一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法

技术特征：
1.一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，其特征在于，包括下列步骤：灰霉菌株分生孢子的制备：从自然感病番茄果实上分离菌株，纯化培养后，采取ctab法提取基因组dna，然后采用its引物进行扩增，测序后于ncbi网站进行数据比对后，为botrytis cinerea b05.10菌株，再次转接菌株于新的培养基中，培养7-10天至产孢，获得分生孢子；引物序列为：its1：tccgtaggtgaacctgcgg；its4：tcctccgcttattgatatgc；bcste12基因质粒载体构建：将获得的灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除，采用pzp-hph-knock质粒为骨架，通过酶切连接，构建bcste12基因敲除的质粒载体pzp-hph-bcste12-knock；侵染菌液的制备：将质粒载体pzp-hph-bcste12-knock转入到agl1农杆菌菌株中，在验证单克隆正确的情况下进行扩大培养，吸取500ul体积的培养的agl1农杆菌菌液，加入到含200μm浓度as及100μm浓度mes的im液体培养基中，同时添加3μl体积的silwetl-77，于常规条件下摇床培养8h左右，作为侵染菌液待用；液生孢子的制备：将获得的分生孢子与新鲜配制灭菌的吐温80溶液混合，制备分生孢子悬浮液，并用血球计数板计数，配制成相应浓度，接种1ml菌液于100ml液体pdb溶液中，于28℃恒温摇床中培养8-12小时，用1ml移液枪汲取摇床培养后的菌液，然后枪头覆盖灭菌过滤纸，作为菌丝过滤装置，过滤去除菌丝，将菌液推入到2ml离心管中，收集孢子液，收集完毕后真空干燥并浓缩液体，并用纯水重新调整孢子液浓度，获得液生孢子；诱导共培养：将侵染菌液和液生孢子进行等体积混合，并进行涡旋混匀，于室温下进行诱导30min，获得混合液，然后取100ul的混合液涂布于平铺硝酸纤维素膜的co-im固体培养基上，并于27℃倒置培养48h；转膜：将诱导共培养步骤中培养完成的硝酸纤维素膜转移至含有潮霉素与头孢霉素的pda固体平板上，并放回至27℃光照培养箱中倒置进行培养，直到平板上长出白色或灰色菌落；验证：将白色或灰色菌落转移至新的含抗性的pda平板上记为
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bcste12，平板划出九宫格，每个挑取的菌落都作好数字标记，取一小部分菌块提取基因组，用验证引物进行pcr验证，待验证完成对平板上相应编号菌落进行多次传代培养，并进一步进行southern blot 验证。2.根据权利要求1所述的一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，其特征在于，所述侵染菌液的制备步骤中，agl1农杆菌菌液浓度od600为0.6-0.8。3.根据权利要求1所述的一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，其特征在于，所述bcste12基因质粒载体构建步骤中，灰霉菌株中的ste12转录因子进行了基因敲除后，采用引物，扩增出两个侧翼序列bcste12-f与bcste12-r，对侧翼进行酶切位点分析，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-f，纯化回收后，采用连接酶连接二者，通过相同的内切酶酶切质粒和侧翼bcste12-r，纯化回收后，采用连接酶连接二者；侧翼序列bcste12-f所用引物为：l:ccctcgagagcaagttagaacgaaagggg，r:ggctcgagcatatgcgccattcaattga,扩增长度为1228bp；侧翼序列bcste12-r所用引物为：l:gctctagaagttcgcgccgaactccccgt,r：gctctagatccaaagaatacctacgcgct扩增长度为1247bp。4.根据权利要求1所述的一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，其特
征在于，所述液生孢子的制备步骤中，吐温80溶液的体积浓度为0.05%，分生孢子悬浮液浓度为2x108/ml，液生孢子浓度为2x106/ml。

技术总结
本发明公开了一种采用灰霉病菌分生孢子实现高效遗传操作的方法，包括下列步骤：Botrytis cinerea B05.10菌株转接菌株于新的培养基中，获得分生孢子；Ste12转录因子进行了基因敲除，采用Pzp-hph-knock质粒为骨架，通过酶切连接，构建BcSte12基因敲除的质粒载体；将质粒载体转入到AGL1农杆菌菌株中；制备分生孢子悬浮液，过滤去除菌丝，获得液生孢子；将侵染菌液和液生孢子进行等体积混合，获得混合液；将诱导共培养步骤中培养完成的硝酸纤维素膜转移至含有潮霉素与头孢霉素的PDA固体平板上；取菌块提取基因组，用验证引物进行PCR验证，待验证完成对平板上相应编号菌落进行多次传代培养，并进一步进行Southern blot验证。本发明通过将分生孢子经液体培养，极大提高了遗传转化效率。传转化效率。传转化效率。


技术研发人员：林云龙 范利琴 李鑫鑫 董星雨 赵琳琳 马怡婷 王佳慧 孙佳 盛文婷
受保护的技术使用者：周口师范学院
技术研发日：2022.11.17
技术公布日：2022/12/30