较高且稳定的产l-乳酸能力；经5%酒精胁迫驯化后，该菌株能够以较高的存活率存在该酒精浓度下；用玉米酒糟代替部分酵母粉作为氮源优化培养基后，l-乳酸产量预测值为79.25 g/l，经3次验证试验，l-乳酸的产量平均值78.36 g/l；而酵母粉完全充当氮源时，l-乳酸产量为82.36 g/l，两种条件下l-乳酸产量相差不大，所以使用玉米酒糟代替部分酵母可以有效降低生产成本。同时鼠李糖乳杆菌ak-0779作为一种益生菌具有良好的抑制致病菌感染、耐酸胁迫、较高的肠道定植和体外抗氧化能力。