一种热休克蛋白-依克多因组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物发酵产品领域，尤其是涉及一种热休克蛋白-依克多因组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.热休克蛋白(heat shock proteins，hsps)是生物体对高温等外界刺激迅速作出的应激反应，关闭正常的基因表达并开启一组应激基因的表达，而产生的一组结构上极为保守的特殊蛋白质。其在细胞突变过程中作为重要的缓冲因子，调控着多种细胞生理、生化变化过程中重要蛋白的空间结构和突变。从而使生物体在热、冷、高盐、有机毒物、重金属离子、氧自由基、紫外线及缺血、缺氧、感染、基因损伤、组织创伤等不良环境和状态下生存下来。
3.因特殊的生存环境和独特的高温发酵工艺，使得嗜热栖热菌菌体内产生的热休克蛋白，具有优异的光老化、光损伤和炎症修护效果。然而，嗜热栖热菌内热休克蛋白产率不高，极大的限制了热休克蛋白的应用。


技术实现要素：

4.本技术提供一种热休克蛋白-依克多因组合物及其制备方法和应用，该制备方法能够有效的促进嗜热栖热菌菌体内热休克蛋白含量的提高，从而促进菌体发酵产物光损伤修复效果的提升。
5.第一方面，本技术提供热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，包括如下步骤：s101：将嗜热栖热菌接种于种子培养基a中，进行增菌培养，得种子培养液；s102：将种子培养液接种到含有依克多因提取液的发酵培养基a中，发酵培养得到嗜热栖热菌发酵液；s103：对嗜热栖热菌发酵液进行破碎处理，所得嗜热栖热菌溶胞物即为热休克蛋白-依克多因组合物。
6.上述技术方案中，通过将嗜热栖热菌的种子培养液置于含有依克多因提取液的发酵培养基中进行发酵培养，相比于未添加依克多因的常规发酵培养基，嗜热栖热菌内热休克蛋白的含量可提高约25.3％。
7.上述的依克多因(四氢甲基嘧啶羧酸)由嗜盐或耐盐菌合成，是一类能够抵抗外界高盐胁迫的相容性溶质。其在胞内大量积聚，可抵抗高渗透压的冲击，同时稳定蛋白的水化层结构(尤其在冷冻、干燥与高温条件下)，属于具有亲水性和两性离子的特征有机小分子，而且具有热稳定性，不易分解，易溶于水，用于化妆品中，能减少皮肤因紫外线照射形成的晒斑等。将其加入发酵培养基中，能够调控热休克蛋白表达的信号通路，诱导和促进该蛋白生成量的提升。
8.本技术对嗜热栖热菌的菌种无特殊要求，在一些例举的实施例中，嗜热栖热菌采用菌种编号为cicc 10647的菌株。
9.优选的，增菌培养的时间为12-30小时。
10.优选的，发酵培养操作的接种量为1-10％，培养时间优选为12-30小时。
11.优选的，破碎处理可采用高速搅拌、研磨、超声等高能处理工艺，本技术优选采用超声工艺，以实现菌体内溶胞物的充分破碎和释放。
12.优选的，所述依克多因提取液包含依克多因、氨基酸、多肽、多糖与多元醇中的一种或几种。
13.由上述可知，采用依克多因作为培养基组分，可促进嗜热栖热菌热休克蛋白的表达，提高菌体内热休克蛋白的含量。申请人发现，相较于提纯后单独添加依克多因进行嗜热菌的发酵培养，直接采用含有依克多因、氨基酸、多肽、多糖与多元醇的菌体溶胞物进行发酵培养，发酵后菌体内热休克蛋白含量可进一步提高约10.4％。其原因可能在于，嗜盐菌中的氨基酸、多肽、多糖、多元醇与依克多因可协同促进嗜热栖热菌发酵过程中，热休克蛋白的表达生成，提高其含量，增强修护功效，减缓光老化。
14.同时，将嗜热栖热菌破碎即可获得含有上述组分的溶胞物，无需进行复杂的分离纯化工艺，可有效降低生产成本，优选的，步骤s101与步骤s102中，所述增菌培养与发酵培养的温度均为45～85℃，培养时间均为12～30小时。
15.通过采用上述技术方案，于高温环境下，保障嗜热栖热菌的充分发酵，以获得足量的热休克蛋白；而适宜的培养时间，有利于提高菌体的存活率。
16.优选的，所述种子培养基a包含如下含量的组分：酵母粉：5～15g/l；聚蛋白胨：5～25g/l；nacl：1-5g/l。
17.通过采用上述技术方案，有效保障嗜盐菌的对数增长，促进依克多因的合成。另外，本技术中种子培养基a的ph优选为7.0～7.2。
18.优选的，所述发酵培养基a包含如下含量的组分：酵母粉：5～15g/l；聚蛋白胨：5～25g/l；fecl3：0.05～0.2g/l；caso4·
2h2o：0.1～0.5g/l；mgso4·
2h2o：0.1～0.5g/l；kno3：0.1～0.5g/l；nano3：1～3g/l；na2hpo4：0.1～0.5g/l；mnso4：1～3g/l；znso4·
7h2o：0.3～1g/l。
19.采用上述技术方案，嗜盐菌与嗜热栖热菌进行双菌高温组合发酵，其发酵产物相较单一发酵产物具有更高的消炎、光损伤修复功能。依克多因提取液能够促进嗜热栖热菌热休克蛋白通路的表达，并获得依克多因与热休克蛋白的组合物，起到更为优异的光损伤修复效果。另外，本技术中发酵培养基a的ph优选为7.0～7.2。
20.优选的，所述依克多因提取液按照如下方法制备得到：s201：将嗜盐菌接种于种子培养基b中，进行增菌培养，得到种子培养液；s202：将种子培养液接种到发酵培养基b中，发酵培养得到嗜盐菌发酵液；s203：将嗜盐菌发酵液进行离心并去除菌体，得到发酵上清液，然后对发酵液进行脱盐处理，得到依克多因提取液。
21.本技术的嗜盐菌优选为伸长盐单胞菌，在一些例举的实施例中，本申嗜盐菌为菌种编号cicc 24897的菌株。
22.上述增菌培养的时间优选为16-30小时；发酵培养操作的接种量优选为1-10％，培养时间为16-30小时。脱盐处理优选采用100-500nm规格的透析袋进行透析纯化，循环2-4次即可充分脱除盐分，得到主要含有依克多因的粗提取液。
23.优选的，步骤s201与步骤s202中，所述增菌培养与发酵培养的温度均为26～32℃，培养时间均为16～30小时。
24.通过采用上述技术方案，适宜的温度和发酵时间可有效保障嗜盐菌的对数增长以及依克多因合成。
25.优选的，所述种子培养基b包含如下含量的组分：nacl：40～60g/l；mgcl2·
6h2o：5～15g/l；mgso4·
7h2o：2～5g/l；cacl2：0.1～0.5g/l；kcl：1～3g/l；nahco3：0.01～0.1g/l；nabr：0.01～0.1g/l；蛋白胨：5～10g/l；酵母粉：5～10g/l；葡萄糖：1～3g/l。
26.通过采用上述技术方案，将酵母粉与嗜盐菌混合发酵，有利于提高依克多因提取液中氨基酸、多糖等物质的含量，进而与依克多因协同作用于嗜热栖热菌hsps的合成。另外，本技术中种子培养基b的ph优选为7.0～7.2。
27.优选的，所述发酵培养基b包含如下含量的组分：nacl：40～70g/l；mgcl2·
6h2o：5～20g/l；mgso4·
7h2o：2～10g/l；cacl2：0.1～1g/l；kcl：1～5g/l；nahco3：0.01～0.1g/l；蛋白胨：5～20g/l；酵母粉：5～20g/l；葡萄糖：1～5g/l。
28.通过采用上述技术方案，嗜盐菌发酵制备的依克多因提取液，经过初步脱盐处理
后，依克多因含量可达到0.1～1g/l，而且除了含有依克多因外，经hplc分析，提取液中还存在氨基酸、多肽、多糖、多元醇等成分，能够协同作用，促进嗜热栖热菌发酵产物中热休克蛋白的表达。另外，发酵培养基b的ph优选为7.0～7.2。
29.第二方面，本技术提供一种热休克蛋白-依克多因组合物，由上述任一项方法制得。
30.第三方面，本技术提供一种热休克蛋白-依克多因组合物在化妆品中的应用。
31.通过采用上述技术方案，热休克蛋白-依克多因组合物含有依克多因、热休克蛋白、氨基酸、多肽等活性成分，在化妆品应用上，可起到协同增效的作用。
32.具体的，当添加量为1-5％时，在光损伤修护层面具有较为突出的效果。其次，在细胞功效评价层面上，uv照射后，角质形成细胞(hacat)的相对增殖率下降到50％，随着热休克蛋白-依克多因组合物的添加，损伤修护效果逐渐增强，hacat细胞增殖率也随之提升。另外，还可以显著促进成纤维细胞(hsf)的增殖，进一步促进胶原蛋白合成，增强皮肤弹性，淡化皱纹，减缓光老化。
33.再其次，在3d皮肤模型的光老化评价中，基质金属蛋白酶(mmps)至关重要，当ros过量产生时，会诱导mmps的表达，进而分解胶原，产生皱纹、松弛和细纹等衰老症状。热休克蛋白-依克多因组合物的添加，可有效降低mmp-1和mmp-9表达，降低氧化应激所带来的进一步损伤。
34.人体功效评价中，热休克蛋白-依克多因组合物可有效改善经皮失水，修护受损屏障，提升肌肤水合能力；同时能够较好的改善，皮肤弹性蛋白的退化和胶原蛋白的流失，所带来的皮肤老化现象，增强皮肤弹性，提升皮肤光滑度，减少老化粗糙；另外，还可以加速黑色素分解代谢，修护紫外线晒斑，减少色斑沉着、暗黄等现象，在光防护和抗光老化方面具有十分积极地影响。
35.上述热休克蛋白-依克多因组合物，应用在化妆品配方中时，可复配对羟基苯乙酮、丁二醇作为防腐剂，以保持原料体系稳定。根据需要可加入其他原料进行成品配方制备。
36.综上所述，本技术具有如下有益效果：1、本技术采用含有依克多因提取液的发酵底物对嗜热栖热菌进行发酵培养，该依克多因提取液中含有的依克多因、氨基酸、多糖、多肽与多元醇等，能够促进嗜热栖热菌热休克蛋白的合成，促使发酵所得嗜热菌体具有更高的热休克蛋白含量。将嗜热菌体溶胞物与依克多因混合形成的热休克蛋白-依克多因组合物，一方面能够起到更为优异的光损伤修复的作用；另一方面能够有效简化依克多因提取液的提取工艺。
37.2、采用嗜盐菌与嗜热栖热菌进行双菌高温混合发酵，有利于提高发酵产物的光损伤修复功效。
具体实施方式
38.制备例制备例1，一种依克多因提取液，按照如下方法制备得到：s201：将嗜盐菌(菌种编号为cicc 24897)接种于种子培养基b中(5l发酵罐)，并置于摇床中进行增菌培养，在转速为100-150rpm，培养温度为26-32℃的条件下培养25小时，
7.0-7.2。
48.s102：所得到的种子培养液，按照10％的接种量，接种到含有依克多因粗提取液(制备例1制得)的发酵培养基a中(5l发酵罐)，转速200-250rpm，培养温度为80℃，培养时间为20小时；其中，发酵培养基a的组分及含量：依克多因提取液：300g/l；酵母粉：15g/l；聚蛋白胨：20g/l；fecl3：0.05g/l；caso4·
2h2o：0.2g/l；mgso4·
2h2o：0.1g/l；kno3：0.5g/l；nano3：2g/l；na2hpo4：0.4g/l；mnso4：1g/l；znso4·
7h2o：0.5g/l；发酵培养基a的ph为7.0～7.2。
49.s103：对嗜热栖热菌发酵液进行超声破碎处理，促使嗜热栖热菌的溶胞物充分释放，得到热休克蛋白-依克多因组合物。
50.实施例2一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，包括如下步骤：s101：将嗜热栖热菌(菌种编号为cicc 10647)接种于种子培养基a中摇床培养，转速100-150rpm，培养温度为60℃，培养时间为30小时；其中，种子培养基a的组分及含量：酵母粉10g/l，聚蛋白胨15g/l，nacl 5g/l，ph 7.0-7.2。
51.s102：所得到的种子培养液，按照5％的接种量，接种到含有依克多因粗提取液(制备例2制得)的发酵培养基a中(5l发酵罐)，转速200-250rpm，培养温度为75℃，培养时间为15小时，得到嗜热栖热菌发酵液；其中，发酵培养基a的组分及含量：依克多因提取液：500g/l；酵母粉：6g/l；聚蛋白胨：20g/l；fecl3：0.1g/l；caso4·
2h2o：0.1g/l；mgso4·
2h2o：0.3g/l；kno3：0.2g/l；nano3：1g/l；na2hpo4：0.5g/l；mnso4：2g/l；znso4·
7h2o：0.8g/l；发酵培养基a的ph为7.0～7.2。
52.s103：对嗜热栖热菌发酵液进行超声破碎处理，促使嗜热栖热菌的溶胞物充分释放，得到热休克蛋白-依克多因组合物。
53.实施例3一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，步骤s102中，依克多因提取液的用量为100g/l。
54.实施例4本技术公开了一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，步骤s102中，依克多因提取液的用量为600g/l。
55.实施例5一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，步骤s102中，依克多因提取液由制备例3制得。
56.实施例6一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，步骤s102中，依克多因提取液为1g/l的依克多因水溶液，即以提纯依克多因为溶质，以水为溶剂的混合溶液。
57.实施例7一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，种子培
养基a与发酵培养基a中均未添加酵母粉。
58.对比例对比例1一种热休克蛋白-依克多因组合物的制备方法，其与实施例1的区别在于，步骤s102中，发酵培养基a中，未添加有依克多因提取液。
59.性能检测试验试验1：热休克蛋白含量测试试验方法：elisa检测原理：elisa的基础是抗原或抗体的固相化及酶标记。抗原或抗体在结合在固相载体表面的保持着其免疫学活性，而酶标记的抗原或抗体既具有其免疫学活性，又具有酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)将与固相载体表面的抗原或抗体进行反应。再用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物和液体中的其他物质分离。再加入酶标记抗原或抗体，通过反应结合在固相载体上。这时固相上的酶量将与标本中受检物质的量呈一定比例。在加入酶反应的底物后，底物将被酶催化为有色产物，产物的量和标本中受检物质的量有直接关系，所以可根据呈色的程度进行定性或定量分析。
60.试剂盒操作流程：采用全自动酶免分析仪，应用双抗体夹心法实验原理。在450nm检测波长，预包被hsp单克隆抗体于微孔板上，在包被板中加入待测样本，然后加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗hsp单克隆抗体，一起在包被板的微孔内温育，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。随后进行洗板，洗掉未结合的加入物；最后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，进行显色反应，生成蓝色产物，反应终止后变成黄色。震荡5s，450nm波长测量各孔的吸光度(od值)，重复三次，测量在加终止液后10min内进行。
61.根据标准品中hsps的浓度和其对应的吸光度值(od值)做标准曲线，样本中的热休克蛋白浓度即可由标准曲线计算得出。
62.表1、试验测试结果(％)试验2：热休克蛋白-依克多因组合物功效测试试验方法：筛选出皮肤屏障较差(经表皮水分流失率tewl＞25g/h
·
m2),面部有皱纹的中国健康女性(30～45岁)作为测试志愿者，每组测试志愿者两人。受试者在脸部使用产品前、使用2周、4周和8周后分别进行如下指标测试，包括：经皮水分流失量、皮肤紧致程度、皮肤弹性、皮肤光滑度、黑色素值等，用以指征光修护、光老化等产品功效。
63.其中，依据《2021年版化妆品安全技术规范》的规定，光损伤所引起的晒斑，用皮肤黑色素指数(mi值)来表征，通过皮肤黑色素检测仪进行测量(通过测定皮肤表面对特定波长光谱的吸收来表征皮肤中黑色素含量的参数)。
64.黑色素下降率(4周)＝(使用化妆品前黑色素含量-连续使用化妆品28后黑色素含量)/使用化妆品前黑色素含量
×
100％。受试对象在测试期间不使用其他美白产品，测量数
值越高，说明皮肤中黑色素含量越高。
65.表2、试验测试结果、试验测试结果试验结果分析：(1)结合实施例1～7和对比例1并结合表1、表2可以看出，实施例1～7中采用含有依克多因提取液的发酵底物进行培养，所得发酵产物中热休克蛋白的含量均高于对比例1；且其发酵产物热休克蛋白-依克多因组合物应用于化妆品中也获得了更为优异的光损伤修复效果。
66.上述现象的原因可能在于，依克多因提取液中含有的依克多因、氨基酸、多肽、多糖与多元醇能够协同作用于嗜热栖热菌，促进热休克蛋白的合成，提高其发酵产物中热休克蛋白的含量。又由于热休克蛋白可有效的防止光损伤、光老化表象(斑、皱纹、皮肤干燥等)的产生，抵抗uv，保护细胞dna结构，增强肌肤的完整性。因此，热休克蛋白含量的提高有助于增强其在化妆品中的光损伤修复功效。
67.(2)结合实施例1和实施例6并结合表1、表2可以看出，实施例1的依克多因提取液中含有依克多因、氨基酸、多肽、多糖与多元醇，实施例6的依克多因提取液中仅含有依克多因。最终，实施例1所得发酵产物中热休克蛋白的含量较实施例6提高约10.4％；其发酵产物
热休克蛋白-依克多因组合物用于化妆品中也能够获得更为优异的光损伤修复效果。
68.上述原因可能在于，氨基酸、多肽、多糖与多元醇对嗜热栖热菌中热休克蛋白的表达具有协同促进作用，有利于增加发酵产物中热休克蛋白的含量。
69.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。