一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法

1.本发明涉及纳米材料和检验医学技术领域，具体涉及一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法。


背景技术：

2.虽然各种检测技术层出不穷，但在检测疾病早期阶段的新技术方面依旧面临着巨大的挑战。对疾病相关蛋白生物标志物在诊断和治疗信息反馈的早期阶段高度敏感和准确的分析对于疾病的预防和控制中至关重要。在临床上，酶联免疫吸附试验(elisa)是特异性蛋白测定的金标准方法。蛋白质生物标记物通常存在于复杂的生物环境中，且对周围环境很敏感，因此elisa的常见检测限(lod)为皮摩尔水平，这难以满足低浓度生物标记物的检测。
3.近年来，荧光计数已逐渐成为开发超灵敏和可重复的生物传感器的有力工具。计算一定区域内的荧光图像亮点可以用来确定分析物的数量或浓度。yes/no测量模型克服了强度波动的影响，在低浓度蛋白质测量中表现出了突出的潜力。一般用有机荧光团染料或量子点qds作为荧光探针计数蛋白质生物标志物。然而，这些荧光探针容易发生荧光猝灭并且需要高分辨率的成像系统；荧光信号也很难被进一步放大以进行更灵敏的检测。因此，需要开发一种新的信号报告方法，以实现高灵敏度、良好稳定性和操作简单的检测。
4.荧光细菌(egfp标记的大肠杆菌)作为一种活信号报告物，因其独特的光学特性、高光稳定性和低背景而备受关注，是荧光染料和量子点的理想替代品。最有意义的是，其特征良好的自增殖能力(荧光细菌可以在37℃下每20～30min繁殖一代)可以用于放大信号，从而用于低浓度生物标志物的检测。然而，荧光细菌太大，不能直接用于敏感度较高的elisa的探针。因此，迫切需要一种有效的信号转换方法，将生物标志物的浓度转化为荧光细菌的数量。
5.目前，生物正交反应因具有高选择性、快速且良好的生物相容性而引起了广泛的关注,从而成为一种可靠的信号转换方法。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测特异性强的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法。
7.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，包括如下步骤：
8.(1)pet-28a-egfp重组质粒转化至大肠杆菌，并用iptg诱导大肠杆菌表达绿色荧光蛋白；
9.(2)用抗坏血酸解离cu-mof纳米颗粒，将cu(ii)还原为cu(i)，叠氮基团与炔基化牛血清蛋白上的炔基结合，叠氮基团与炔基在cu(i)催化下发生click反应，达到固定叠氮
化大肠杆菌在96孔板上的效果；
10.(3)通过发光大肠杆菌的自繁殖放大信号，将生物标志物的浓度转换为荧光大肠杆菌的荧光亮点，从而实现定量检测，通过叠氮化大肠杆菌的增殖实现信号放大效果，放大信号的时间为20-30min。
11.进一步地，在步骤(2)中，牛血清白蛋白和n-炔丙基马来酰亚胺混合在pbs中，利用超滤管过滤浓缩，制得炔基化牛血清蛋白bsa，炔基化牛血清蛋白bsa与n-炔丙基马来酰亚胺的质量比为25：1。
12.进一步地，在步骤(2)中，kdo-n3(3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸叠氮糖)使叠氮基团特异性并入大肠杆菌膜上的脂多糖中，使其叠氮功能化；叠氮基团与已包被在96孔板的bsa上连接的炔基发生click反应，大肠杆菌被固定在96孔板上。
13.更进一步地，在步骤(2)中，cu-mof用三水合硝酸铜通过高温加压反应得到：将pvp溶于dmf和乙醇的混合溶剂中制成溶液a；再将三水合硝酸铜与2-氨基对苯二甲酸溶于dmf中制成溶液b，溶液ab混合后在高压反应釜内100℃反应，反应时间为12h，制得cu-mof。
14.进一步地，在步骤(2)中，将捕获癌症特异性抗原cea的抗体修饰在cu-mof纳米颗粒上，先将cu-mof纳米颗粒溶于戊二醛中，2.5h后离心洗涤再溶于pbs中，加入捕获抗体，孵育12h，离心去除多余抗体后，bsa封闭1h避免非特异性吸附，再次离心洗涤后，溶于pbs，4℃保存待用。
15.进一步地，在步骤(2)中，所述的cu-mof纳米颗粒为均匀球形纳米颗粒，cu、n、o、c元素均匀的分布在cu-mof纳米颗粒中，平均直径为115nm，存在丰富的氨基，所述的cu-mof表面丰富的氨基使该纳米颗粒易于修饰待检生物标志物抗体，可以在室温的水相中进行反应。
16.更进一步地，在步骤(2)中，叠氮化大肠杆菌的制备：将去离子水、缓冲液、限制性核酸内切酶、pet-28a( )质粒和pegfp-n3质粒混合在ep管中，温箱中酶切1h后，加入tris缓冲液、pet-28a( )、egfp和t4 dna连接酶，22℃孵育20min后，-20℃保存；
17.转入重组质粒前，需要先制备感受态大肠杆菌：将细菌稀释至合适od值，冰浴后离心，去除上清液后在沉淀中加入预冷氯化钙重悬，再次冰浴20min后，离心弃上清，加入预冷氯化钙重悬；
18.将pet28a-egfp质粒加入上述感受态bl-21(de3)大肠杆菌中，轻轻混合，冰浴20min后在42℃加热65s，立即放在冰上加热3min。将kana(200μl)加入lb平板中，置于平板上40min，在37℃培养箱中倒置过夜；
19.在培养基中挑取单个菌落，接种于含有kana的lb培养基中，37℃下培养12h,稀释菌液至od值为0.4-0.5后加入iptg，培养4h后，得到表达egfp的大肠杆菌；
20.已经导入重组质粒的细菌悬液，将od值调至0.4-0.6，加入kdo-n3，孵育10h后，pbs洗涤三次，离心未结合的叠氮基团，得到叠氮化大肠杆菌。
21.本发明所述的pet-28a-egfp重组质粒的制备方法，包括如下步骤：(1)分别在两个0.2mlep管中均加入9μl超纯水、3μl tris缓冲液(含0.5mph8.0的tris-hcl、0.1m mgcl2、0.5m nacl)、1μl not i限制性内切酶、2μl bamh i限制性内切酶，然后分别加入15μl pet-28a( )质粒(称为1号管)或pegfp-n3质粒(称为2号管)；(2)将两个ep管分别混匀后瞬间离心、放入恒温培养箱37℃酶切反应1小时；(3)接着，在0.2mlep管中加入2.5μl tris缓冲液、
8μl酶切后的pet-28a( )、14μl酶切后的egfp和3μl t4dna连接酶，混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃孵育20分钟后即获得重组表达载体pet-28a-egfp，-20℃保存用于转化。
22.重组质粒pet28a-egfp以pet28a质粒为载体，5'测序引物及序列：t7:5'-taatacgactcactataggg-3'；3'测序引物及序列：t7t:5'-gctagttattgctcagcgg-3'；
23.重组质粒pet28a-egfp以egfp为标签，5'测序引物及序列：cmv-f:5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3'；egfp-n:5'-cgtcgccgtccagctcgaccag-3'。
24.有益效果：本发明检测特异性强，具有良好的稳定性和准确性，检测限低于临床检测金标准elisa，可视化检测生物标志物浓度，可应用于临床的稳定检测，检测范围更广。
25.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
26.(1)本发明的一种超灵敏的荧光计数免疫分析方法(称为fblisa)，该方法使用级联信号放大策略，通过降解纳米铜基金属有机框架(cu-mof)来催化荧光细菌固定和增殖的生物正交反应。生物正交反应是一种既有免疫分析的高选择性和特异性又十分高效的信号转换方法。荧光细菌是一种新的信号报告菌，有独特的荧光特性、高光下的稳定性和低背景等优点，可利用常规荧光显微镜直接计数。
27.(2)由于大肠杆菌具有良好的自增殖能力，本发明通过控制孵育时间来有效地放大荧光信号，以达到低浓度检测所需的灵敏度。经验证，此法针对癌胚抗原cea和前列腺特异性抗原psa的检测限lods分别为74.1fg/ml和7.2fg/ml，比常规elisa的灵敏度高出1000倍。令人欣喜的是，fblisa已成功应用于前列腺癌患者真实血清样本中的psa检测，证明了该方法在癌症的临床诊断中具有巨大的潜力。
28.(3)该方法使用级联信号放大策略，通过降解纳米铜基金属有机框架(cu-mof)来催化荧光细菌固定的click反应(一种既有高选择性和特异性又十分高效的信号转换方法)，利用荧光细菌的荧光特性、高光下稳定性和低背景等优点，用常规荧光显微镜直接计数，检测生物标志物。
29.(4)由于大肠杆菌具有良好的自增殖能力，本发明通过控制孵育时间来有效地放大荧光信号，以达到低浓度检测所需的灵敏度。该检测方法将蛋白浓度转化为可视化荧光计数，对仪器要求降低，普通的荧光显微镜即可用来计数。经验证，此法针对癌胚抗原(cea)和前列腺特异性抗原(psa)的检测限(lods)分别为74.1fg/ml和7.2fg/ml，比常规elisa的灵敏度高出1000倍。并且，fblisa已成功应用于前列腺癌患者真实血清样本中的psa检测，证明了该方法在癌症的临床诊断中具有巨大的潜力。
30.(5)d-氨基酸已被发现能特异性地结合到细菌的肽聚糖和蛋白质中(它们有生物正交反应所需的化学基团)，可用于细菌标记。在cu(i)催化的叠氮化物/炔环加成cuaac反应中利用生物正交化学基团，将为基于荧光细菌的荧光生物传感提供一种潜在的转化策略。
附图说明
31.图1为本发明所制备的cu-mof的各项表征图；
32.图2为本发明基于fblisa系统的蛋白质定量分析图；
33.图3为本发明fblisa检测cea和psa的特异性图；
34.图4为本发明用fblisa法对临床血清样本的检测分析图。
30min。
47.本发明所述的pet-28a-egfp重组质粒的制备方法，包括如下步骤：(1)分别在两个0.2ml ep管中均加入9μl超纯水、3μl tris缓冲液(含0.5m ph8.0的tris-hcl、0.1m mgcl2、0.5m nacl)、1μl not i限制性内切酶、2μl bamh i限制性内切酶，然后分别加入15μl pet-28a( )质粒(称为1号管)或pegfp-n3质粒(称为2号管)；(2)将两个ep管分别混匀后瞬间离心、放入恒温培养箱37℃酶切反应1小时；(3)接着，在0.2mlep管中加入2.5μl tris缓冲液、8μl酶切后的pet-28a( )、14μl酶切后的egfp和3μl t4dna连接酶，混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃孵育20分钟后即获得重组表达载体pet-28a-egfp，-20℃保存用于转化。
48.实施例2
49.用iptg诱导导入重组质粒的大肠杆菌表达egfp，当lb培养基与pbs的体积比为9∶1时，细菌繁殖速度最快，信号放大作用最强，灵敏度越高。
50.实施例3
51.经实验验证，只有cu(i)可以催化目的生物正交反应，其他金属离子没有显示出信号；并且相同条件下，柠檬酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸做还原剂都能催化cucl2和cu-mof产生cu(i)，但aa催化效率最高。并且，cu-mof的量和固定化荧光细菌的数量成正比，本发明所建立的免疫分析机制是成立的。
52.实施例4
53.金属有机框架纳米粒子介导的生物正交反应的验证
54.通过click反应将dbco-cy5标记在叠氮后的大肠杆菌上，egfp标记的大肠杆菌显示出明显的红色荧光，叠氮基团修饰成功。加入aa降解cu-mof，根据设计，cu(ii)被还原为cu(i)，叠氮基团与已包被在96孔板的bsa上连接的炔基发生click反应，大肠杆菌被固定在96孔板上。本发明用炔基化bsa在平板上画出不同图案，结合后大肠杆菌在所画图案处表达荧光，本发明系统可将大肠杆菌固定在平板上。
55.实施例5
56.fblisa的灵敏性
57.癌胚抗原(cea)是一种广谱的肿瘤标志物，它可以反映多种肿瘤的存在，是判断结直肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效、疾病发展和预后的肿瘤标志物。
58.前列腺特异性抗原(psa)是前列腺癌的重要蛋白信号，是检测前列腺癌最有效的生物标志物。
59.逐渐增加样品中cea和psa的浓度，荧光细菌的数量分别增加，cea：0.001～100ng/ml、psa：0.0001～100ng/ml。cea和psa分别在0.001-0.1ng/ml和0.0001-0.005ng/ml范围内呈线性趋势。
60.根据空白信号的3倍标准差(n＝3)的线性斜率计算的lod得到，cea和psa的lod分别为0.7pg/ml和63.1fg/ml，低于金标准elisa法的检测限。
61.大肠杆菌每20-30min即可繁殖一次，培养1h后，信号因其繁殖而放大，荧光大肠杆菌的代谢生长曲线显示，该细菌在1h内生长最快。37℃下培养大肠杆菌1h，cea和psa的lod值分别下降至74.1fg/ml和7.2fg/ml，fblisa线性动态范围检测cea和psa浓度分别从0.0001到0.1ng/ml和0.00001到0.005ng/ml，都比信号放大前宽一个数量级。
62.psa的最低检测浓度为7.2fg/ml，比传统的elisa试剂盒(0.01ng/ml)约低1000倍。
值得注意的是，与传统的elisa相比，psa的检测范围扩大了10倍，更适合于直接检测高浓度样品(》10ng/ml)，不需要elisa的稀释方法(图2)。
63.fblisa在生物系统和精密医学等许多领域的实际临床诊断和蛋白质定量分析中具有很大的应用前景。
64.实施例6
65.为了验证上述方案是否可行，本发明采用扫描电子显微镜(sem，s-3400，日立)和透射电子显微镜(tem，jem2010，jeol)对cu-mof的形貌进行了表征。用zeta sizer nano zs仪器(莫尔文)测量了cu-mof的zeta电位。
66.重组质粒pet28a-egfp以pet28a质粒为载体，5'测序引物及序列：t7:5'-taatacgactcactataggg-3'；3'测序引物及序列：t7t:5'-gctagttattgctcagcgg-3'
67.重组质粒pet28a-egfp以egfp为标签，5'测序引物及序列：cmv-f:5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3'；egfp-n:5'-cgtcgccgtccagctcgaccag-3'
68.将去离子水、缓冲液、限制性核酸内切酶、pet-28a( )质粒和pegfp-n3质粒混合在ep管中，温箱中酶切1h后，加入tris缓冲液、pet-28a( )、egfp和t4 dna连接酶混合，22℃孵育20min后，-20℃保存。
69.转入重组质粒前，需要先制备感受态大肠杆菌：将细菌稀释至合适od值，冰浴后离心，去除上清液后在沉淀中加入预冷氯化钙重悬，再次冰浴20min后，离心弃上清，加入预冷氯化钙重悬。
70.将pet28a-egfp质粒加入上述感受态bl-21(de3)大肠杆菌中，轻轻混合，冰浴20min后在42℃加热65s，立即放在冰上加热3min。将kana(200μl)加入lb平板中，置于平板上40min，在37℃培养箱中倒置过夜。
71.在培养基中挑取单个菌落，接种于含有kana的lb培养基中，37℃下培养12h,稀释菌液至od值为0.4-0.5后加入iptg，培养4h后，得到表达egfp的大肠杆菌。
72.已经导入重组质粒的细菌悬液，将od值调至0.4-0.6，加入kdo-n3，孵育10h后，pbs洗涤三次，离心未结合的叠氮基团，得到叠氮化大肠杆菌。
73.将牛血清蛋白与n-炔丙基马来酰亚胺混合在pbs中，摇晃过夜24h后，离心去除未结合n-炔丙基马来酰亚胺，超滤浓缩洗涤三次后，4℃保存待用。
74.实施例7
75.fblisa的特异性
76.为了评估fblisa的特异性，引入其他比分析物浓度高十倍的蛋白质，由被分析物引起的信号可以从其他蛋白质中明显地分离出来，同时也证明，本发明的检测平台可以用于分析物与其他蛋白的同时检测。上述结果表明，fplisa可以特异性地检测分析物，因为抗体对分析物有良好的特异性亲和力，而不受其他蛋白的干扰(图3)。
77.实施例8
78.fblisa在临床样本分析中的应用
79.用fblisa对已用临床金标准法进行诊断的30个临床血清样本(15例前列腺癌患者和15例健康成人)中的psa水平进行检测，将fblisa结果与传统的hrp-elisa法进行比较，构建了psa检测的受试者曲线(roc曲线)：曲线下面积(auc)为0.938(95％ci：0.846-1，****p《0.0001差异极具显著性)，最佳临界值为4.115ng/ml，临床敏感性为86.7％，特异性为97％。
结果表明，fblisa具有相对较高的准确性。采用类间相关系数(icc)和bland-altman分析来评估fblisa和elisa的一致性。psa检测的icc为0.933，bland-altman检测的大部分结果均在1.96sd范围内。因此，fblisa与elisa高度一致。同时，fblisa和elisa结果有极强的相关性(r＝0.916)，用临床阈值(4.0ng/ml)来区分阳性和阴性样本，如图4红色水平虚线所示。实际值和期望值之间有很大的一致性，这体现了fblisa对临床样本分析的能力。
80.以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。