一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法

技术特征：
1.一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)pet-28a-egfp重组质粒转化至大肠杆菌，并用iptg诱导大肠杆菌表达绿色荧光蛋白；(2)用抗坏血酸解离cu-mof纳米颗粒，将cu(ii)还原为cu(i)，叠氮化大肠杆菌修饰的叠氮基团与炔基化牛血清蛋白上的炔基结合，叠氮基团与炔基在cu(i)催化下发生click反应，达到固定叠氮化大肠杆菌在96孔板上的效果；(3)通过发光大肠杆菌的自繁殖放大信号，将生物标志物的浓度转换为荧光大肠杆菌的荧光亮点，从而实现定量检测，通过叠氮化大肠杆菌的增殖实现信号放大效果，放大信号的时间为20-30min。2.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，牛血清白蛋白和n-炔丙基马来酰亚胺混合在pbs中，利用超滤管过滤浓缩，制得炔基化牛血清蛋白，炔基化牛血清蛋白与n-炔丙基马来酰亚胺的质量比为25：1。3.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，kdo-n3(3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸叠氮糖)使叠氮基团特异性并入大肠杆菌膜上的脂多糖中，使其叠氮功能化；叠氮基团与已包被在96孔板的bsa上连接的炔基发生click反应，大肠杆菌被固定在96孔板上。4.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，cu-mof用三水合硝酸铜通过高温加压反应得到：将pvp溶于dmf和乙醇的混合溶剂中制成溶液a；再将三水合硝酸铜与2-氨基对苯二甲酸溶于dmf中制成溶液b，溶液ab混合后在高压反应釜内100℃反应，反应时间为12h，制得cu-mof。5.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，将捕获癌症特异性抗原cea的抗体修饰在cu-mof纳米颗粒上，先将cu-mof纳米颗粒溶于戊二醛中，2.5h后离心洗涤再溶于pbs中，加入捕获抗体，孵育12h，离心去除多余抗体后，bsa封闭1h避免非特异性吸附，再次离心洗涤后，溶于pbs，4℃保存待用。6.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的cu-mof纳米颗粒为均匀球形纳米颗粒，cu、n、o、c元素均匀的分布在cu-mof纳米颗粒中，平均直径为115nm，存在丰富的氨基，所述的cu-mof表面丰富的氨基使该纳米颗粒易于修饰待检生物标志物抗体，可以在室温的水相中进行反应。7.根据权利要求1所述的生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，叠氮化大肠杆菌的制备：将去离子水、缓冲液、限制性核酸内切酶、pet-28a( )质粒和pegfp-n3质粒混合在ep管中，温箱中酶切1h后，加入tris缓冲液、pet-28a( )、egfp和t4dna连接酶，22℃孵育20min后，-20℃保存；转入重组质粒前，需要先制备感受态大肠杆菌：将细菌稀释至合适od值，冰浴后离心，去除上清液后在沉淀中加入预冷氯化钙重悬，再次冰浴20min后，离心弃上清，加入预冷氯化钙重悬；
将pet28a-egfp质粒加入上述感受态bl-21(de3)大肠杆菌中，轻轻混合，冰浴20min后在42℃加热65s，立即放在冰上加热3min；将kana(200μl)加入lb平板中，置于平板上40min，在37℃培养箱中倒置过夜；在培养基中挑取单个菌落，接种于含有kana的lb培养基中，37℃下培养12h,稀释菌液至od值为0.4-0.5后加入iptg，培养4h后，得到表达egfp的大肠杆菌；已经导入重组质粒的细菌悬液，将od值调至0.4-0.6，加入kdo-n3，孵育10h后，pbs洗涤三次，离心未结合的叠氮基团，得到叠氮化大肠杆菌。

技术总结
本发明公开了一种生物正交反应固定细菌用于超灵敏荧光计数免疫分析的检测方法，包括如下步骤：(1)重组质粒转化至大肠杆菌，并用IPTG诱导转入T启动子转录，诱导大肠杆菌表达绿色荧光蛋白；(2)用抗坏血酸解离Cu-MOF纳米颗粒，叠氮化大肠杆菌修饰的叠氮基团与炔基化牛血清蛋白上的炔基结合，将叠氮化大肠杆菌固定在孔板上；(3)通过发光大肠杆菌的自繁殖放大信号，将生物标志物的浓度转换为荧光大肠杆菌的荧光亮点，从而实现定量检测。本发明检测特异性强，具有良好的稳定性和准确性，检测限低于临床检测金标准Elisa，可视化检测生物标志物浓度。志物浓度。志物浓度。


技术研发人员：宋玉君 李莞琦
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2022.10.25
技术公布日：2023/1/13