青春双歧杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及青春双歧杆菌及其应用。


背景技术：

2.表皮作为身体和外界环境的分隔线，在抵抗外界刺激和保存皮肤内部的水分方面扮演着重要的屏障角色。表皮不仅防止微生物、真菌、病毒、过敏原等进入皮肤，还可以吸收紫外线辐射，减少机械损伤。简单来说，皮肤屏障的功能就是防止体内水分和电解质的流失，应对外界环境变化，保持内在稳态。我们可以直观地将皮肤屏障理解为守护城市的城墙，受损的屏障就像透风的孔洞，因此当皮肤屏障受到损害时就会导致一系列的皮肤问题。
3.同时，皮肤因长期暴露于阳光中，遭受uv辐射下而引起的皮肤过早老化现象称之为皮肤的光老化现象。光老化皮肤表皮层的角质形成细胞活性下降，更新速度减慢，表皮屏障功能减弱，导致皮肤干燥脱皮；真皮层的成纤维细胞数量减少，胶原和弹性蛋白合成减慢而分解加速。老化的皮肤除美观性下降外，其防御损伤的功能也明显受损：受过量uv照射后皮肤屏障的完整性被破坏、分泌功能明显下降，罹患皮肤炎症甚至皮肤恶性肿瘤的风险明显增加。
4.皮肤老化除了与上述生理变化有关之外，还与在皮肤表面的庞大微生态群落系统息息相关。有研究表明，生活在皮肤表面微生物可以增加过氧化酶活性或清除ros，减轻皮肤在uv照射后的氧化损伤。同时。微生物还可以通过影响多个信号通路直接调节皮肤细胞基质金属蛋白酶的表达水平，减少uv辐照后胶原蛋白和弹性蛋白的降解，从而延缓皮肤衰老。
5.因此，提供一种利用微生态技术开发的皮肤微生态相关产品，在改善皮肤状态方面具有广大的应用价值。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供青春双歧杆菌及其在修护皮肤屏障和延缓皮肤衰老的产品中的应用。
7.本发明提供了保藏编号为cctcc no:m 20221223的青春双歧杆菌(bifidobacterium adolensentis)。
8.所述青春双歧杆菌为筛选自五岁健康女童粪便的革兰氏阳性菌株，实验表明，所述的青春双歧杆菌在促进细胞增殖、修护皮肤屏障、抗衰老等方面具有优异效果。
9.进一步的，本发明提供了所述的青春双歧杆菌在制备促进细胞增殖的产品中的应用。
10.更进一步的，所述细胞包括皮肤角质细胞和/或成纤维细胞。
11.在一些具体的实施例中，本发明以hacat皮肤角质细胞为受试对象，对所述的青春双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的青春双歧杆菌具有促进皮肤角质细胞hacat增殖的作用，促进增殖率为9.02％～44.80％。
12.在一些具体的实施例中，本发明以hff成纤维细胞为受试对象，对所述的青春双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的青春双歧杆菌具有促进人成纤维细胞hff增殖的作用，促进增殖率为19.88％～30.63％。
13.进一步的，本发明提供了所述的青春双歧杆菌在制备修护皮肤屏障的产品中的应用。
14.更进一步的，所述修护皮肤屏障包括以下至少一项：
15.1)、恢复细胞活力；
16.2)、促进屏障修护相关基因的表达，所述屏障修护相关基因包括ovol1和ocln中的至少一种。
17.在一些具体的实施例中，本发明以hacat角质细胞为受试对象，对所述的青春双歧杆菌的sds损伤修复能力进行了研究，结果表明，所述的青春双歧杆菌可修复sds引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。
18.进一步的，本发明提供了所述的青春双歧杆菌在制备抗衰老的产品中的应用。
19.更进一步的，所述抗衰老包括以下至少一项：
20.ⅰ
、促进细胞外基质相关基因的表达，所述细胞外基质相关基因包括mkx和col13a1中的至少一种；
21.ⅱ
、抑制降解细胞外基质相关基因的表达，所述降解细胞外基质相关基因包括mmp家族中的至少一种；
22.ⅲ
、促进细胞抗氧化相关基因sirt-1的表达；
23.ⅳ
、促进免疫调节因子相关基因mor的表达；
24.ⅴ
、促进抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；
25.ⅵ
、促进细胞自噬相关基因lc3b的表达；
26.ⅶ
、抑制细胞凋亡相关基因的表达，所述细胞凋亡相关基因包括bax和caspase-3中的至少一种；
27.ⅷ
、促进细胞生长因子相关基因的表达，所述细胞生长因子相关基因包括fgf1、fgf2和fgf7中的至少一种。
28.为了探究所述的青春双歧杆菌的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞免疫调节因子、细胞凋亡、细胞自噬、抑制细胞凋亡以及细胞生长因子中的至少一个。
29.本发明以hacat角质细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hacat细胞外基质降解相关基因的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可下调降解细胞外基质相关基因mmp1的表达，抑制细胞外基质的降解。
30.本发明以hacat角质细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hacat细胞自噬的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调细胞自噬相关基因lc3b的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。
31.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调细胞外基质合成相关基因col13a1和mkx的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因mmp3和mmp10的表达，抑制细胞外基质的降解。
32.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞凋亡的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可下调细胞凋亡相关基因bax和caspase-3的表达，抑制细胞凋亡。
33.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞抑制细胞凋亡的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。
34.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调抗氧化相关基因sirt-1的表达，增强细胞的抗氧化能力。
35.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调免疫调节因子相关基因mor的表达，增强细胞的免疫调节能力。
36.本发明以hff成纤维细胞为受试对象，研究所述的青春双歧杆菌对hff细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的青春双歧杆菌可上调细胞生长因子相关基因fgf1、fgf2和fgf7的表达，增强细胞的生长能力。
37.本发明还提供了改善皮肤状况的产品，其原料包括所述的青春双歧杆菌。
38.进一步的，所述的产品包括如下i或ⅱ所示的一种或两种：
[0039]ⅰ、所述的青春双歧杆菌的发酵滤液和/或发酵溶胞物；
[0040]ⅱ、所述的青春双歧杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。
[0041]
更进一步的，本发明所述的产品的剂型包括但不限于膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种，本发明对此不做限定。
[0042]
本发明还提供了改善皮肤状况的方法，包括：使用本发明所述的产品。所述的产品的使用方法包括内服或外用，所述外用包括涂抹、外敷、熏蒸或注射，本发明对此不做限定。
[0043]
本发明提供了保藏编号为cctcc no:m 20221223的青春双歧杆菌。本发明提供的青春双歧杆菌在促进细胞增殖、修护皮肤屏障、抗衰老等方面具有优异效果，适用于制备改善皮肤相关功能的食品、药品、化妆品等。
[0044]
生物保藏说明
[0045]
青春双歧杆菌profmic-225(bifidobacterium adolensentis profmic-225)，于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 20221223。
具体实施方式
[0046]
本发明提供了青春双歧杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0047]
本发明的青春双歧杆菌菌株profmic-225，来源于五岁健康女童粪便，经16s rdna鉴定为青春双歧杆菌(bifidobacterium adolensentis)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈
杆状；在bbl平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在bbl液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
[0048]
青春双歧杆菌profmic-225(bifidobacterium adolensentis profmic-225)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年8月3日，保藏编号为cctcc no:m20221223。
[0049]
进一步，本发明提供的青春双歧杆菌profmic-225在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为发酵滤液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵滤液、发酵溶胞物。
[0050]
本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0051]
实施例1 profmic-225的分离
[0052]
于五岁健康女童粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于bbl固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为profmic-225。
[0053]
革兰氏染色镜检：菌株profmic-225为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在bbl平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在bbl液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
[0054]
实施例2 profmic-225的核酸鉴定
[0055]
1、16s rdna基因序列分析：
[0056]
挑取单菌落置bbl液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f,1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
[0057]
2、结果
[0058]
pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出profmic-225菌株为青春双歧杆菌(bifidobacterium adolensentis)。
[0059]
实施例3 profmic-225促进sds诱导的人永生化角质形成细胞hacat损伤修复实验
[0060]
1、profmic-225发酵滤液和发酵溶胞产物制备：
[0061]
挑取青春双歧杆菌profmic-225单菌落于bbl液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16～18h，并以pbs稀释调整od
600
＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，取上清液经0.22μm滤膜过滤为发酵滤液。离心沉淀的菌体以pbs清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以pbs重悬至离心时体积，再以超声波破碎30分钟，121℃，30min高压灭活，即得发酵溶胞物。
[0062]
2、促进hacat细胞修复实验
[0063]
接种hacat细胞(5
×
104cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/ml sds，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加5％发酵滤液，10％发酵溶胞物(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度a。细胞增殖率计算公式及结果如表1所示。
[0064]
表1 profmic-225促进hacat细胞增殖
[0065][0066][0067]
上表结果可知，profmic-225发酵滤液及发酵溶胞物均可促进可修复sds引起的hacat角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为109.02％～144.80％。
[0068]
实施例4 profmic-225促进hacat屏障修护相关基因表达实验
[0069]
1、profmic-225发酵溶胞物的制备：
[0070]
制备方法参照实施例3。
[0071]
2、促进hacat屏障修护相关基因表达实验
[0072]
接种人永生化角质形成细胞hacat(2ml/孔，内含5
×
105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入发酵溶胞物10％(v/v)(对照组以等体积pbs替代)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测ovol1和ocln基因的表达。以添加等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0073]
公式：f＝2-δδct
，其中：
[0074]
△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
[0075]
△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
[0076]
△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
[0077]
结果见表2。
[0078]
表2 profmic-225发酵溶胞物上调修复基因的表达
[0079][0080]
体外细胞实验表明，本发明的青春双歧杆菌profmic-225发酵溶胞物具有上调皮肤屏障修护相关因子ovo样转录因子1基因ovol1和紧密连接蛋白基因ocln表达的作用，基因表达量上调1.27～1.89倍。表明profmic-225具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0081]
实施例5：profmic-225调节光老化hacat细胞自噬/降解细胞外基质相关基因表达实验
[0082]
1、profmic-225发酵滤液及发酵溶胞物制备：
[0083]
制备方法参照实施例3。
[0084]
2、hacat细胞制备及紫外线损伤
[0085]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
[0086]
3、profmic-225添加
[0087]
将发酵滤液5％(v/v)、发酵溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hacat细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0088]
4、qpcr法检测细胞自噬/降解细胞外基质相关基因相对表达倍数
[0089]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞自噬相关基因lc3b，以及降解细胞外基质相关基因mmp1的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0090]
发酵滤液下调降解细胞外基质相关基因mmp1。结果见表3。
[0091]
表3 profmic-225发酵滤液下调降解细胞外基质相关基因的表达
[0092][0093]
发酵溶胞物上调细胞自噬基因lc3b。结果见表4。
[0094]
表4 profmic-225发酵溶胞物上调细胞自噬相关基因的表达
[0095][0096]
体外细胞实验表明，本发明的青春双歧杆菌profmic-225具有上调hacat细胞自噬相关的微管相关蛋白1轻链3β基因lc3b表达的作用，基因相对表达倍数1.31～1.48；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp1表达的作用，基因相对表达倍数0.36～0.70。
[0097]
实施例6：profmic-225促进人成纤维细胞hff的增殖
[0098]
1、profmic-225发酵滤液和发酵溶胞物制备：
[0099]
制备方法参照实施例3。
[0100]
2、hff细胞制备及profmic-225添加
[0101]
接种以dmem培养的hff细胞，以100ul/孔(每孔含3
×
104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μm h2o2，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，pbs清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别加入发酵滤液5％(v/v)，发酵溶胞物10％(v/v)，(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液和发酵溶胞物)。培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度a。计算公式及结果如表5所示。
[0102]
表5 profmic-225促进hff细胞增殖
[0103]
[0104]
体外细胞实验表明，本发明的青春双歧杆菌profmic-225发酵滤液及发酵溶胞物均具有促进人成纤维细胞hff增殖的作用，增殖率119.88％～130.63％。
[0105]
实施例7：profmic-225调节氧化损伤hff细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因表达实验
[0106]
1、profmic-225发酵滤液及发酵溶胞物制备：
[0107]
制备方法参照实施例3。
[0108]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0109]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0110]
3、profmic-225添加
[0111]
将发酵滤液5％(v/v)、发酵溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hff细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0112]
4、qpcr法检测细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因相对表达倍数
[0113]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因mkx和col13a1，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子mor，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2，细胞生长因子相关基因fgf1、fgf2和fgf7，降解细胞外基质相关基因mmp3和mmp10，以及细胞凋亡相关基因bax和caspase-3的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0114]
发酵滤液上调细胞外基质相关基因mkx，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor，抑制细胞凋亡基因bcl-2，细胞生长因子相关基因fgf1、fgf2和fgf7；下调细胞凋亡相关基因bax，结果见表6。
[0115]
表6 profmic-225发酵滤液调节细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/细胞凋亡相关基因的表达
[0116][0117]
发酵溶胞物上调细胞外基质相关基因col13a1和mkx，免疫调节因子相关基因mor，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2，细胞生长相关基因fgf1、fgf2和fgf7；下调降解细胞外基质相关基因mmp3和mmp10，细胞凋亡相关基因bax和caspase-3。结果见表7。
[0118]
表7 profmic-225发酵溶胞物调节细胞外基质/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细
胞生长因子/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因的表达
[0119][0120]
体外细胞实验表明，本发明的青春双歧杆菌profmic-225具有上调hff细胞外基质相关的类胶原膜蛋白13α链基因col13a1和莫霍克蛋白基因mkx，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，抗氧化相关的sirtuins蛋白家族基因sirt-1，抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2，以及细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因fgf1、fgf2和角质细胞生长因子基因fgf7表达的作用，基因相对表达倍数1.11～6.30倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp3和mmp10，以及细胞凋亡相关的bcl2-associated x蛋白基因bax和半胱氨酸蛋白酶家族基因caspase-3，基因相对表达倍数0.43～0.78。
[0121]
说明该菌株具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的功能，可用于制备相关食品、药品、化妆品等。
[0122]
实施例8:青春双歧杆菌profmic-225发酵滤液冲剂制备实例
[0123]
profmic-225发酵滤液冲剂的制备，组方如表8所示。
[0124]
表8 profmic-225发酵滤液冲剂配方表
[0125][0126][0127]
制备工艺：取实施例3制备的profmic-225发酵滤液，喷雾干燥后制成profmic-225发酵粉，加入鱼胶原蛋白、维生素c、草莓果汁粉、二氧化硅，搅拌分散均匀即完成profmic-225冲剂。所得profmic-225冲剂以水冲泡后味道酸甜，适口性佳，携带方便，可作为皮肤保养的口服饮品。
[0128]
实施例9:青春双歧杆菌profmic-225发酵溶胞物乳液制备实例
[0129]
profmic-225乳液的制备，组方如表9所示。
[0130]
表9 profmic-225乳液配方表
[0131][0132]
制备工艺：将环戊硅氧烷、凡士林、吐温-80、维生素e醋酸酯、甘油一起混合加热至75℃，作为a相；再取实施例3制备的profmic-225发酵溶胞物，加入汉生胶、carbopol ultrez 10、1,3-丁二醇、去离子水一起混合分散均匀并加热至75℃，作为b相；将预热的a相缓慢加入到预热的b相中并均质完全，加入三乙醇胺调节至ph6-7，搅拌冷却至35℃即完成。所得profmic-225发酵溶胞物乳液体感润滑舒适。
[0133]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。