用于针对COVID-19进行保护的基于减毒痘病毒载体的疫苗的制作方法

用于针对covid-19进行保护的基于减毒痘病毒载体的疫苗
技术领域
1.本发明涉及用于在动物中提高免疫应答的组合物，其防止或减少冠状病毒感染的风险并降低疾病的严重程度。具体而言，本发明涉及用于在动物中提高免疫应答的疫苗和/或免疫原性组合物，其防止或减少被世界卫生组织命名为covid-19的sars-cov-2疾病的风险。该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该减毒痘病毒基因组包含冠状病毒sars-cov-2核酸序列，该核酸序列编码刺突蛋白多肽和/或膜蛋白多肽和/或核衣壳蛋白多肽和/或包膜蛋白多肽或者这些中任意项的免疫原性或功能性部分。


背景技术：

2.本说明书中参考文献的书目详情列在该说明书的末尾。
3.本说明书中对任何在先出版物(或从中得出的信息)或任何已知内容的引用不是也不应被视为承认或认可或以任何形式暗示该在先出版物(或从中得出的信息)或已知内容构成本说明书所涉及研究领域的公知常识的一部分。
4.本说明书中提及的所有出版物均通过引用方式整体并入本文。
5.痘病毒科包括两个亚科，即脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(entomopoxvirinae)。脊椎动物痘病毒亚科包括八个属，其中正痘病毒属(orthopoxviridae)包含感染人类的种(例如，天花病毒—天花的致病因子、牛痘病毒(它形成了jenner在1796年报告的最初的天花疫苗)、痘苗病毒(用作第二代天花疫苗)和猴痘病毒)，而鸟痘病毒属(avipoxviridae)病毒包含感染鸟类的种，诸如禽痘病毒和金丝雀痘病毒。除了它们在天花疫苗中作为抗原的用途之外，对使用重组的基于痘苗的病毒和鸟痘病毒作为“骨架”载体也很感兴趣。作为细胞质内载体，正痘病毒属尤其能够诱导宿主细胞质中外来抗原的产生，以供宿主免疫系统识别。此类表达外来抗原的载体在开发用于一些疾病诸如aids、结核病、疟疾和癌症的疫苗中得到了深入研究，而已经证明这些疾病是用其他疫苗接种策略难以治疗的。
6.脊椎动物痘病毒亚科具有线性双链dna基因组，其大小从副痘病毒中的130kb到鸟痘病毒中的超过300kb不等，它们在宿主中的生命周期完全在宿主细胞的细胞质中度过。痘病毒的运作大多独立于其宿主细胞和宿主细胞分子，特别是对于参与早期mrna合成的过程。然而，宿主分子似乎用于启动或终止中期和晚期病毒转录。痘病毒产生结构多样的“宿主范围因子”，这些因子特异性靶向并操控宿主信号传导通路，以提供允许病毒复制的细胞条件。大多数痘病毒能结合并感染哺乳动物细胞，但后续的感染是容许的(能够产生感染性病毒体)还是非容许的(基本上不能产生感染性病毒体)取决于特定的痘病毒和所涉及的特定细胞类型。关于宿主范围基因的综述，参见werden等人2008，其全部内容并入本文。
7.从20世纪60年代初到现在，已经公布了与其用作天花疫苗以及随后用作病毒载体相关的痘苗病毒株。某些痘苗病毒株，包括用作天花疫苗的毒株，能够在人类细胞中繁殖，因此会带来健康风险，如病毒性脑炎的发生。为了开发更安全的疫苗，来自安卡拉(ankara)的痘苗病毒株(被称为“cva”)在非人细胞中传代超过500次。在此过程中，痘苗病毒基因组
发生了实质性变化，涉及到与原始cva基因组相比形成了至少6个主要缺失。由于在哺乳动物细胞中的复制缺陷，经修饰的病毒致病性较低，但仍能产生保护性免疫应答。这种减毒痘苗病毒被称为mva(修饰型痘苗病毒安卡拉株)，并且也通过传代数进行分类，因为发现具有不同传代数的病毒在遗传和表型上是不同的。然而，到了传代数515，即mva515，经确定为在遗传上是稳定的。在20世纪90年代早期，观察到mva毒株，诸如mva572及其衍生物mva
·
f6，能够在非容许细胞(病毒不会在其中繁殖)中以高水平表达痘苗病毒蛋白和异源(重组)蛋白，从而能够将mva开发为感兴趣的异源分子的载体，例如那些编码用于疫苗或治疗递送的抗原的载体。在痘病毒疫苗载体系统中，mva是研究最多的，但是已经开发了其它痘病毒以类似的方式发挥作用，诸如nyvac、alvac和禽痘。
8.由sementis有限公司开发的另一种痘苗病毒是所谓的scv(sementis copenhagen vaccinia)痘苗病毒载体。scv是利用痘苗病毒的哥本哈根毒株产生的，并通过缺失d13l进行工程化改造，该d13l编码一种必需的病毒组装蛋白，从而使scv无法复制和产生感染性后代。基因组扩增在scv感染的细胞中得以保留，因此允许疫苗抗原的晚期表达并产生针对插入抗原的强免疫应答。与mva相比，scv具有许多优点，因为它具有可复制型痘苗病毒的免疫原性，并且不能在所测试的哺乳动物细胞中复制。scv平台与mva平台有两个关键的区别点，即(i)通过靶向缺失d13l基因，它被专门工程化改造为复制缺陷型，因此更安全，同时保持单次接种功效的效力，和(ii)它还被设计成在标准的和可规模化的商业化细胞系中生产。
9.冠状病毒是rna病毒，由大约27-32kb的正义单链rna组成。顾名思义，在电子显微镜下观察时，球形外部刺突蛋白呈现出特征性的冠状形状。已知该病毒会感染范围广泛的宿主，包括人类。受感染的宿主表现出从无症状到严重症状的不同临床病程。冠状病毒属于冠状病毒科，分为四个属：即α-、β-、δ-和γ-冠状病毒属。cov常见于许多动物物种，包括蝙蝠、骆驼和人类。有时候，动物cov可以通过基因组复制过程中的错误或重组机制获得基因突变，这可以进一步扩大它们对人类的嗜性。20世纪60年代中期发现了第一组人类冠状病毒。总共鉴定出七种人类cov类型是导致人类呼吸系统疾病的病因，其中包括2种αcov和5种βcov。通常，这些cov可导致一系列临床症状，从无症状感染到严重急性呼吸系统疾病，包括发烧、咳嗽和呼吸短促。还报告了其他症状，诸如不同严重程度的胃肠炎和神经系统疾病。
10.冠状病毒包含一组典型的四种主要结构蛋白：刺突(s)蛋白、膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和核衣壳(n)蛋白。病毒体具有由基因组rna和磷酸化核衣壳(n)蛋白构成的核衣壳。核衣壳被包裹于磷脂双层内，并由刺突(s)蛋白覆盖。膜(m)蛋白和包膜(e)蛋白位于病毒包膜中的s蛋白之间。
11.刺突蛋白由从病毒表面突出的跨膜三聚体糖蛋白构成，它决定了冠状病毒的多样性和宿主嗜性。刺突包含两个功能性亚基；s1亚基和s2亚基，s1亚基包含受体结合结构域(rbd)，负责与宿主细胞受体结合，而s2亚基负责病毒膜和细胞膜的融合。
12.冠状病毒颗粒由螺旋状核衣壳结构组成，该核衣壳结构由核衣壳磷蛋白和病毒基因组rna的相互作用形成，该结构被其中插入结构蛋白的脂质双层所包围。三跨膜糖蛋白m驱动冠状病毒的组装，冠状病毒出芽进入内质网-高尔基体中间隔室(ergic)的内腔。膜蛋白是最丰富的病毒蛋白，它将病毒组分整理出来以整合到病毒体中。膜寡聚化允许在ergic膜处形成膜蛋白晶格。刺突蛋白和包膜蛋白通过与膜蛋白的侧向相互作用整合到晶格内，而核衣壳和病毒rna与暴露于胞质溶胶的膜蛋白c-末端结构域相互作用。包膜蛋白是一种
形成离子通道的病毒孔蛋白，并在病毒形态发生和芽殖中发挥重要作用，然而这一过程迄今为止尚未完全了解。对sars-cov的研究表明，从冠状病毒基因组中去除包膜基因会大大降低病毒生长和颗粒形成。核衣壳蛋白自缔合并包裹rna基因组以整合到病毒体内。
13.人类冠状病毒是导致呼吸系统感染的主要病原体之一。两种高致病性病毒sars-cov和mers-cov在人类中导致严重呼吸系统综合征，而其他四种人类冠状病毒(hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63、hcovhku1)诱发轻度上呼吸系统疾病。在2002-03年期间，sars-cov引起了一场波及8422名患者的大暴发，并蔓延到全球29个国家。2003年7月，由于sars-cov的传播链在台湾被中断，疫情得到控制，并且自2004年5月以来没有再报告人类病例。mers-cov于2012年在中东国家出现，在中东地区内的国家造成持续存在的地方性疫情，并散发性蔓延到中东地区以外的国家。2019年末，出现了未知呼吸系统感染的报告。感染源很快被确定为一种新型冠状病毒，称为sars-cov-2，并且由这种病毒导致的疾病被命名为covid-19。世界卫生组织于2020年3月11日宣布全球大流行。sars-cov-2的感染死亡率范围为0.16％到1.60％，到2021年2月中旬，sars-cov-2已在全球感染了1.082亿人，并造成230万人死亡。sars-cov-2已迫使世界大部分地区采取封控措施，这导致了令人震惊的经济损失和人间苦难。
14.sars-cov-2是一种有包膜、非区段型正义rna病毒，属于广泛分布于人类和其他哺乳动物中的正冠状病毒亚科。作为sarbecovirus属的一部分，其直径为约65至125nm，并含有单链rna，在外表面上具有棒状糖蛋白刺突，使病毒呈现出皇冠样或冠状外观。sars-cov-2是继先前鉴定的sars-cov和mers-cov之后的一种新型β-冠状病毒，其可导致肺衰竭和可能致命的呼吸道感染。sars-cov-2的传染数(描述每个初级感染者向次级感染者传播的能力)据who估计范围为1.4至2.5。然而，针对全球研究的meta分析估计传染数更接近2.87。sars-cov-2的传染数分别远远高于先前的感染性冠状病毒，如sars-cov和mers(0.95和0.91)。传染数较高的可能原因可能是该病毒株的固有生物学特征。例如，一个人可能通过多种方式被感染，诸如与感染者的密切身体接触，通过呼吸道飞沫、物媒和空气传播的环境传播。此外，感染sars-cov-2的患者在感染后两周内可能不会表现出症状特征，这可能会指数性增加新感染的风险，因为感染者在无症状期通常会在社区中与其他人混杂在一起。对9名患者样品的系统发育分析显示，sars-cov-2与两种源自蝙蝠的冠状病毒株的相似度高于与已知的人类感染性冠状病毒的相似度，包括导致2003年sars暴发的病毒。来自不同患者的序列几乎完全相同，序列同一性大于99.9％，这表明sars-cov-2在很短的时间内起源于单一来源。目前可获得的数据表明，sars-cov-2是从蝙蝠储库感染到人类种群的，并且sars-cov-2可能是通过积累对人类感染有利的基因变化从蝙蝠冠状病毒进化而来的。结构蛋白刺突蛋白和膜蛋白显示出广泛的突变变化，而包膜蛋白和核衣壳蛋白是保守的。目前尚不清楚是否有一种目前未知的动物物种作为蝙蝠和人类之间的中间宿主。
15.结构和功能分析表明，sars-cov-2的rbd与人血管紧张素转换酶2(ace2)受体发生强相互作用。ace2在肺、心脏、回肠、肾脏和膀胱中的表达最高。在肺部中，ace2在肺上皮细胞上高表达。在sars-cov-2与ace2受体结合后，刺突蛋白发生蛋白酶裂解。人们提出了一种两步连续蛋白酶裂解以激活sars-cov和mers-cov的刺突蛋白作为模型，由下列步骤组成，即在s1/s2裂解位点的裂解进行启动，以及在s
′
2位点的裂解进行激活，该s
′
2位点是与s2亚基内融合肽相邻的位置。在s1/s2裂解位点裂解后，s1和s2亚基保持非共价结合，并且远端
s1亚基有助于在融合前状态下稳定膜锚定的s2亚基。据推测，随后在s
′
2位点的裂解通过不可逆的构象变化激活刺突，进行膜融合。冠状病毒刺突在病毒中独树一帜，因为一系列不同的蛋白酶可以裂解并激活它。冠状病毒中sars-cov-2特有的特征是在s1/s2位点处存在弗林蛋白酶(furin)裂解位点(“rppa”序列)。sars-cov-2的s1/s2位点在生物合成过程中完全受到裂解，这与sars-cov刺突形成对比，后者在没有裂解的情况下被纳入组装体中。虽然s1/s2位点也受到其他蛋白酶如跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)和组织蛋白酶l的裂解，但是弗林蛋白酶的广泛表达也可能有助于更有效的病毒复制，从而导致毒力增加。在sars-cov-2中，病毒刺突蛋白尤其是rbd为病毒进化的中心。从2020年10月开始，在欧洲、巴西、英国和南非检测到了被鉴定为rbd内氨基酸变化的病毒进化。突变的累积导致大约每两周发生一次突变，如来自英国、南非和巴西的变体所示，这些变体在刺突rbd中分别具有8个突变、7个突变和10个突变，以及在1ab开放阅读框(orf)中3个氨基酸的缺失。这些sars-cov-2变异毒株的特征表明，朝着适应性增强的病毒种类进行重复的趋同进化。这种现象的一种可能假设是，这些突变出现在慢性covid-19感染病例中，在此期间，免疫系统对病毒逃逸免疫施加巨大压力，而病毒通过改进其侵染细胞的机制做出反应。因此，这转化为病毒载量增加和更高的传播能力，正如英国突变毒株b.1.1.7所证明的那样。在未感染病毒的人群中，天然免疫选择压力是变体出现的主要驱动力。然而，也存在“疫苗选择压力”的可能性，其中可能由于疫苗相关原因而产生突变。当疫苗引发限制性免疫应答时，例如当疫苗旨在仅针对单一抗原产生免疫应答时，病毒可能会发生抗原性进化。在整个人群中施用疫苗注射的时间延迟也可能潜在影响病毒的适应能力，并诱发可帮助它们逃避或抵抗免疫应答的突变。逃逸突变体的现象凸显了对有效对抗新出现的值得关注的变体(voc)的疫苗的需求。由于大多数记录的突变都发生在刺突蛋白中，因此可以利用其他病毒抗原来诱发更宽泛的免疫原性，以确保足够的预防性免疫应答。
16.中和抗体是结合并中和宿主细胞内病毒的抗体，并作为预防性疫苗接种免疫的关键相关物。针对sars和mers刺突糖蛋白的中和抗体在保护免于这些冠状病毒方面发挥了主导作用。迄今为止，在sars-cov-2感染后，尚不清楚需要多大量级的中和抗体来进行保护，也不知道中和抗体的持久性如何。
17.还可以将t细胞免疫用作保护免于sars-cov-2的相关物。据报道，在感染的急性期和记忆期都存在t细胞活化，然而cd4和cd8 t细胞在疾病进展或保护中的确切作用尚未完全了解。抗原特异性cd8 t细胞直接靶向病毒感染的细胞，而th1极化型cd4 t细胞具有激活cd8 t细胞和单核细胞的潜力，以对抗组织中受病毒感染的细胞。另外，滤泡辅助性t细胞是生发中心应答和形成高质量体液免疫应答所必需的。与此相一致，多项研究指出了结合抗体滴度和cd4 t细胞应答之间的相关性。因此，t细胞可以通过直接清除受感染的细胞，以及通过激活其他白细胞和增强体液免疫应答而具有保护功能。此外，强健的th1偏态应答的诱导与疫苗相关性呼吸系统疾病加重或与th2应答相关的抗体依赖性增强(ade)的不太可能发生是一致的。
18.本发明的疫苗基于抗原组合，以产生更好的长期保护并防止疾病的抗体依赖性增强的可能性。这是与正在开发的仅包含刺突抗原的疫苗的一个主要区别。多种抗原的存在也可能解决逃逸突变体的现象，因为多种抗原可以引发更宽泛的免疫应答，这将使病毒更难以进行抗原性进化和削弱身体防御的有效性。
19.本发明疫苗的抗原序列包括sars-cov-2的刺突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白和包膜蛋白。
20.免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2刺突多肽或该刺突多肽的s1受体结合结构域亚基来实现。冠状病毒的刺突蛋白包含主要的中和结构域，这些结构域对于病毒感染急性期所需的病毒的中和是必要的，并且是刺激细胞介导的免疫所必需的。从历史上看，已经发现冠状病毒如sars-cov或mers-cov的刺突蛋白具有免疫原性，引发体液免疫应答(包括抑制病毒进入宿主细胞的中和抗体)以及细胞介导的免疫应答。
21.免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2膜蛋白多肽来实现。在sars-cov中，已经证明膜蛋白在病毒表面大量存在；此外，当用于sars患者的免疫时，膜蛋白诱发高滴度的中和抗体。免疫原性和结构分析表明，在膜蛋白中存在能够触发强健的细胞免疫应答的t细胞表位簇。由于膜蛋白在许多病毒种类中也是高度保守的，因此它是诱导针对sars-cov-2的免疫应答的良好候选抗原。
22.免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2核衣壳蛋白多肽来实现。最近发现，sars-cov-2感染导致产生主要针对核衣壳抗原的抗体。然而，n抗体一直未得到重视，因为n蛋白抗体不能阻止病毒进入，因此被认为是“非中和”抗体。因此，通过目前用于评估体液免疫的中和测定法无法测量抗n抗体。最近的研究表明，进入细胞内的抗n抗体由抗体受体trim21识别，然后它将关联的n蛋白粉碎。然后展示n蛋白表位以供t细胞探测。由于这种免疫应答机制涉及最终将介导免疫记忆的t细胞，因此针对核衣壳蛋白的抗体可能会刺激针对未来感染的长期保护。
23.免疫原性可以通过在痘病毒载体内同时表达sars-cov-2刺突蛋白或其部分、膜蛋白多肽、核衣壳蛋白多肽和/或包膜蛋白多肽来实现。对小鼠肝炎病毒、牛冠状病毒、感染性支气管炎病毒、传染性胃肠炎病毒和sars-cov的研究已经确定，刺突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白以及在某些情况下的包膜结构蛋白是转染细胞有效组装和释放病毒样颗粒(vlp)所必需的。s、m和n和/或e多肽的存在可能导致形成真实的vlp，即模拟冠状病毒结构但缺乏具有感染性的遗传物质的空病毒壳。vlp与真实的病毒体共有相似的大小和形态学特征，但不具有感染性且无法复制。vlp不仅模拟了天然病毒的形态，还可以转导容许细胞。由于缺乏病毒遗传物质，vlp不能在宿主细胞内复制，但可以用作核酸、蛋白质或药物的载剂。而且，已经对vlp用作候选疫苗进行了研究，因为它们反复展示表面抗原及其固有结构可以模仿天然病毒并与免疫系统相互作用以诱发体液和细胞应答。这些蛋白质的联合免疫原性可产生更强大的抗原特异性免疫应答。本发明包括使用sars-cov-2刺突蛋白或其部分，和/或sars-cov-2膜蛋白和/或sars-cov-2核衣壳蛋白或其部分，和/或sars-cov-2包膜蛋白或其部分，作为痘病毒载体疫苗中的抗原。
24.本发明包括使用多种sars-cov-2蛋白来引发广泛范围的免疫应答，包括体液和细胞介导免疫。在天然感染中，免疫系统会不同程度地识别所有构成sars-cov-2的蛋白质。通过利用突变频率较低的结构基因如m、n和e来配制疫苗，可以扩大所诱发的免疫应答的广度，以针对新出现的sars-cov-2变体进行保护，并降低逃逸突变体的可能性。
25.在一个实施方案中，将刺突蛋白或其部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
26.在一个实施方案中，将膜蛋白或其部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
27.在一个实施方案中，将核衣壳蛋白或其部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
28.在一个实施方案中，将膜蛋白和核衣壳蛋白或其中任何蛋白的部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
29.在一个实施方案中，将刺突蛋白或其部分、膜蛋白或其部分、和核衣壳蛋白或其部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
30.在一个实施方案中，将刺突蛋白或其部分、膜蛋白和核衣壳蛋白或其中任何蛋白的部分、以及包膜蛋白或其部分用作单一痘病毒载体疫苗中的疫苗抗原。
31.在一个实施方案中，将刺突蛋白或其部分与膜蛋白和核衣壳蛋白或其部分组合为单一疫苗的混合物。


技术实现要素：

32.本发明人已经发现，通过利用痘病毒尤其是痘苗病毒，可以获得一种防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度的组合物，所述痘病毒通过缺失至少一种编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因而减毒，并且已经过工程化改造从而使其基因组包含编码sars-cov-2的刺突蛋白多肽和/或膜蛋白多肽和/或核衣壳蛋白多肽和/或包膜蛋白多肽，或者其中任何蛋白多肽的免疫原性或功能性部分的核酸序列。
33.相应地，在第一方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该免疫应答防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码sars-cov-2的刺突和/或膜和/或核衣壳和/或包膜多肽或者其中任何多肽的一个或多个免疫原性或功能性部分的核酸序列，所述核酸序列被替换到选定痘苗病毒基因的开放阅读框中或插入到基因间区中。
34.在第二方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
35.在第三方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
36.在第四方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包
含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含在合成早期/晚期启动子的转录调控下的编码sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
37.在第五方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含在天然早期/晚期启动子的转录调控下的编码sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
38.在第六方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分，以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
39.在第七方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含在合成早期/晚期启动子的转录调控下的编码sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基的核酸序列。
40.在第八方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、和在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分。
41.在第九方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分。
42.在第十方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基、和在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或
2冠状病毒疾病的风险，该组合物包含基因工程化的减毒痘苗病毒，其中该痘苗病毒基因组包含编码至少一种人类冠状病毒sars-cov-2多肽的核酸序列，该多肽选自下组：刺突蛋白多肽或其免疫原性部分、膜蛋白多肽或其免疫原性部分、核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分和包膜蛋白多肽或其免疫原性部分，其中该减毒痘苗病毒包含至少一种编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失，
54.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2刺突蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
55.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
56.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
57.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分和核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
58.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2的刺突蛋白多肽或其免疫原性部分，和膜蛋白多肽或其免疫原性部分以及核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
59.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性部分，和膜蛋白多肽或其免疫原性部分，和核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分，以及包膜蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
60.组合物，其中将所述至少一种编码人类冠状病毒sars-cov-2多肽的核酸序列插入到一种或多种免疫调节基因的缺失orf中，这些免疫调节基因选自于包含下列的组：cop-c23l、cop-b29r、cop-c3l、cop-n1l、cop-a35r、cop-a39r、cop-a41l、cop-a44r、cop-a46r、cop-b7r、cop-b8r、cop-b13r、cop-b16r和cop-b19r，
61.组合物，其中将所述至少一种编码人类冠状病毒sars-cov-2多肽的核酸序列插入到减毒痘苗病毒基因组的基因间区(igr)中，其中igr位于痘苗病毒基因组的两个相邻orf之间或者其侧翼是两个相邻orf，
62.组合物，其中减毒痘苗病毒基因组的igr选自下组：f9l-f10l、f12l-f13l、f17r-e1l、e1l-e2l、e8r-e9l、e9l-e10r、i1l-i2l、i2l-i3l、i5l-i6l、i6l-i7l、i7l-i8r、i8r-g1l、g1l-g3l、g3l-g2r、g2r-g4l、g4l-g5r、g5r-g5.5r、g5.5r-g6r、g6r-g7l、g7l-g8r、g8r-g9r、g9r-l1r、l1r-l2r、l2r-l3l、l3l-l4r、l4r-l5r、l5r-j1r、j3r-j4r、j4r-j5l、j5l-j6r、j6r-h1l、h1l-h2r、h2r-h3l、h3l-h4l、h4l-h5r、h5r-h6r、h6r-h7r、h7r-d1r、d1r-d2l、d2l-d3r、d3r-d4r、d4r-d5r、d5r-d6r、d6r-d7r、d9r-d10r、d10r-d11l、d11l-d12l、d12l-d13l、d13l-a1l、a1l-a2l、a2l-a2.5l、a2.5l-a3l、a3l-a4l、a4l-a5r、a5r-a6l、a6l-a7l、a7l-a8r、a8r-a9l、a9l-a10l、a10l-a11r、a11r-a12l、a12l-a13l、a13l-a14l、a14l-a14.5l、a14.5l-a15l、a15l-a16l、a16l-a17l、a17l-a18r、a18r-a19l、a19l-a21l、a21l-a20r、a20r-a22r、a22r-a23r、a23r-a24r、a28l-a29l和a29l-a30l，还有001l-002l、002l-003l、005r-006r、006l-007r、007r-008l、008l-009l、017l-018l、018l-019l、019l-02ol、020l-021l、023l-024l、024l-025l、025l-026l、028r-029l、03ol-031l、031l-032l、032l-033l、035l-036l、036l-037l、037l-038l、039l-040l、043l-044l、044l-045l、046l-047r、049l-050l、050l-051l、
051l-052r、052r-053r、053r-054r、054r-055r、055r-056l、061l-062l、064l-065l、065l-066l、066l-067l、077l-078r、078r-079r、080r-081r、081r-082l、082l-083r、085r-086r、086r-087r、088r-089l、089l-090r、092r-093l、094l-095r、096r-097r、097r-098r、101r-102r、103r-104r、105l-106r、107r-108l、108l-109l、109l-110l、110l-111l、113l-114l、114l-115l、115l-116r、117l-118l、118l-119r、122r-123l、123l-124l、124l-125l、125l-126l、133r-134r、134r-135r、136l-137l、137l-138l、141l-142r、143l-144r、144r-145r、145r-146r、146r-147r、147r-148r、148r-149l、152r-153l、153l-154r、154r-155r、156r-157l、157l-158r、159r-160l、160l-161r、162r-163r、163r-164r、164r-165r、165r-166r、166r-167r、167r-168r、170r-171r、173r-174r、175r-176r、176r-177r、178r-179r、179r-180r、180r-181r、183r-184r、184r-185l、185l-186r、186r-187r、187r-188r、188r-189r、189r-190r、192r-193r，其中根据旧命名法，orf 006l对应于c10l、019l对应于c6l、020l对应于n1l、021l对应于n2l、023l对应于k2l、028r对应于k7r、029l对应于f1l、037l对应于f8l、045l对应于f15l、050l对应于e3l、052r对应于e5r、054r对应于e7r、055r对应于e8r、056l对应于e9l、062l对应于i1l、064l对应于i4l、065l对应于i5l、081r对应于l2r、082l对应于l3l、086r对应于j2r、087r对应于j3r、088r对应于j4r、089l对应于j5l、092r对应于h2r、095r对应于h5r、107r对应于d10r、108l对应于d11l、122r对应于a11r、123l对应于a12l、125l对应于a14l、126l对应于a15l、135r对应于a24r、136l对应于a25l、137l对应于a26l、141l对应于a30l、148r对应于a37r、149l对应于a38l、152r对应于a40r、153l对应于a41l、154r对应于a42r、157l对应于a44l、159r对应于a46r、160l对应于a47l、165r对应于a56r、166r对应于a57r、167r对应于b1r、170r对应于b3r、176r对应于b8r、180r对应于b12r、184r对应于b16r、185l对应于b17l并且187r对应于b19r，
63.组合物，其中减毒痘苗病毒包含一种或多种基因的缺失，这些基因选自下组：痘苗病毒a41l基因、痘苗病毒d13l基因、痘苗病毒b7r-b8r基因、痘苗病毒a39r基因和痘苗病毒c3l基因，
64.组合物，其中将至少一种编码人类冠状病毒sars-cov-2多肽的核酸序列插入到一种或多种基因的至少一个缺失位点中，
65.组合物，其中将人类冠状病毒sars-cov-2刺突蛋白多肽或其免疫原性部分插入到痘苗病毒a41l基因缺失位点中，
66.组合物，其中将人类冠状病毒sars-cov-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分，以及核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分插入到痘苗病毒d13l基因缺失位点中，
67.组合物，其中将人类冠状病毒sars-cov-2包膜蛋白多肽或其免疫原性部分插入到痘苗病毒b7r-b8r基因缺失位点中，
68.组合物，其中将至少一种编码人类冠状病毒sars-cov-2多肽的核酸序列插入到减毒痘苗病毒基因组的基因间区(igr)中，其中igr位于痘苗病毒基因组的两个相邻orf之间或者其侧翼是两个相邻orf，
69.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由一个或多个表达盒编码，这些表达盒具有选自下组的核酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8，
70.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:1所示核酸序列的
表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒编码，
71.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:2所示核酸序列的表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒编码，
72.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:1所示核酸序列的表达盒编码，
73.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:2所示核酸序列的表达盒编码，
74.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:5所示核酸序列的表达盒编码，
75.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:3所示核酸序列的表达盒编码，
76.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒编码，
77.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:1所示核酸序列的表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒以及具有seq id no:8所示核酸序列的表达盒编码，
78.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:2所示核酸序列的表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒以及具有seq id no:8所示核酸序列的表达盒编码，
79.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:3所示核酸序列的表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒编码，
80.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:3所示核酸序列的表达盒和具有seq id no:4所示核酸序列的表达盒以及具有seq id no:8所示核酸序列的表达盒编码，
81.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:6所示核酸序列的表达盒编码，
82.组合物，其中人类冠状病毒sars-cov-2多肽由具有seq id no:7所示核酸序列的表达盒编码，
83.组合物，其包含药学上可接受的载剂或稀释剂，
84.用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物减少冠状病毒疾病的风险，该组合物包含基因工程化的减毒痘苗病毒，其中痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2的刺突蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，并且其中该减毒痘苗病毒包含至少一种编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失，且所述基因工程化的减毒痘苗病毒与第二基因工程化的减毒痘苗病毒混合，其中该第二痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2的膜蛋白多肽和核衣壳蛋白多肽或者其一个或多个免疫原性部分的核酸序列，并且其中该第二减毒痘苗病毒包含至少一种编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失，
85.基因工程化的减毒痘苗病毒载体，其中痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2的刺突蛋白多肽、膜蛋白多肽和核衣壳蛋白多肽和/或包膜蛋白多肽的核酸序
列，其中该减毒痘苗病毒载体表达上述多肽，这些多肽组装成病毒样颗粒。
86.一种用于防止或减少sars-cov-2感染风险的方法，包括以有效引发针对sars-cov-2的免疫应答的量向动物(包括人类)施用包含减毒痘苗病毒的组合物，其中痘苗病毒基因组包含编码人类冠状病毒sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性部分、和膜蛋白多肽或其免疫原性部分、和核衣壳蛋白多肽或其免疫原性部分，以及任选的包膜蛋白多肽或其免疫原性部分的核酸序列，
87.在这种方法中，其中针对sars-cov-2抗原的免疫应答提供了对与sars-cov-2具有基因相似性的冠状病毒交叉反应的抗体。
88.上述任意组合物在制备用于在受试者中诱发针对冠状病毒感染的保护性免疫应答的药剂中的用途。
附图说明
图1：针对sars-cov-2s、m、n和e，合成(a、b、f和g)或通过pcr构建(c、d和e)痘病毒表达盒。a.包含在合成早期/晚期启动子(prps)转录调控下的sars-cov-2刺突蛋白的表达盒。b.包含在天然早期/晚期启动子(pr7.5)转录调控下的sars-cov-2刺突蛋白的表达盒。c.包含在合成早期/晚期启动子(prps)转录调控下的sars-cov-2刺突蛋白s1亚基的表达盒。d.包含在禽痘病毒早期/晚期启动子(pre/l)转录调控下的sars-cov-2膜蛋白的表达盒。e.包含在合成早期/晚期启动子(prps)转录调控下的sars-cov-2核衣壳蛋白的表达盒。f.包含在禽痘病毒早期/晚期启动子(pre/l)转录调控下的sars-cov-2膜蛋白和在合成早期/晚期启动子(prps)转录调控下的sars-cov-2核衣壳蛋白的表达盒。g.包含在合成早期/晚期启动子(prps)转录调控下的sars-cov-2包膜蛋白的表达盒。图2：相对于痘苗病毒哥本哈根毒株(vacv-cop)基因组，由f1和f2重组臂指示的同源重组位点。a.vacv-cop的a39r区域带有f1-a39r和f2-a39r同源重组臂，该同源重组臂位于scv-smx06中缺失的该vacv-cop区域的两侧，并且可以在其间插入sars-cov-2抗原。b.vacv-cop的a41l区域带有f1-a41l和f2-a42l同源重组臂，该同源重组臂位于scv-smx06中缺失的该vacv-cop区域的两侧，并且可以在其间插入sars-cov-2抗原。c.vacv-cop的b7/b8r区域带有f1-b7b8r和f2-b7b8r同源重组臂，该同源重组臂位于scv-smx06中缺失的该vacv-cop区域的两侧，并且可以在其间插入sars-cov-2抗原。d.vacv-cop的c3l区域带有f1-c3l和f2-c3l同源重组臂，该同源重组臂位于scv-smx06中缺失的该vacv-cop区域的两侧，并且可以在其间插入sars-cov-2抗原。e.vacv-cop的d13l区域带有f1-d13l和f2-d13l同源重组臂，该同源重组臂位于
scv-smx06中缺失的该vacv-cop区域的两侧，并且可以在其间插入sars-cov-2抗原。f.vacv-cop的j2r-j3r基因间区带有f1-j2/j3r和f2-j2/j3r同源重组臂，该同源重组臂位于该vacv-cop区域的侧翼，可以在其间插入sars-cov-2抗原。图3：sars-cov-2转基因的同源重组(hr)盒的详细图谱和元件。a.用于a41l替换的hr盒，包括prps sars-cov-2刺突表达盒。b.用于a41l替换的hr盒，包括pr7.5 sars-cov-2刺突表达盒。c.用于a41l替换的hr盒，包括prps sars-cov-2刺突s1亚基表达盒。d.用于d13l替换的hr盒，包括pre/l sars-cov-2膜和prps sars-cov-2核衣壳表达盒。e.用于插入基因间位点j2/j3r的hr盒，包括pre/l sars-cov-2膜和prps sars-cov-2核衣壳表达盒。f.用于c3l替换的hr盒，包括pre/l sars-cov-2膜表达盒。g.用于d13l替换的hr盒，包括prps sars-cov-2核衣壳表达盒。h.用于b7/b8r替换的hr盒，包括prps sars-cov-2包膜表达盒。图4：疫苗构建过程的示意图。图5：scv-covid19疫苗中的sars-cov-2抗原插入区。a.将在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突转基因替换到a41l orf中。b.将在天然早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突转基因替换到a41l orf中。c.将sars-cov-2刺突s1亚基转基因替换到a41l orf中。d.sars-cov-2膜和核衣壳转基因替换了d13l orf。e.将sars-cov-2膜和核衣壳转基因插入j2r和j3r orf之间的基因间区。f.sars-cov-2包膜转基因替换了b7/b8r orf。g.sars-cov-2膜转基因替换了c3l orf。h.sars-cov-2核衣壳转基因替换了d13l orf。图6：单次疫苗接种scv-covid19d在远交系和近交系小鼠中产生中和性sars-cov-2抗体和th1偏态抗体谱。a.在scv-covid19d单次注射疫苗接种后第21天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中病毒特异性中和抗体的水平。b.在scv-covid19d单次注射疫苗接种后第21天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中s1特异性抗体的水平。c.在scv-covid19d单次注射疫苗接种后第21天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中igg2c(th1)和igg1(th2)抗体的水平。图7：单次疫苗接种scv-covid19d产生刺突特异性cd8 t细胞应答。a.scv-covid19d单次注射疫苗接种后，通过胞内细胞因子染色(ics)检测的刺突特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。b.scv-covid19d单次注射疫苗接种后，通过elispot检测的刺突特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。
图8：scv-covid19c比scv-covid19d引发更好的刺突特异性抗体。a.通过western印迹检测用scv-covid19疫苗感染的细胞中刺突抗原的表达。b.在scv-covid19c、scv-covid19d和scv-covid19f单次注射疫苗接种后第21天，s1特异性抗体的水平。图9：单次疫苗接种scv-covid19c在近交系和远交系小鼠中诱发抗体应答。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第14天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中s1特异性抗体的水平。b.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第14天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中s1特异性抗体的滴度。c.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第14天，远交系arc和近交系c57bl/6品系中中和抗体的水平。图10：用于鉴定产生三细胞因子的cd8 t细胞的门控策略。图11：单次疫苗接种scv-covid19c诱导强健的刺突特异性t细胞应答。a.代表性流式细胞术图显示了scv-covid19c单次注射疫苗接种后刺突特异性ifnγ

cd8 t细胞的检测。b.scv-covid19c单次注射疫苗接种后，产生单细胞因子、双细胞因子和三细胞因子的ifnγ

cd8 t细胞总数的图形化汇总，这些细胞是刺突池1(s1)特异性(左)、刺突池2(s2)特异性(中)和表位特异性(右)的。c.scv-covid19c单次注射疫苗接种后，产生颗粒酶b的cd8 t细胞的代表性流式细胞术图和图形化汇总。d.scv-covid19c单次注射疫苗接种后，s1和s2特异性的产生三细胞因子的cd4 t细胞总数。图12：在施用单剂scv-covid19c疫苗后，既有免疫并不会影响刺突特异性抗体应答的量和质量。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第28、44和80天，具有和不具有既有免疫的小鼠的s1特异性抗体水平。b.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第28、44和80天，具有和不具有既有免疫的小鼠的中和抗体水平。图13：既有免疫并不会影响初免-加强疫苗接种后刺突特异性抗体应答的量和质量。a.在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种中，在第28天(加强前)和加强剂后第14天和第50天，具有和不具有既有免疫的小鼠的s1特异性抗体水平。b.在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种中，在第28天(加强前)和加强剂后第14天和第50天，具有和不具有既有免疫的小鼠的中和抗体水平。图14：单次疫苗接种scv-covid19c在衰老小鼠中诱导抗原特异性抗体应答。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第14天和第21天，年轻和衰老小鼠中s1特异性抗体的水平。b.在scv-covid19c单次疫苗接种后第14天和第21天，年轻和衰老小鼠中中和抗体的水平。
图15：同源初免-加强引起抗体应答的显著加强，这种加强在疫苗接种后维持长达3个月。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第21天和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后第21天，年轻和衰老小鼠中s1特异性抗体的水平。b.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第21天和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后第21天，年轻和衰老小鼠中中和抗体的水平。c.在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后第3、9和12周，年轻和衰老小鼠中中和抗体的水平。图16：利用细胞表面标志物对t细胞的记忆细胞类型进行流式细胞术鉴定的门控策略。图17：scv-covid19c的同源初免-加强诱导长期t细胞应答。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后3个月和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后3个月，年轻和衰老小鼠中短寿效应型(t
sle
)、效应记忆型(t
em
)和中央记忆型(t
cm
)cd8 t细胞的总数。b.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后3个月和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后3个月，年轻和衰老小鼠中刺突特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。c.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后3个月和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后3个月，年轻和衰老小鼠中通过elispot检测的s1、rbd和s2特异性ifnγ

斑点形成单位的水平。d.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后3个月和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后3个月，年轻和衰老小鼠中通过ics检测的s1、rbd和s2特异性ifnγ

cd8 t细胞的百分比。e.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后3个月和在scv-covid19c同源初免-加强疫苗接种的加强后3个月，年轻和衰老小鼠中通过ics检测的s1、rbd和s2特异性的产生三细胞因子的cd8 t细胞的总数。图18：scv-covid19c的同源初免-加强可能潜在地与sars-cov交叉反应，这是基于刺突rbd中的cd8 t细胞表位。a.在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第7天，通过elispot检测的表位特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。b.代表性流式细胞术图显示了在scv-covid19c单次注射疫苗接种后第7天，通过ics检测的表位特异性ifnγ

cd8 t细胞。图19：单次疫苗接种scv-covid19a产生刺突和膜特异性cd8 t细胞应答。a.在scv-covid19a单次注射疫苗接种后第21天，s1、rbd和s2特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。b.在scv-covid19a单次注射疫苗接种后第21天，膜特异性ifnγ

cd8t细胞的水平。c.在scv-covid19a单次注射疫苗接种后第21天，核衣壳特异性ifnγ

cd8 t细胞的水平。图20：单次疫苗接种等比例的scv-covid19c和scv-covid19g诱导刺突特异性抗体应答和针对刺突蛋白和膜蛋白的cd8

t细胞应答。
a.在单次注射疫苗接种包含scv-covid19c和scv-covid19g的混合疫苗后第21天，s1特异性抗体的水平。b.在单次注射疫苗接种包含scv-covid19c和scv-covid19g的混合疫苗后第21天，s1特异性抗体的滴度。c.单次注射疫苗接种包含scv-covid19c和scv-covid19g的混合疫苗后，通过胞内细胞因子染色(ics)检测的刺突特异性的产生ifnγ

的t细胞应答的水平。d.单次注射疫苗接种包含scv-covid19c和scv-covid19g的混合疫苗后，通过elispot检测的刺突和膜特异性的产生ifnγ

的t细胞应答的水平。图21：单次疫苗接种scv-covd19c产生表位特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)活性。a.在疫苗接种后第7天时，针对用肽ynylyrlf(seq id no:9)脉冲的靶细胞的ctl应答。b.在疫苗接种后第7天时，针对用肽vnfnfngl(seq id no:11)脉冲的靶细胞的ctl应答。c.针对未脉冲的靶细胞的ctl应答。发明详述
75.本发明不限于特定的程序或药剂、药剂的特定配制品和各种医学方法，因为它们可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而并非意在限制。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
76.可以使用与本文所述的材料和方法类似或等同的任何材料和方法来实施或测试本发明。从业人员应特别注意：sambrook等人,(1989)molecular cloning:a laboratory manual,第2版,cold spring harbor press,plainsview,n.y.；ausubel等人,(1999)current protocols in molecular biology(增补47)john wiley&sons,new york；murphy等人,(1995)virus taxonomy springer verlag:79-87；mahy brian wj和kangro o hillar(编著):virology methods manual 1996,academic press；和davison aj和eliott rm(编著):molecular virology,a practical approach 1993,irl press at oxford university press；perkus等人,virology(1990)179(1):276-86或者本领域的定义和术语以及本领域技术人员已知的其他方法。
77.尽管可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料来实施或测试本发明，但是本文描述的是优选的方法和材料。出于本发明的目的，将以下术语定义如下。
78.在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包含(comprise)”、“包括(comprises)”和“含有(comprising)”这些词将被理解为意味着包含某个指定步骤或要素或者某组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或者一组步骤或要素。因此，术语“包含”和类似的用法表示列出的要素是必需的或强制的，但其它要素是任选的，并且可以存在或不存在。在减毒正痘载体的情况下，
79.通过包含成熟或组装基因的缺失来修饰主题载体以进行减毒，然而，还包括进一步的修饰，例如对载体、抗原或其它蛋白质的载体的修饰。
[0080]“由
……
组成”意思是包括并限于短语“由
……
组成”之后的任何内容。因此，短语“由
……
组成”表示列出的要素是必需的或强制的，并且不能出现其它要素。所谓“基本上由
……
组成”意思是包括该短语之后列出的任何要素，并且其它要素仅限于不干扰或无助于本公开中规定的所列要素的活性或行为的要素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示列出的要素是必需的或强制的，但是其它要素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或行为。
81.除非上下文中另有明确规定，如本文所用的，单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”和“所述或该(the)”包括复数方面。因此，例如，提及“一种细胞”包括单细胞，以及两个/种或更多个/种细胞；提及“一种生物体”包括一个生物体，以及两个/种或更多个/种生物体；以此类推。在一些实施方案中，“一种”的意思是“一个/种或超过一个/种”。
82.如本文所用的，“和/或”指的是并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当解释为备选(或)时缺少组合。
83.如本文所用的“减毒”或“减毒的”意指病毒载体毒力的降低。毒力被定义为病毒在特定宿主中致病的能力。不能产生感染性病毒的痘病毒载体可能最初会感染细胞，但基本上不能完全自我复制或在宿主内繁殖或导致病况。这是期望的，因为载体将其蛋白质或核酸递送至宿主细胞的细胞质但不会伤害受试者。
[0084]“调控元件”或“调控序列”意指在特定痘病毒、载体、质粒或细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列(例如dna)。适用于真核细胞的调控序列包括转录调控序列如启动子、多腺苷酸化信号、转录增强子，翻译调控序列如翻译增强子和内部核糖体结合位点(ires)，调节mrna稳定性的核酸序列，以及将由转录的多核苷酸编码的产物导向细胞内的细胞内区室或细胞外环境的靶向序列。
85.在提供序列的情况下，包括相应的序列。所谓“与
……
相对应”、“相应的”或“对应于
……”
是指与参考核酸序列显示实质性序列同一性的核酸序列(例如，与参考核酸序列的全部或一部分存在至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或甚至高达100％的序列同一性)，或者与参考氨基酸序列显示实质性序列相似性或同一性的氨基酸序列(例如，与参考氨基酸序列的全部或一部分存在至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或甚至高达100％的序列相似性或同一性)。
86.在治疗或预防病况或调节对靶抗原或生物体的免疫应答的上下文中，“有效量”是指向需要这种治疗或预防的个体施用一定量的药剂(例如，如本文所述的减毒正痘载体)或包含该药剂的组合物，无论是以单剂量或作为一系列剂量的一部分，该量对于预防出现该病况的症状、控制此类症状和/或治疗该病况的现有症状，或者对于调节对该靶抗原或生物体的免疫应答是有效的。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群、组合物的配制、医疗状况的评估和其他相关因素而变化。据预测，该量会落在可以通过常规试验确定的相对较宽的范围内。
87.如本文所用的，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等诸如此类指的是核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，可以说核酸序列“编码”多肽，或者如果该核酸序列可以经转录和/或翻译以产生多肽，或者如果该核酸序列可以被加工成可以经转录和/或翻译以产生多肽的形式。这种核酸序列可以包括编码序列或包括编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等诸如此类包括由dna分子转录产生的rna产物，由rna分子翻译产生的蛋白质，由dna分子转录形成rna产物并随后翻译该rna产物产生的蛋白质，或由dna分子转录提供rna产物、加工该rna产物以提供加工后的rna产物(例如，mrna)并随后翻译该加工的rna产物产生的蛋白质。
88.术语“内源性的”指的是通常存在于宿主生物体中的基因或者核酸序列或区段。
[0089]
术语“可表达的”、“表达的”及其变型指的是细胞将核苷酸序列转录为rna并任选地翻译mrna以合成提供生物学或生物化学功能的肽或多肽的能力。
[0090]
如本文所用的，术语“基因”包括能够用于产生mrna的核酸分子，任选地添加有助于该过程的元件。基因可能能够也可能不能用于产生功能性蛋白质。基因可以同时包括编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列以及5'和3'非翻译区)。
[0091]
术语“异源核酸序列”、“异源核苷酸序列”、“异源多核苷酸”、“外来多核苷酸”、“外源多核苷酸”等诸如此类可互换使用，指的是通过实验操作导入生物体基因组内的任何核酸(例如，包含ires的核苷酸序列)，并且可以包括在该生物体中发现的基因序列，只要所导入的基因包含相对于修饰前病毒基因组序列的一些修饰(例如，至少一个核苷酸的点突变、缺失、取代或添加、内切核酸酶切割位点的存在、loxp位点的存在等)。
[0092]
术语“异源多肽”、“外来多肽”和“外源多肽”可互换使用，指的是由上文定义的“异源核酸序列”、“异源核苷酸序列”、“异源多核苷酸”、“外来多核苷酸”和“外源多核苷酸”编码的任何肽或多肽。
[0093]
在一个实施方案中，异源dna序列包含至少一个编码序列。编码序列可操作性连接到转录调控元件。
[0094]
在一个实施方案中，异源dna序列还可以包含与一个或几个转录调控元件连接的两个或更多个编码序列。优选地，编码序列编码一种或多种蛋白质、多肽、肽、外来抗原或抗原表位，尤其是那些具有治疗意义的基因。具有治疗意义的基因可能源自致病的病原体或感染性微生物的基因，或者与之同源。将具有治疗意义的基因呈递给生物体的免疫系统，以影响、优选诱导特异性免疫应答，从而为生物体接种疫苗或预防性保护生物体免受感染。
[0095]
在一个实施方案中，异源dna序列来源于sars-cov-2并且编码刺突蛋白，和/或膜蛋白，和/或核衣壳蛋白，和/或包膜蛋白，或者其中任何蛋白的一个或多个部分。
[0096]
术语“保护性免疫应答”意指一种免疫应答，其防止或减少sars-cov-2感染的风险或者降低冠状病毒疾病严重程度的风险。
[0097]
针对sars-cov-2抗原的免疫应答可以提供对与sars-cov-2具有基因相似性的冠状病毒存在交叉反应的抗体。
[0098]
术语“中和性抗体应答”意指一种免疫应答，其中引发能够中和病毒感染性的抗体。通过疫苗接种产生中和抗体对于保护免于病毒感染来说是充分且必要的。中和抗体的出现是疫苗接种后保护免于病毒感染的最佳相关物。同样，它们也是免疫力的标志物。
[0099]
应当理解，如本文所考虑的，诱导免疫应答包括引发或刺激免疫应答和/或增强既有的免疫应答。
[0089]
在动物中防止或降低sars-cov-2感染的风险和/或冠状病毒疾病严重程度的免疫应答可以通过防止或降低sars-cov-2传播来介导。
[0100]
本发明的痘病毒载体优选在哺乳动物细胞中进行增殖。可用于本发明的哺乳动物细胞的详细信息在pct/au2014/050330中提供，其公开内容通过交叉引用并入本文。
[0101]
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞、灵长类动物细胞、仓鼠细胞或兔细胞。
[0102]
细胞可以是单细胞的，或者可以在组织培养中以液体培养物、单层或类似的方式生长。宿主细胞也可以直接或间接来源于组织或者可以存在于生物体(包括动物)内。细胞可以是已建立的细胞系，包括已被修饰以表达泛素化t细胞抗原的细胞系。
[0103]
在一些实施方案中，在bc19a-12细胞系中进行同源重组和/或病毒繁殖，该细胞系是一种源自表达d13l蛋白和牛痘宿主范围蛋白(cp77)的gmp-cho-s细胞系的scv细胞基质。scv疫苗平台在病毒基因组中纳入了d13l基因的靶向缺失，以防止病毒组装，从而使scv不能在正常容许的细胞系中产生感染性后代；然而，保留了scv基因组的扩增。对cho细胞进行工程化改造，使其组成性表达d13和cp77，从而允许病毒繁殖。有关使用bc19a-12细胞系进行病毒繁殖的方法的完整描述，参见eldi等人2017，其全部内容并入本文。
[0104]
在一些实施方案中，在sd07-1细胞系中进行同源重组和/或病毒繁殖，这是一种组成性表达痘苗病毒d13蛋白的单克隆悬浮cho细胞系，它可以在无蛋白或无血清培养基中生长。
[0105]
如本文所用的术语“可操作地连接”或“可操作地链接”指的是一种并置关系，其中如此描述的组分处于允许它们以其意图的方式发挥作用的关系。例如，与编码序列“可操作地连接”的转录调控序列指的是该转录调控序列相对于编码序列的定位和/或定向允许编码序列在与转录调控序列相容的条件下表达。在另一示例中，与正痘病毒编码序列可操作地连接的ires指的是该ires相对于正痘病毒编码序列的定位和/或定向允许正痘病毒编码序列的非帽依赖性翻译。
[0106]
如本文所用的，术语“开放阅读框”和“orf”在本文中可互换使用，指的是在编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”(例如，atg)和“终止密码子”(例如，tga、taa、tag)指的是编码序列中三个相邻核苷酸的单元(
‘
密码子’)，它们分别指定蛋白质合成(mrna翻译)的起始和链终止。
[0107]
如本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”或“核酸序列”，表示mrna、rna、crna、cdna或dna。该术语通常指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的rna或dna。
[0108]“多肽”、“肽”、“蛋白质”和“蛋白质性分子”在本文中可互换使用，指的是包含氨基酸残基聚合物或由其组成的分子，以及它们的变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0109]
如本文所用的，适用于“核酸分子”、“多核苷酸”等的术语“重组”应理解为意指可
在本文所述的宿主细胞或无细胞系统中转录和/或翻译的人工核酸结构(即，非复制型cdna或rna；或者复制子、自我复制型cdna或rna)。可以将重组核酸分子或多核苷酸插入载体中。可以使用非病毒载体如质粒表达载体或病毒载体。根据本发明的载体种类和插入核酸构建体的技术是技术人员已知的。根据本发明的核酸分子或多核苷酸在自然界中不会以本发明所述的排列方式出现。换句话说，异源核苷酸序列不会与亲本病毒基因组的元件(例如，启动子、orf、多腺苷酸化信号、核酶)天然组合。
[0110]
如本文所用的，术语“重组病毒”应理解为是指包含至少一种异源核酸序列的“亲本病毒”。
[0111]
如本文所用的术语“序列同一性”，指的是在比较窗口内在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”的计算方法如下，在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，a、t、c、g、i)或相同氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置数量以得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，以得出序列同一性百分比。就本发明目的而言，“序列同一性”将被理解为意指由dnasis计算机程序(适用于windows系统的2.5版；可以获自hiachi software engineering co.,ltd.,south san francisco,california,usa)利用软件随附的参考手册中所用的标准默认值计算的“匹配百分比”。
[0112]
术语“信号序列”或“信号肽”指的是一种短肽(长约3至约60个氨基酸)，它指导例如蛋白质从胞质溶胶到某些细胞器如细胞核、线粒体基质和内质网的共翻译或翻译后转运。对于具有er靶向性信号肽的蛋白质来说，在蛋白质被转运到er之后，信号肽通常由信号肽酶从前体形式切割下来，并且所得蛋白质沿着分泌途径移动到它们的细胞内(例如，高尔基体、细胞膜或细胞壁)或细胞外位置。如本文所用的“er靶向性信号肽”，包括氨基末端疏水性序列，其通常在部分或全部蛋白质穿过er膜插入er腔后以酶促方式去除。因此，本领域中已知的是，信号前体形式的序列可以作为前体形式的蛋白质的一部分存在，但通常不存在于成熟形式的蛋白质中。
[0113]“相似性”指的是如下表a中定义的相同或组成性保守取代的氨基酸的百分比数。可以使用序列比较程序如gap来确定相似性(deveraux等人1984,nucleic acids research 12:387-395)。以这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文所引用的那些序列长度相似或基本上不同的序列，这种空位例如通过gap所用的比较算法来确定。表a：示例性保守性氨基酸取代
[0114]
用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(wisconsin遗传学软件包7.0版中的gap、bestfit、fasta和tfasta,genetics computer group,575science drive madison,wi,usa)或通过检查来进行，并且最佳比对(即，在比较窗口内产生最高百分比的同源性)由所选择的各种方法中的任何一种来产生。还可以参考blast系列程序，例如由altschul等人,1997,nucl.acids res.25:3389所公开的那样。序列分析的详细论述可以见于ausubel等人,“current protocols in molecular biology”,john wiley&sons inc,1994-1998,第15章的第19.3单元。
[0115]
术语“受试者”、“患者”、“宿主”或“个体”在本文中可互换使用，指的是期望治疗或预防的任何受试者，尤其是脊椎动物受试者，甚至更具体而言是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴和猿类，并包括来自猕猴属(macaca)的猴的种类(例如食蟹猴，如食蟹猕猴(macaca fascicularis)，和/或恒河猴(猕猴(macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(papio ursinus))，以及狨猴(来自狨属(callithrix)的种类)、松鼠猴(来自松鼠猴属(saimiri)的种类)、雪貂(来自鼬属(mustela)的种类)和绢毛猴(来自柽柳猴属(saguinus)的物种)，以及猿的种类例如黑猩猩(pan troglodytes))、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(如，家兔、野兔)、牛科动物(如，牛)、绵羊类动物(如，绵羊)、山羊类动物(如，山羊)、猪类动物(如，猪)、马类动物(如，马)、犬科动物(如，狗)、猫科动物(如，猫)、禽类(如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟例如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和鱼类。优选的受试者是需要治疗或预防病况的人。然而，应当理解上述术语并不意味着存在症状。
[0116]
术语“转基因”在本文中用于描述已经或将要被人工导入宿主生物体基因组并传递给该宿主后代的遗传物质。在一些实施方案中，它赋予导入它的哺乳动物细胞或正痘病毒载体所需的特性，或者以其他方式产生所需的治疗或诊断结果。
[0117]
如本文所用的，术语“治疗(treatment)”、“处理(treating)”等指的是获得期望的药理学和/或生理学效应。从完全或部分预防疾病或其症状的方面来看，该效应可以是预防性的，和/或从部分或完全治愈疾病和/或由该疾病所致的不良反应的方面来看，该效应可以是治疗性的。如本文所用的“治疗(treatment)”，涵盖对哺乳动物中尤其是人类中疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未被确诊为患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
[0118]
对于生物体、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然的”、“原生的”等指的是该生物体、多肽或核酸序列是天然存在的，或可在至少一种天然存在的生物体中获得的，它们未被人类改变、突变或者以其他方式操控。
[0119]
术语“病毒感染”意指来自受试者的生物样品中由病毒病原体导致的感染。
[0120]
术语“病毒样颗粒”或“vlp”指的是一种在抗原性和形态学上类似于天然病毒的结构。
[0121]
变体包括与参考分子或其互补形式在全部或其部分上足够相似的核酸分子，从而可以在中度或高度严格性条件下实现选择性杂交，或者在包含至少约15个核苷酸的比较窗口内，它们与定义参考痘病毒宿主范围因子的核苷酸序列具有约60％至90％或90％至98％的序列同一性。优选地，杂交区域的长度为约12至约18个核碱基或更长。优选地，特定核苷酸序列和参考序列之间的同一性百分比至少为约80％或85％，或者更优选约90％相似或更高，例如约95％、96％、97％、98％、99％或更高。包括80％至100％的同一性百分比。核苷酸序列的长度依赖于其预期功能。还包括同源物。术语“同源物”、“同源基因”或“多种同源物”泛指功能和结构上相关的分子，包括来自其他物种的分子。同源物和直系同源物是变体的实例。
[0122]
可以按以下方式确定核酸序列同一性。主题核酸序列用于使用blastm程序2.1版来搜索核酸序列数据库，例如genbank数据库(可访问网站www.ncbi.nln.nih.gov/blast/)(根据altschul等人(1997)nucleic acids research 25:3389-3402)。该程序在无空位模式下应用。使用默认过滤来去除由于低复杂度区域而产生的序列同源性。使用blastm的默认参数。
[0123]
可以按以下方式确定氨基酸序列同一性。主题多肽序列用于使用blastp程序来搜索多肽序列数据库，例如genbank数据库(可访问网站www.ncbi.nln.nih.gov/blast/)。该程序在无空位模式下应用。使用默认过滤来去除由于低复杂度区域而产生的序列同源性。使用blastp的默认参数。对低复杂度的序列的过滤可以使用seg程序。
[0124]
优选的序列会在严格条件下与参考序列或其互补序列杂交。术语“在严格条件下杂交”及其语法上的等同形式，指的是在规定的温度和盐浓度条件下，核酸分子与靶核酸分子(例如固定在dna或rna印迹上的靶核酸分子，如southern印迹或northern印迹)杂交的能力。对于长度大于约100个碱基的核酸分子，典型的严格杂交条件是比天然双链体的解链温度(tm)低不超过25℃至30℃(例如10℃)(总体上参见sambrook等人,(见上文)；ausubel等人,(1999))。大于约100个碱基的核酸分子的tm可以通过公式tm＝81.5 0.41％(g c-log
(na

))来计算。对于长度小于100个碱基的核酸分子，示例性严格杂交条件是低于tm 5℃至10℃。
[0125]
本上下文中的术语“缺失”指的是去除靶基因的全部或部分编码区。该术语还包括任何形式的突变或转化，其消除靶基因的基因表达或者消除或实质性下调编码蛋白的水平或活性。
[0126]
对“基因”的提述包括对应于基因的外显子或开放阅读框的dna。本文提及的“基因”也被认为包括：经典的基因组基因，其由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子、5'-和3'-非翻译序列)组成；或者mrna或cdna，其对应于基因的编码区(即外显子)以及5'-和3'-非翻译序列。
[0127]“调节元件”或“调节序列”意指在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列(例如dna)。例如，适用于原核细胞的调节序列包括启动子，以及任选的顺式作用序列如操纵子序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的调控序列包括启动子、多腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mrna稳定性的前导序列或尾随序列(trailing sequence)，以及将由转录的多核苷酸编码的产物导向细胞内的细胞内区室或细胞外环境的靶向序列。
[0128]
适用于实现本发明经修饰的哺乳动物细胞的嵌合构建体包含编码正痘病毒宿主范围因子的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至调节序列。调节序列适当地包括转录和/或翻译调控序列，其将与在细胞中的表达相容。通常，转录和翻译调节控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调节区诸如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区的核苷酸序列。涵盖本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或者组合多个元件或多于一个启动子的杂合启动子。
[0129]
涵盖的启动子序列可以是哺乳动物细胞的天然序列，或者可以来源自替代来源，其中该区域在所选择的生物体中具有功能。启动子的选择将根据拟用的宿主细胞而有所不同。例如，可用于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括金属硫蛋白启动子(其可对重金属如镉作出响应而被诱导)、β-肌动蛋白启动子以及病毒启动子如sv40大t抗原启动子、人巨细胞病毒(cmv)立即早期(ie)启动子、劳斯肉瘤病毒ltr启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子、腺病毒主要晚期启动子(ad mlp)、单纯疱疹病毒启动子和hpv启动子，特别是hpv上游调控区(urr)等等。所有这些启动子都在本领域中描述很详细并且容易获得。
[0130]
存在许多痘病毒启动子类型，其区别在于病毒复制周期内它们具有活性的时间段。尽管早期启动子在感染后期也可具有活性，但晚期启动子的活性仅限于晚期。第三类启动子被称为中间启动子，在早期到晚期的过渡时具有活性，并依赖于病毒的dna复制。在痘病毒复制周期的早期和晚期都具有活性的启动子通常用于指导新抗原在痘病毒载体中的表达。一种紧凑的合成启动子(prps)已被广泛用于指导强大的早期以及晚期基因表达。pr7.5启动子是用于通过痘苗病毒载体进行重组基因表达的天然早期-晚期启动子的另一实例。
[0131]
如本文所用的，术语“早期/晚期启动子”指的是在病毒感染的细胞中，病毒dna复制发生前后都具有活性的启动子。特别优选的是痘病毒早期/晚期启动子，包括合成痘苗病
毒早期/晚期启动子(ps)、天然痘苗病毒早期/晚期启动子(p7.5)和禽痘病毒早期/晚期启动子(pe/l)。除非另有说明，如本文所用的启动子是痘苗病毒启动子。
[0132]
增强子元件也可在本文中用于增加哺乳动物构建体的表达水平。示例包括sv40早期基因增强子，例如描述于dijkema等人(1985)embo j.4:761，源自劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(ltr)的增强子/启动子，例如描述于gorman等人,(1982)proc.natl.acad.sci.usa 79:6777，以及源自人cmv的元件，例如描述于boshart等人(1985)cell 41:521，诸如包含在cmv内含子a序列中的元件。
[0133]
嵌合构建体也可以包含3'非翻译序列。3'非翻译序列指的是包含一种dna区段的基因部分，该基因区段含有多腺苷酸化信号和能够实现mrna加工或基因表达的任何其它调节信号。多腺苷酸化信号的特征在于实现将多腺苷酸束添加到mrna前体的3'末端。多腺苷酸化信号通常通过与典型形式5'aataaa-3'的同源性来识别，尽管变异并不罕见。3'非翻译调节性dna序列优选包括约50至1,000个nt，并且除了多腺苷酸化信号和能够实现mrna加工或基因表达的任何其它调节信号外，还可以含有转录和翻译终止序列。
[0134]
在一些实施方案中，嵌合构建体还含有可选择标志物基因，以允许选择含有该构建体的细胞。选择基因在本领域中是众所周知的，并且将与在感兴趣的细胞中的表达相容。
[0135]
在一个实施方案中，痘病毒结构或组装基因的表达是在启动子的控制下。在一个非限制性实施方案中，启动子是细胞组成型启动子，例如人ef1α(人延伸因子1α基因启动子)、dhfr(二氢叶酸还原酶基因启动子)或pgk(磷酸甘油酸激酶基因启动子)，它们指导表达足够水平的cp77以维持病毒繁殖，而对宿主细胞没有显著的毒性效应。启动子也可以是诱导型的，例如细胞诱导型启动子，mth(来自金属硫蛋白基因)病毒启动子也用于哺乳动物细胞，例如cmv、rsv、sv-40和mou3。
[0136]
本发明提供了一种用于对抗新型冠状病毒的预防性疫苗的组合物，该新型冠状病毒被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2)，它是被称为冠状病毒疾病19(covid-19)的疾病的致病因子。covid-19已被世界卫生组织(who)宣布为全球大流行，并一直影响着世界各地的许多人。sars-cov-2是一种正义单链rna病毒。sars-cov-2基因组长约29,700个核苷酸，并与sars-cov具有79.5％的序列相似性；它具有5'端的长orf1ab多蛋白，其编码15或16个非结构蛋白，而3'端基因组编码四种主要结构蛋白(刺突、核衣壳、膜和包膜蛋白)。sars-cov-2与宿主细胞上表达的血管紧张素受体转换酶2(ace2)结合，以便病毒进入并最终发病。sars-cov-2病毒主要影响呼吸系统，症状包括发热、干咳、呼吸困难、头痛、头晕、全身无力、呕吐和腹泻。目前的医疗处置主要是支持性的，没有可用的靶向疗法。
[0137]
rna病毒(包括sars-cov-2)通过突变发生变化的内在趋势已在全球范围内得到证明，随着时间的推移，新的变体不断出现。虽然大多数新出现的突变不会对传播产生显著影响，但赋予病毒选择性优势的突变通常会保留下来，这反映在该变体在人群中的流行性增加。在记录的众多sars-cov-2变体中，少数几种属于公共卫生问题，因为它们的传播能力增加、导致更严重疾病的能力提高，和/或逃避感染或疫苗接种后产生的免疫应答的能力增强。2021年，出现了三种反映值得关注的变体(voc)的特定病毒谱系：b.1.1.7、b.1.351和b.1.1.28.1。被称为d614g的突变为这三种值得关注的变体所共有。与其他优势病毒和没有这种突变的其他sars-cov-2毒株相比，它赋予了病毒增加的传播力。
[0138]
如本文所用的，值得关注的变体指的是b.1.1.17、b.1.351和b.1.1.28.1，特别是
p.1谱系。b.1.1.7变体最初于2020年9月在英格兰南部被发现。该变体在刺突蛋白的rbd中在第501位发生突变，其中氨基酸天冬酰胺(n)被替换为酪氨酸(y)，因此该突变被称为n501y。与其他变体相比，b.1.1.7变体与更有效和更快速的传播以及更高的死亡风险有关。b1.1.351变体最初于2020年10月在南非被鉴定。该变体在刺突蛋白中发生多重突变，包括k417n、e484k和n501y。已经证明突变e484k影响多克隆和单克隆抗体的中和作用。b.1.1.28变体，特别是该谱系的p.1支系，最初于2021年1月在抵达日本的巴西旅行者中被鉴定。p.1谱系在刺突蛋白rbd中含有3个突变，包括k417t、e484k和n501y。这些突变提高了sars-cov-2的传播力和抗原性概况。
[0139]
如本文所用的，sars-cov-2刺突蛋白的s1亚基在受体结合结构域区域内包含免疫显性t细胞表位ynylyrlf(seq id no:9)、vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11)。先前也在sars-cov的小鼠研究中发现了vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11)表位。本领域技术人员会理解，这些在sars-cov和sars-cov-2之间保守的表位可能表明旨在产生/提高sars-cov-2的免疫应答的疫苗可能对sars-cov具有交叉反应性。
[0140]
人类冠状病毒sars-cov-2毒株/分离物的基因序列可通过全球共享流感数据倡议组织数据库(gisaid)获得，并且包括来自sars-cov-2的各种毒株/分离物的基因组序列数据，包括例如，武汉/ivdc-hb-01/2019(gisaid登录id:epi_isl_402119～121)。sars-cov-2的基因组序列对于设计和评估潜在的干预措施例如针对covid19的疫苗至关重要。
[0141]
本发明提供了一种组合物，其包含用于表达异源冠状病毒抗原的减毒痘病毒，该组合物可用作疫苗用于诱导针对冠状病毒感染的免疫应答和/或中和性抗体应答。如本文所用的术语“减毒”、“减弱的”等诸如此类，意指病毒载体毒力的降低。毒力通常被定义为病毒在特定宿主中致病的能力。例如，不能产生感染性病毒的痘病毒可能最初会感染细胞，但基本上不能完全自我复制或者在宿主或宿主细胞内繁殖或者导致疾病或病况。这是合乎期望的，因为痘病毒载体可以将核酸递送至宿主或宿主细胞，但通常不会伤害宿主或宿主细胞。
[0142]
痘病毒科包括两个亚科，即脊椎动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科。脊椎动物痘病毒亚科包括八个属，其中正痘病毒属包含感染人类的种，而昆虫痘病毒亚科感染昆虫。正痘病毒属包括例如作为天花的致病因子的天花病毒、形成了jenner在1796年报告的最初的天花疫苗的牛痘病毒和已经用作第二代天花疫苗的痘苗病毒。鸟痘病毒属病毒包含感染禽类的种，诸如禽痘病毒和金丝雀痘病毒。除了它们在天花疫苗中作为抗原的用途之外，人们对使用基于重组痘苗的病毒和鸟痘病毒作为载体来递送和/或表达感兴趣的异源基因也非常感兴趣。作为细胞质内载体，正痘病毒能够将外来抗原递送至宿主细胞质和抗原加工途径，该抗原加工途径将抗原加工成肽以呈递在细胞表面上。这种表达外来抗原的载体适用于基因疗法和开发针对范围广泛的病况和疾病的疫苗。
[0143]
痘病毒构成了一个庞大的病毒家族，其特征在于大的线性dsdna基因组、细胞质繁殖场所和复杂的病毒体形态。痘苗病毒是这组病毒的代表性病毒，也是在病毒形态发生方面研究最多的病毒之一。各种痘苗病毒呈现为“砖形”或“卵圆形”的膜结合型颗粒，具有复杂的内部结构，其特征是有壁的双凹核心，侧面为“侧体”。病毒体组装途径涉及构建含膜的新月体，这些新月体形成未成熟病毒体(iv)，然后再演变为成熟病毒体(mv)。痘苗病毒体中含有超过70种特定基因产物，现在已经描述了其中超过50种特定基因的突变对痘苗病毒组
装的影响。
[0144]
合适的减毒痘病毒是本领域技术人员已知的。说明性实例包括减毒的修饰型痘苗病毒安卡拉株(mva)、nyvac、鸟痘病毒(avipox)、金丝雀痘病毒和禽痘病毒(fowlpox)。
[0145]
在本文公开的一个实施方案中，减毒痘病毒是减毒痘苗病毒。痘苗病毒株的说明性实例包括mva、nyvac、哥本哈根(copenhagen)(cop)、西储(western reserve)(wr)、nycbh、惠氏株(wyeth strain)、acam2000、lc16m8和康诺特实验室(connaught laboratories)(cl)。
[0146]
如本文所用的，术语“sementis哥本哈根载体”或“scv”指的是一种基于痘苗病毒的繁殖缺陷型疫苗载体技术平台，其允许在修饰的cho细胞中生产。
[0147]
本领域技术人员应该理解，可以对其它正痘病毒株进行修饰以产生减毒痘病毒。在一个说明性实例中，可以通过对来自痘病毒基因组的编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因进行修饰(例如，缺失、取代或以其他方式破坏其功能)，来产生减毒痘病毒。因此，在本文公开的一个实施方案中，减毒痘病毒是经修饰的正痘病毒，其中该修饰包括编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失。
[0148]
在一个实施方案中，减毒痘病毒是经修饰的痘苗病毒，其中该修饰包括痘苗病毒基因组中编码内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失(或以其他方式破坏其功能)，并且其中该修饰将在宿主细胞(例如，人类细胞)中繁殖(或者可以繁殖)的痘苗病毒载体转化为在宿主细胞中基本上不复制的减毒痘苗病毒载体。
[0149]
在一个实施方案中，必需的内源性组装或成熟基因选自于包含下列的组：cop-a2.5l、cop-a3l、cop-a4l、cop-a7l、cop-a8r、cop-a9l、cop-a10l、cop-a11r、cop-a12l、cop-a13l、cop-a14l、cop-a14.5l、cop-a15l、cop-a16l、cop-a17l、cop-a21l、cop-a22r、cop-a26l、cop-a27l、cop-a28l、cop-a30l、cop-a32l、cop-d2l、cop-d3r、cop-d6r、cop-d8l、cop-d13l、cop-d14l、cop-e8r、cop-e10r、cop-e11l、cop-f10l、cop-f17r、cop-g1l、cop-g3l、cop-g4l、cop-g5r、cop-g7l、cop-h1l、cop-h2r、cop-h3l、cop-h4l、cop-h5r、cop-h6r、cop-i1l、cop-i2l、cop-i6l、cop-i7l、cop-i8r、cop-j1r、cop-j4r、cop-j6r、cop-l1r、cop-l3l、cop-l4r和cop-l5r。
[0150]
本领域技术人员应该理解，可以对其它正痘病毒株进行修饰以改变痘病毒的免疫原性。在一个说明性实例中，可以通过从痘病毒基因组中删除编码免疫调节蛋白的基因，来产生免疫原性增强的痘病毒。因此，在本文公开的一个实施方案中，减毒痘病毒是经修饰的正痘病毒，其中该修饰包括一个或多个编码免疫调节蛋白的基因的缺失。
[0151]
在一个实施方案中，一个或多个免疫调节基因包括选自于包含下列的组中的那些基因，即cop-c23l、cop-b29r、cop-c3l、cop-n1l、cop-a35r、cop-a39r、cop-a41l、cop-a44r、cop-a46r、cop-b7r、cop-b8r、cop-b13r、cop-b16r和cop-b19r。
[0152]
本领域技术人员应该理解，可以对其它正痘病毒株进行修饰以纳入异源dna序列，这些序列可以稳定地插入痘苗病毒基因组特别是基因间区中，而不会破坏或改变编码序列，从而保留病毒的典型特征和基因表达。
[0153]
在一个实施方案中，减毒痘病毒是经修饰的痘苗病毒，其中该修饰包括将外源dna序列，例如源自冠状病毒株的dna序列，插入病毒基因组的基因间区，其中该基因间区继而位于痘苗病毒基因组的两个相邻开放阅读框(orf)之间或者其两侧是两个相邻orf，并且其
中开放阅读框对应于保守基因。
[0154]
在一个实施方案中，可以在其中插入异源dna序列的两个相邻orf之间的一个或多个基因间区包括选自于包含下列的组中的那些基因间区，即001l-002l、002l-003l、005r-006r、006l-007r、007r-008l、008l-009l、017l-018l、018l-019l、019l-02ol、020l-021l、023l-024l、024l-025l、025l-026l、028r-029l、030l-031l、031l-032l、032l-033l、035l-036l、036l-037l、037l-038l、039l-040l、043l-044l、044l-045l、046l-047r、049l-050l、050l-051l、051l-052r、052r-053r、053r-054r、054r-055r、055r-056l、061l-062l、064l-065l、065l-066l、066l-067l、077l-078r、078r-079r、080r-081r、081r-082l、082l-083r、085r-086r、086r-087r、088r-089l、089l-090r、092r-093l、094l-095r、096r-097r、097r-098r、101r-102r、103r-104r、105l-106r、107r-108l、108l-109l、109l-110l、110l-111l、113l-114l、114l-115l、115l-116r、117l-118l、118l-119r、122r-123l、123l-124l、124l-125l、125l-126l、133r-134r、134r-135r、136l-137l、137l-138l、141l-142r、143l-144r、144r-145r、145r-146r、146r-147r、147r-148r、148r-149l、152r-153l、153l-154r、154r-155r、156r-157l、157l-158r、159r-160l、160l-161r、162r-163r、163r-164r、164r-165r、165r-166r、166r-167r、167r-168r、170r-171r、173r-174r、175r-176r、176r-177r、178r-179r、179r-180r、180r-181r、183r-184r、184r-185l、185l-186r、186r-187r、187r-188r、188r-189r、189r-190r、192r-193r(亦参见pct/ep03/05045)。
[0155]
根据旧命名法，orf 006l对应于c10l、019l对应于c6l、020l对应于n1l、021l对应于n2l、023l对应于k2l、028r对应于k7r、029l对应于f1l、037l对应于f8l、045l对应于f15l、050l对应于e3l、052r对应于e5r、054r对应于e7r、055r对应于e8r、056l对应于e9l、062l对应于i1l、064l对应于i4l、065l对应于i5l、081r对应于l2r、082l对应于l3l、086r对应于j2r、087对应于j3r、088r对应于j4r、089l对应于j5l、092r对应于h2r、095r对应于h5r、107r对应于d10r、108l对应于d11l、122r对应于a11r、123l对应于a12l、125l对应于a14l、126l对应于a15l、135r对应于a24r、136l对应于a25l、137l对应于a26l、141l对应于a30l、148r对应于a37r、149l对应于a38l、152r对应于a40r、153l对应于a41l、154r对应于a42r、157l对应于a44l、159r对应于a46r、160l对应于a47l、165r对应于a56r、166r对应于a57r、167r对应于b1r、170r对应于b3r、176r对应于b8r、18or对应于b12r、184r对应于b16r、185l对应于b17l并且187r对应于b19r。
[0156]
在一个实施方案中，可以在其中插入异源dna序列的两个相邻orf之间的一个或多个基因间区包括选自于包含下列的组中的那些基因间区，即f9l-f10l、f12l-f13l、f17r-e1l、e1l-e2l、e8r-e9l、e9l-e10r、i1l-i2l、i2l-i3l、i5l-i6l、i6l-i7l、i7l-i8r、i8r-g1l、g1l-g3l、g3l-g2r、g2r-g4l、g4l-g5r、g5r-g5.5r、g5.5r-g6r、g6r-g7l、g7l-g8r、g8r-g9r、g9r-l1r、l1r-l2r、l2r-l3l、l3l-l4r、l4r-l5r、l5r-j1r、j3r-j4r、j4r-j5l、j5l-j6r、j6r-h1l、h1l-h2r、h2r-h3l、h3l-h4l、h4l-h5r、h5r-h6r、h6r-h7r、h7r-d1r、d1r-d2l、d2l-d3r、d3r-d4r、d4r-d5r、d5r-d6r、d6r-d7r、d9r-d10r、d10r-d11l、d11l-d12l、d12l-d13l、d13l-a1l、a1l-a2l、a2l-a2.5l、a2.5l-a3l、a3l-a4l、a4l-a5r、a5r-a6l、a6l-a7l、a7l-a8r、a8r-a9l、a9l-a10l、a10l-a11r、a11r-a12l、a12l-a13l、a13l-a14l、a14l-a14.5l、a14.5l-a15l、a15l-a16l、a16l-a17l、a17l-a18r、a18r-a19l、a19l-a21l、a21l-a20r、a20r-a22r、a22r-a23r、a23r-a24r、a28l-a29l、a29l-a30l(亦参见pct/ib2007/004575)。
[0157]
在一个实施方案中，该修饰包括a41l基因的缺失。
[0158]
在一个实施方案中，该修饰包括a41l基因和/或d13l基因的缺失。
[0159]
在一个实施方案中，该修饰包括a41l基因和/或d13l基因和/或b7r-b8r基因的缺失。
[0160]
在一个实施方案中，该修饰包括a41l基因和/或d13l基因和/或b7r-b8r基因和/或c3l基因和/或a39r基因的缺失。
[0161]
本领域技术人员应该理解，a41l基因和/或d13l基因和/或b7r-b8r基因和/或c3l基因和/或a39r基因的缺失赋予痘病毒有利的特征，例如减毒和免疫原性增强。
[0162]
在一个实施方案中，该修饰包括将异源dna序列插入位于j2r和j3r基因之间的基因间区。
[0163]
本领域技术人员应该理解，将异源dna序列插入基因间区不会破坏或改变病毒的编码序列。
[0164]
在一个实施方案中，重组scv载体表达一种或多种组装成vlp的结构蛋白和非结构蛋白。
[0165]
在一个实施方案中，sars-cov-2抗原在表达时组装入病毒样颗粒(vlp)。
[0166]
在一个实施方案中，载体表达的蛋白质形成vlp并产生对sars-cov-2抗原或其免疫原性片段的免疫应答。
[0167]
在示例性实施方案中，免疫应答是长期和持久的，因此不需要重复加强接种，但在一个或多个实施方案中，提供本文提供的组合物的一次或多次施用以加强初免引发的免疫应答。
[0168]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0169]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0170]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
[0171]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
[0172]
如本文所用的，刺突蛋白的使用包括旨在将刺突蛋白稳定在其融合前构象的工程化变体，从而防止结构重排，并暴露具有抗原性优势的表面，以引发卓越的免疫应答。这些修饰包括但不限于引入稳定化突变和使用分子钳。
[0173]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0174]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基的核酸序列。
[0175]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0176]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分、在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分、和在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分、以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0177]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽
的s1受体结合结构域亚基，和在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分，以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0178]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含以下核酸序列，所述核酸序列编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基，和在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分，和在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分，以及在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分。
[0179]
在一个实施方案中，本发明提供了一种在动物中诱导保护性免疫应答的方法，该方法防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在禽痘病毒早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的膜多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
[0180]
在一个实施方案中，本发明提供了一种在动物中诱导保护性免疫应答的方法，该方法防止或减少sars-cov-2感染的风险和/或降低covid-19疾病的严重程度，该组合物包含减毒痘病毒，尤其是痘苗病毒，其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
[0181]
在一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中诱导针对sars-cov-2病毒感染的保护性免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用混合组合物，该混合组合物包含等量的包含减毒痘病毒的组合物(其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列)以及包含减毒痘病毒的组合物(其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码sars-cov-2的膜和核衣壳多肽或者其一个或多个免疫原性或功能性部分的核酸序列)。
[0182]
在一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中诱导针对sars-cov-2病毒感染的保护性免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用混合组合物，该混合组合物包含等量的包含减毒痘病毒的组合物(其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列)以及包含减毒痘病毒的组合物(其中该痘病毒基因组已经过修饰并且包含编码sars-cov-2的膜和核衣壳多肽或者其一个或多个免疫原性或功能性部分的核酸序列)。
[0183]
在第一方面，本发明提供了一种在受试者中诱导针对sars-cov-2病毒感染的保护性免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用上述任意组合物。
[0184]
在第二方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物通过类似于sars-cov-2病毒样颗粒来减少sars-cov-2感染的风险。
[0185]
在第三方面，本发明提供了一种用于在动物中产生/提高免疫应答的组合物，该组合物减少sars-cov-2感染和由与sars-cov-2具有基因相似性的冠状病毒导致的任何其他
感染的风险，该组合物包含减毒痘病毒，其中该痘病毒基因组包含编码sars-cov-2的刺突多肽或者其免疫原性或功能性部分，和/或sars-cov-2的膜多肽和核衣壳多肽或者其免疫原性或功能性部分，和/或sars-cov-2的包膜多肽或者其免疫原性或功能性部分的核酸序列。
[0186]
在第四方面，本发明提供了如本文所涵盖的实施方案中的组合物在制备用于在受试者中诱导针对冠状病毒感染的中和性抗体应答和/或保护性免疫应答的药剂中的用途。
[0187]
免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2刺突多肽或刺突多肽的s1受体结合结构域亚基来实现。从历史上看，已经发现冠状病毒如sars-cov或mers-cov的刺突蛋白具有免疫原性，引发体液免疫应答，包括抑制病毒进入宿主细胞的中和抗体，以及细胞介导的免疫应答。免疫原性也可以通过诱导刺突特异性t细胞应答来实现。由scv-covid疫苗诱导的针对sars-cov-2病毒的刺突特异性细胞和体液应答，辅以由痘病毒载体诱导的th1偏态抗体产生，可对sars-cov-2感染提供预防性保护。
[0188]
免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2膜蛋白多肽来实现。在sars-cov中，已经显示膜蛋白在病毒表面大量存在；此外，当用于sars患者的免疫时，膜蛋白诱导高滴度的中和抗体。免疫原性和结构分析表明，在膜蛋白中存在能够触发强健的细胞免疫应答的t细胞表位簇。由于膜蛋白在许多病毒种类中也是高度保守的，因此它是诱导针对sars-cov-2的免疫应答的良好候选抗原。由scv-covid疫苗诱导的针对sars-cov-2病毒的膜特异性细胞和体液应答，辅以由痘病毒载体诱导的th1偏态抗体产生，可对sars-cov-2感染提供预防性保护。
[0189]
免疫原性可以通过从痘病毒载体表达sars-cov-2核衣壳蛋白多肽来实现。最近发现，sars-cov-2感染导致产生主要针对核衣壳抗原的抗体。然而，n抗体一直未得到重视，因为n蛋白抗体不能阻止病毒进入，因此被认为是“非中和”抗体。因此，通过目前用于评估体液免疫的中和测定法无法测量抗n抗体。最近的研究表明，进入细胞内的抗n抗体由抗体受体trim21识别，然后它将关联的n蛋白粉碎。然后展示n蛋白表位以供t细胞检测。由于这种免疫应答机制涉及最终将介导免疫记忆的t细胞，因此针对核衣壳蛋白的抗体可能会刺激对未来感染的长期保护。由scv-covid疫苗诱导的针对sars-cov-2病毒的核衣壳特异性细胞和体液应答，辅以由痘病毒载体诱导的th1偏态抗体产生，可对sars-cov-2感染提供预防性保护。
[0190]
免疫原性可以通过在痘病毒载体内同时表达sars-cov-2刺突蛋白或其部分、膜蛋白多肽、核衣壳蛋白多肽和/或包膜蛋白多肽来实现。这些结构蛋白的联合免疫原性可产生更强健的抗原特异性免疫应答。此外，s、m和n和/或e多肽的存在可能引起形成真实病毒样颗粒(vlp)，即模拟冠状病毒结构但缺乏具有感染性的遗传物质的空病毒壳。由scv-covid疫苗诱导的针对sars-cov-2病毒的抗原和vlp特异性细胞和体液应答，辅以由痘病毒载体诱导的th1偏态抗体产生，可针对covid-19提供预防性保护。由scv-covid疫苗诱导的针对sars-cov-2病毒的vlp特异性细胞和体液应答，辅以由痘病毒载体诱导的th1偏态抗体产生，可针对covid-19提供预防性保护。
[0191]
在本发明的优选形式中，减毒痘病毒选自由痘苗病毒、nyvac和scv组成的组。优选地，减毒痘病毒是经修饰的正痘病毒，其中该修饰包括编码必需的内源性组装或成熟蛋白的基因的缺失。进一步优选的是，该修饰包括d13l基因的缺失，优选还包括k1l基因的缺失。
[0192]
通过以下非限制性实施例进一步描述本文所实现的多种实施方案。实施例1构建疫苗
[0193]
为了构建scv-covid19疫苗，利用沉默突变去除抗原编码序列内的早期转录终止信号，并从头合成抗原性转基因的表达盒或通过pcr从合成的盒构建表达盒。每个盒由以下转基因组成，转基因的侧翼是上游的痘病毒启动子和kozak序列的必要调控元件，以及下游的痘病毒早期转录终止信号，以实现基因表达。也可以包括侧翼内切核酸酶识别位点，以实现分子操纵。示出了下列多肽表达盒的具体示例：带有合成早期/晚期启动子的sars-cov-2刺突多肽(图1a)、带有天然早期/晚期启动子的sars-cov-2刺突多肽(图1b)、带有合成早期/晚期启动子的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基(图1c)、带有禽痘病毒早期/晚期启动子的膜多肽(图1d)、带有合成早期/晚期启动子的核衣壳多肽(图1e)、带有禽痘病毒早期/晚期启动子的膜多肽和带有合成早期/晚期启动子的核衣壳多肽(图1f)、带有合成早期/晚期启动子的包膜多肽(图1g)。
[0194]
然后，使用标准分子生物学方法将转基因表达盒插入适当的同源重组(hr)质粒中，该质粒能够在细菌中增殖。hr质粒包含hr盒，其由与痘病毒基因组位点同源的侧翼重组臂(f1和f2)组成，转基因位于重组臂之间。与痘苗病毒-cop基因组相关的同源重组位点如图2所指示。将转基因表达盒插入重组臂之间，与含有能够对新的重组病毒进行阳性选择的基因(例如，与荧光报告蛋白如绿色或蓝色荧光蛋白(gfp或bfp)组合的cp77、博来霉素抗性或者其它药物选择基因)的其他痘病毒表达盒相邻。选择基因的侧翼是150bp的相同非编码dna序列，从而一旦消除了亲本病毒就可以实现选择基因缺失。为了制备用于病毒构建的hr质粒，使用限制性内切核酸酶消化(例如not i)来释放hr盒。示出了下列hr盒的具体示例：
·
在合成早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽，表达盒两侧是f1和f2重组臂，这些重组臂与痘苗病毒a41l orf侧翼的序列同源(图3a；seq id no:1)，
·
在天然早期/晚期启动子的转录调控下的sars-cov-2刺突多肽，表达盒两侧是f1和f2重组臂，这些重组臂与痘苗病毒a41l orf侧翼的序列同源(图3b；seq id no:2)，
·
sars-cov-2刺突多肽的s1亚基表达盒，表达盒两侧是f1和f2重组臂，这些重组臂与痘苗病毒a41l orf侧翼的序列同源(图3c；seq idno:3)，
·
sars-cov-2膜和核衣壳蛋白表达盒，侧翼是左和右组合臂，这些组合臂与痘苗病毒d13l orf侧翼的序列同源(图3d；seq id no:4)，或者这些组合臂与痘苗病毒j2r和j3rorf同源，从而能够在j2r和j3r之间插入(图3e；seq id no:5)，
·
sars-cov-2膜蛋白表达盒，侧翼是左和右组合臂，这些组合臂与痘苗病毒c3l orf侧翼的序列同源(图3f；seq id no:6)，
·
sars-cov-2核衣壳蛋白表达盒，侧翼是左和右组合臂，这些组合臂与痘苗病毒d13l orf侧翼的序列同源(图3g；seq id no:7)，
·
sars-cov-2包膜蛋白表达盒，侧翼是左和右组合臂，这些组合臂与痘苗病毒b7/b8r orf侧翼的序列同源(图3h；seq id no:8)。
[0195]
简言之，为了构建重组scv-covid19疫苗(图4)，在bc19a-12细胞或sd07-1细胞(其中需要cp77宿主范围选择)中进行同源重组。用scv-smx06以0.01pfu/细胞的感染复数(moi)感染细胞1小时，scv-smx06是一种源自哥本哈根毒株的复制缺陷型痘苗病毒，其
d13l、a39r、b7/b8r和c3l orf缺失。然后使用转染试剂如(qiagen)用经not i消化的同源重组质粒转染受感染的细胞。将受感染/经转染的细胞孵育2至3天，直到可以观察到荧光细胞。使用重复阳性药物选择和基于荧光的单细胞分选从亲本病毒中纯化出重组病毒。在实现亲本病毒去除(通过pcr证实)后，在同源重组和纯化的迭代中插入任何另外的表达盒。在不存在亲本病毒的情况下，去除选择压力以允许在感染bc19a-12细胞期间通过150bp重复序列之间的分子内重组删除选择基因。通过基于荧光的单细胞分选和/或有限稀释来富集和纯化不含选择标志物的病毒。一旦病毒群体不含选择标志物，然后在bc19a-12细胞中扩增候选克隆以产生病毒种子储备(seed stock)，该种子储备通过pcr和dna测序来验证转基因定位和完整性，并通过western印迹或其他免疫染色技术来验证转基因表达。
[0196]
构建策略总结
[0197]
scv源自痘苗病毒的哥本哈根毒株，该毒株经过基因工程化改造以删除d13l(一种编码必需的病毒组装蛋白的基因)，从而有效地使scv病毒无法产生感染性病毒后代。
[0198]
scv-smx06是具有另外的基因缺失，特别是免疫调节基因a39r、b7/b8r和c3l的缺失的一种scv变型。如图2所示，使用同源重组序贯地删除基因，其中删除了f1和f2重组臂之间的d13l、a39r、b7/b8r和c3l区域。scv-smx06是用于构建scv-covid疫苗变体的基础scv病毒。在需要时，通过使用相同的f1和f2重组臂促进将转基因插入缺失位点(图3)。
[0199]
此外，在将sars-cov-2刺突或其免疫原性部分作为转基因插入其中的变体中，a41l orf随着转基因的插入而缺失。在缺乏sars-cov-2刺突或其免疫原性部分的变体中，a41l基因保持未修饰状态。
[0200]
构建scv-covid19病毒以提供单一载体疫苗。可以将单一载体疫苗组合为混合疫苗。
[0201]
通过将scv-smx06的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:1定义的核苷酸序列的表达盒)，并且通过将包含在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19a。
[0202]
通过将scv-smx06的a41l orf替换为编码在天然早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:2定义的核苷酸序列的表达盒)，并且通过将包含在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19b。
[0203]
通过将scv-smx06的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:1定义的核苷酸序列的表达盒)，来构建重组病毒scv-covid19c。
[0204]
通过将scv-smx06的a41l orf替换为编码在天然早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:2定义的核苷酸序列的表达盒)，来构建重组病毒scv-covid19d。
[0205]
通过在scv-smx06的j2r和j3r基因之间插入编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转
录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:5定义的核苷酸序列的表达盒)，来构建重组病毒scv-covid19e。
[0206]
通过将scv-smx06的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基的表达盒(例如，具有seq id no:3定义的核苷酸序列的表达盒)，来构建重组病毒scv-covid19f。
[0207]
通过将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19g。
[0208]
通过将scv-smx06痘苗病毒株的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:1定义的核苷酸序列的表达盒)，并将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，以及通过将编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2包膜多肽的表达盒(例如，具有seq id no:8定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的b7/b8r orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19h。
[0209]
通过将scv-smx06痘苗病毒株的a41l orf替换为编码在天然早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的表达盒(例如，具有seq id no:2定义的核苷酸序列的表达盒)，并通过将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，以及通过将编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2包膜多肽的表达盒(例如，具有seq id no:8定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的b7/b8rorf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19i。
[0210]
通过将scv-smx06痘苗病毒株的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基的表达盒(例如，具有seq id no:3定义的核苷酸序列的表达盒)，并通过将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq idno:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19j。
[0211]
通过将scv-smx06痘苗病毒株的a41l orf替换为编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2刺突多肽的s1受体结合结构域亚基的表达盒(例如，具有seq id no:3定义的核苷酸序列的表达盒)，并通过将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽和在合成早期/晚期启动子转录调控下的核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq idno:4定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，以及通过将编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2包膜多肽的表达盒(例如，具有seq id no:8定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的b7/b8r orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19k。
[0212]
通过将编码在禽痘病毒早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2膜多肽的表达盒(例如，具有seq id no:6定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的c3l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19l。
[0213]
通过将编码在合成早期/晚期启动子转录调控下的sars-cov-2核衣壳多肽的表达盒(例如，具有seq id no:7定义的核苷酸序列的表达盒)插入scv-smx06的d13l orf缺失位点，来构建重组病毒scv-covid19m。
[0214]
scv-covid19病毒疫苗内的sars-cov-2抗原插入区如图5所示。具体而言，在a41l orf中的合成早期/晚期启动子下的sars-cov-2刺突多肽(图5a)，在a41l orf中的天然早期/晚期启动子下的sars-cov-2刺突多肽(图5b)，在a41l orf中的sars-cov-2刺突多肽的s1亚基(图5c)，在d13l orf中的sars-cov-2膜和核衣壳多肽(图5d)，在j2r和j3r之间的基因间位点中的sars-cov-2膜和核衣壳多肽(图5e)，在b7/b8r orf中的sars-cov-2包膜多肽(图5f)，在c3l orf中的sars-cov-2膜多肽(图5g)，以及在d13l orf中的sars-cov-2核衣壳多肽(图5h)。
[0215]
表1汇总了scv-smx06基因组内的scv-covid19插入和缺失位点。对于包含刺突或s1转基因的scv-covid19种类，将a41l基因删除。j2
↓
j3r表示基因间插入位点，在该位点插入抗原，而不修饰相邻的j2r和j3r基因。未修饰的位点用“ ”表示，而
“‑”
表示基因的orf已被删除。表1.示例性scv-covid19插入和缺失位点的汇总 a41ld13lb7/b8rc3la39rj2
↓
j3rscv-covid19as(prps)m和n
‑‑‑
scv-covid19bs(pr7.5)m和n
‑‑‑
scv-covid19cs(prps)
‑‑‑‑
scv-covid19ds(pr7.5)
‑‑‑‑
scv-covid19e
‑‑‑‑
m和nscv-covid19fs1
‑‑‑‑
scv-covid19g m和n
‑‑‑
scv-covid19hs(prps)m和ne
‑‑
scv-covid19is(pr7.5)m和ne
‑‑
scv-covid19js1m和n
‑‑‑
scv-covid19ks1m和ne
‑‑
scv-covid19l
‑‑
m- scv-covid19m n
‑‑‑

[0216]
此外，通过混合相等比例的两种单一载体疫苗，特别是相等比例的scv-covid19c和scv-covid19g，来制备组合疫苗，并通过单一注射(syringe)递送。
[0217]
此外，通过混合相等比例的两种单一载体疫苗，特别是相等比例的scv-covid19d和scv-covid19g，来制备组合疫苗，并通过单一注射递送。
[0218]
此外，通过混合相等比例的两种单一载体疫苗，特别是相等比例的scv-covid19c和scv-covid19e，来制备组合疫苗，并通过单一注射递送。
[0219]
此外，通过混合相等比例的两种单一载体疫苗，特别是相等比例的scv-covid19d和scv-covid19e，来制备组合疫苗，并通过单一注射递送。实施例2单次疫苗接种scv-covid19d在远交系和近交系小鼠中产生中和性sars-cov-2抗
体和th1偏态抗体谱实验策略
[0220]
通过肌内施用scv-covid19d(107、108pfu)或载体对照scv-smx06对6-9周龄雄性c57bl/6小鼠组或arc swiss小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种。在疫苗接种前和接种后21天获取血样。通过终点elisa和中和测定法确定s1特异性igg水平和sars-cov-2病毒特异性中和抗体的水平。
[0221]
两组小鼠用于解释遗传杂合性。第一组使用近交系小鼠品系c57bl/6把表型变异性或性状变异性减少到最低限度，从而提高可重复性，而第二组使用远交系小鼠品系swiss来代表遗传多样性，因此更具整个群体的应答的普遍性。病毒中和测试
[0222]
将血清在56℃热灭活30分钟，并在-80℃储存，直至处理当天。还培养含有vero细胞的96孔板，以确保在处理当天达到单层汇合。在中和测定当天，在最低必需培养基(mem)中制备两倍连续稀释的血清，并用由mem和抗生素以及胰蛋白酶组成的感染培养基洗涤vero平板。将100tcid
50
/50μl的sars-cov-2添加到每个稀释度的预制血清稀释液中，并在室温孵育1小时，偶尔摇动。然后将病毒:血清混合物加入到vero细胞中，并在37℃和5％co2下孵育，随后在显微镜下进行监测并在规程后4天对细胞病变效应进行评分。病毒中和滴度表示为仍能抑制病毒复制的血清最高稀释度的倒数值。小鼠血清的酶联免疫吸附测定
[0223]
用溶于pbs中的s1(120ng/孔)来包被maxisorp平板(nunc)，在4℃下进行过夜吸附。用pbs/吐温(0.05％v/v)洗涤平板，并在室温下使用溶于pbs/吐温中的3％脱脂乳封闭孔1小时。加入系列稀释的小鼠血清样品，并在室温下孵育2小时。洗涤平板，在所有孔中加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg，在室温下放置1小时。洗涤后，加入tmb液体底物(sigma)，并使用3m hcl来终止反应。在450nm处测量每个孔的光密度(od)值。终点滴度计算如下：绘制log
10 od对log
10
样品稀释度的曲线，并对该曲线的线性部分进行回归分析，从而计算出终点滴度。当od读数达到阴性血清样品的平均吸光度值加上三倍标准差时，就计算出终点滴度。igg亚类elisa的结果用od值呈现。结果
[0224]
在接种scv-covid19d的所有小鼠中检测到病毒特异性中和抗体(图6a)。在107pfu的接种剂量，远交系swiss小鼠和近交系c57bl/6小鼠产生的中和抗体的滴度高于scv-smx06，在相同剂量下，远交系和近交系小鼠的中和抗体水平相当。在对swiss小鼠接种108pfu剂量的情况下，中和抗体滴度有所增加。在远交系swiss品系和c57bl/6小鼠中还检测了针对刺突蛋白s1亚基的总igg滴度(图6b)。通过elisa对igg亚类的分析显示，与igg1相比，s1特异性igg2c的水平更高，表明疫苗接种后主要是th1应答(图6c)。实施例3单次疫苗接种scv-covid19d产生刺突特异性cd8 t细胞应答
[0225]
t细胞对于早期控制和清除呼吸系统的许多病毒感染是关键性的。最近在转基因小鼠模型中的研究提供了证据，证明在sars-cov-2感染后，t细胞被用于病毒清除和疾病消退。在此，我们明确了疫苗接种scv-covid19d是否会引发早期t细胞应答，这可能有利于减轻疾病的严重程度。
实验策略
[0226]
通过以107pfu的剂量肌内施用scv-covid19d或载体对照scv-smx06，对6-9周龄雄性c57bl/6小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种。疫苗接种后3个月，通过elispot和胞内细胞因子染色(ics)检测刺突特异性t细胞应答(使用跨越刺突蛋白全长的肽)。elispot测定
[0227]
通过将鼠脾细胞穿过70μm细胞过滤器和进行ack裂解，然后在完全培养基中重新悬浮，制备鼠脾细胞单细胞悬液的稀释液。为了通过elispot分析干扰素-γ(ifnγ)的产生，将pvdf elispot板(mabtech)与抗小鼠ifnγ包被抗体一起孵育过夜，然后用细胞培养基封闭。在37℃含5％co2的湿化培养箱中，将细胞稀释液与跨越整个刺突蛋白的肽的池(每种肽为2μg/ml)在elispot板中一起孵育18至20小时。刺激后，通过以抗小鼠ifnγ生物素检测抗体对膜进行染色，然后加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，并用bcip/nbt底物试剂盒(mabtech)进行显色，来检测ifnγ斑点形成单位(sfu)。使用elispot读数仪对代表分泌细胞因子的t细胞的斑点进行定量。胞内细胞因子染色分析
[0228]
为了补充和验证elispot结果，还测定了ifnγ的胞内细胞因子产生。用跨越整个刺突蛋白的肽的池(每种肽为2μg/ml)以及蛋白转运抑制剂brefeldin a在37℃刺激细胞6小时。对细胞进行表面标志物cd3和cd8的染色，然后用4％多聚甲醛固定。使用bd的cytofix/perm缓冲液对细胞进行透化，并进行针对ifnγ的细胞内染色。在facs aria 2(bd)上进行样品采集，并在flowjo v10(treestar)中分析数据。通过对双阴性活淋巴细胞、大小、cd3

、cd8

细胞和ifnγ细胞因子阳性进行门控来鉴定分泌细胞因子的t细胞。结果
[0229]
通过ics(图7a)和elispot(图7b)，在scv-covid19d接种的小鼠中检测到与载体对照相比，刺突特异性的产生ifnγ

的t细胞应答显著增加。载体对照组的可检测应答低(《100sfu)或极少(图15b)。结论
[0230]
本文的实施例2和3表明，用编码sars-cov-2刺突蛋白的scv-covid19疫苗对动物模型进行疫苗接种诱导了细胞和体液应答，表现为s1特异性抗体、中和抗体的产生和刺突特异性的分泌ifnγ的cd8

t细胞增加。这些表明，scv-covid19疫苗可以对covid-19的感染因子sars-cov-2提供预防性保护。实施例4scv-covd19c比scv-covid19d和scv-covid19f引发更好的刺突特异性抗体
[0231]
scv-covid19c和scv-covid19d疫苗在用于表达抗原的痘病毒启动子类型上有所不同。scv-covid19c和scv-covid19f疫苗在插入的转基因长度上有所不同，其中scv-covid19c包含刺突蛋白的全长，而scv-covid19f仅包含刺突蛋白的s1亚基。在此，我们通过western印迹比较了三种疫苗的抗原表达效率，并使用elisa评估了它们诱导刺突s1特异性抗体应答的能力。实验策略
[0232]
用scv-covid19c、scv-covid19d和scv-covid19f感染细胞系，并通过western印迹检测刺突蛋白或s1亚基的表达。通过以每只小鼠107pfu的剂量肌内施用scv-covid19c、
scv-covid19d、scv-covid19f或载体对照scv-smx06，对6-9周龄雄性c57bl/6小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种，并通过elisa评估刺突s1特异性抗体应答。western印迹
[0233]
将scv-covid19c、scv-covid19d和scv-covid19f浓缩物溶解在上样缓冲液中，将8ug等量总蛋白的每个样品在10％sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素滤膜上。将膜封闭并与1:1000稀释的针对sars-cov-2刺突rbd的兔单克隆抗体(sino biological 40592-t62)一起孵育。使用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗兔igg检测结合的抗体，然后使用clarity ecl和tmb(sigma)对膜进行增强型化学发光。s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定
[0234]
用pbs中的s1(120ng/孔)来包被maxisorp板(nunc)，在4℃进行过夜吸附。用pbs/吐温(0.05％v/v)洗涤板，并在室温使用溶于pbs/吐温中的3％脱脂乳封闭孔1小时。加入系列稀释的小鼠血清样品，并在室温孵育2小时。洗涤平板，在所有孔中加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg，在室温放置1小时。洗涤后，加入tmb液体底物(sigma)，并使用3m hcl来终止反应。在450nm处测量每个孔的光密度(od)值。终点滴度计算如下：绘制log
10 od对log
10
样品稀释度的曲线，并对该曲线的线性部分进行回归分析，从而计算出终点滴度。当od读数达到阴性血清样品的平均吸光度值加上三倍标准差时，就计算出终点滴度。结果
[0235]
图8a示出了通过western印迹在细胞裂解物中的sars-cov-2刺突蛋白的表达。scv-covid19c和scv-covid19d的裂解物均显示了180kda的条带，反映了全长刺突蛋白的表达，而scv-covid19f的裂解物显示了80kda的条带，反映了刺突蛋白s1亚基的表达。然而，与scv-covid19d相比，scv-covid19c表现出更强的信号，表明在合成早期/晚期启动子下更有效地表达刺突蛋白。在免疫后21天时，通过elisa比较s1特异性抗体应答，证实了由scv-covid19c诱导的抗体滴度高于scv-covid19d或scv-covid19f(图8b)。结论
[0236]
实施例4表明，与scv-covid19d疫苗相比，具有在合成早期/晚期启动子调控下的刺突蛋白的scv-covid19c疫苗表达更高水平的刺突蛋白。抗体滴度表明，与scv-covid19d或scv-covid19f相比，scv-covid19c的免疫原性量级更高。以下实施例进一步研究了scv-covid19c疫苗的有效性。实施例5单次疫苗接种scv-covid19c在近交系和远交系小鼠中诱导抗体应答实验策略
[0237]
通过以每只小鼠107pfu的剂量肌内施用scv-covid19c或仅含载体的对照smx06，对6-9周龄雌性近交系c57bl/6小鼠组和arc小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种。在疫苗接种前和疫苗接种后第14天获取血液样品。通过终点elisa和伪中和测定法(cpass
tm
；genscript)确定刺突(s1)蛋白特异性igg水平和sars-cov-2病毒特异性中和抗体水平。
[0238]
两组小鼠用于解释遗传杂合性的变异。第一组使用近交系小鼠品系c57bl/6把表型变异性或性状变异性减少到最低限度，从而提高可重复性，而第二组使用远交系小鼠品系swiss来代表遗传多样性，因此更具整个群体的应答的普遍性。s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定
[0239]
用pbs中的s1(120ng/孔)来包被maxisorp板(nunc)，在4℃进行过夜吸附。用pbs/吐温(0.05％v/v)洗涤板，并在室温使用溶于pbs/吐温中的3％脱脂乳封闭孔1小时。加入系列稀释的小鼠血清样品，并在室温孵育2小时。洗涤板，在所有孔中加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg，在室温放置1小时。洗涤后，加入tmb液体底物(sigma)，并使用3m hcl来终止反应。在450nm处测量每个孔的光密度(od)值。终点滴度计算如下：绘制log
10 od对log
10
样品稀释度的曲线，并对该曲线的线性部分进行回归分析，从而计算出终点滴度。当od读数达到阴性血清样品的平均吸光度值加上三倍标准差时，就计算出终点滴度。cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测
[0240]
cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测试剂盒(genscript,usa)是一种阻断型elisa，用于直接定性检测血清和血浆中针对sars-cov-2的总中和抗体。感染sars-cov-2引发免疫应答，包括在血液中产生抗体或结合抗体。使用纯化的受体结合结构域(rbd)、来自病毒刺突(s)蛋白的蛋白质和宿主细胞受体ace2，该测试通过试管或elisa板的孔中的直接蛋白质-蛋白质相互作用来模拟病毒-宿主相互作用。然后，可以中和高度特异性的相互作用，这与常规病毒中和测试中的方式相同。简言之，将样品和对照用样品稀释缓冲液稀释，并与hrd缀合的rbd预孵育，以使循环中和抗体与hrp-rbd结合。然后将混合物加入预先包被有ace2蛋白的捕获板中。未结合的hrp-rbd以及与非中和抗体结合的hrp-rbd将被捕获在板上，而循环中的中和抗体hrp-rbd复合物保留在上清液中并在洗涤过程中被去除。在洗涤循环之后，加入tmb底物溶液，随后加入终止溶液，然后将反应淬灭，颜色变为黄色。在微孔板读数仪中于450nm处读取终溶液的吸光度，并使用以下公式确定信号抑制百分比：信号抑制百分比＝(1
–
样品od值/阴性对照od值)x100％
[0241]
信号抑制百分比指的是定性检测sars-cov-2总中和抗体。该cpass
tm
试剂盒已获得美国食品药品监督管理局(fda)的批准，用于评价疫苗功效和评估群体免疫。结果
[0242]
图9a示出了在疫苗接种后第14天，与仅含载体的对照smx06相比，在接种scv-covid19c的两组小鼠中观察到的s1特异性igg水平。在近交系和远交系小鼠中均检测到s1特异性igg(图9a)，与近交系小鼠相比，远交系小鼠产生了更高水平的抗体(图9b)。与此相一致的是，与近交系c57bl/6小鼠相比，通过cpass测定在远交系arc小鼠中检测到更高水平的中和抗体(图9c)，与载体对照smx06相比，两个组都产生了更高的中和抗体。这些结果表明，scv-covid19c可以在远交系小鼠(代表了遗传杂合性，因此可以转换至人类种群)和近交系小鼠中均诱导具有中和能力的刺突特异性抗体。基于这些结果和c57bl/6的试剂可获得性，选择近交系小鼠作为进一步研究疫苗介导的免疫应答的实验模型。实施例6单次疫苗接种scv-covid19c诱导强健的刺突特异性t细胞应答
[0243]
t细胞对于早期控制和清除呼吸系统的许多病毒感染是关键性的。最近在转基因小鼠模型中的研究提供了证据，证明在sars-cov-2感染后，t细胞被用于病毒清除和疾病消退。在此，我们明确了用scv-covid19c免疫是否会引发早期t细胞应答，这将可能有利于减轻疾病的严重程度。实验策略
[0244]
将雄性(每组n＝3只)和雌性(每组n＝3只)6-9周龄的c57bl/6小鼠分成三组：(1)
幼稚小鼠/无疫苗，(2)用仅含载体的对照smx06疫苗接种的小鼠，和(3)疫苗接种单剂scv-covid19c(107pfu)的小鼠。方法
[0245]
在疫苗接种后第7天，采集并处理脾脏，用于通过流式细胞术进行单细胞表征。通过标准方法从脾脏中分离出单细胞制备物。简言之，使用小型注射器的柱塞，通过70μm细胞过滤器挤压脾脏。将所得单细胞悬液离心(300
×
g,5分钟)，并在1ml氯化铵钾(ack)裂解缓冲液中重悬5分钟以除去红细胞。然后加入补充有10％胎牛血清(fbs)的rpmi培养基来中和裂解缓冲液。用pbs洗涤脾细胞两次，并以2x107个细胞/ml重悬，为多参数流式细胞术做准备。
[0246]
使用如实施例3中所述的胞内细胞因子染色来评估cd8和cd4 t细胞应答。胞内细胞因子染色用于使用图10所示的门控策略来评估细胞因子ifn-γ、tnf-α和il-2的产生。还通过流式细胞术测量了颗粒酶b的产生，颗粒酶b是由效应cd8 t细胞产生的关键细胞毒性效应分子。
[0247]
两个肽池由跨越sars-cov-2刺突蛋白s1和s2区域的重叠肽构成，用于测量疫苗介导的cd8 t细胞和cd4 t细胞应答的特异性。刺突池1由15aa长度的肽构成，其中重叠的11聚体跨越s1的整个序列，而刺突池2由15aa长度的肽构成，其中重叠的11聚体跨越s2的整个序列。另外，肽混合物(pepmix)包含重叠肽池，该重叠肽池包含s1的rbd区内的免疫显性t细胞表位ynylyrlf(seq id no:9)、vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11)。以前在sars-cov的cd8 t细胞活化的小鼠研究中鉴定了这些t细胞表位。用每种条件下2μg/ml的每种肽以及蛋白转运抑制剂brefeldin a在37℃刺激细胞6小时，并通过ics分析产生的细胞因子。结果：刺突特异性的三细胞因子阳性cd8 t细胞应答
[0248]
疫苗接种后第7天的胞内细胞因子染色显示，单剂scv-covid19c(图11a；下图)引起刺突特异性ifn-γcd8 t细胞的数量显著增加，而来自幼稚(图11a；上图)和仅含载体的对照小鼠(图11a；中图)的cd8 t细胞产生最低水平的ifn-γ。scv-covid19c疫苗接种后诱导的刺突特异性的产生ifn-γ的t细胞具有多功能性，并分泌其它细胞因子，其中超过一半也产生tnf-α。约15％的细胞也被归类为三细胞因子产生者(ifn-γ、tnf-α和il-2)，并且这些细胞被认为是优质t细胞应答的标志(图11a；下图)。
[0249]
图11b是在所有实验小鼠组中，刺突池1(s1)特异性(左图)、刺突池2(s2)特异性(中图)和表位特异性(ynylyrlf(seq id no:9)、vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11)；右图)的产生单细胞因子、双细胞因子和三细胞因子的ifn-γcd8 t细胞的数量的图形表征。结果：刺突特异性的产生颗粒酶b的cd8 t细胞应答
[0250]
与幼稚小鼠相比，疫苗接种之后，scv-covid19c生成了产生颗粒酶b的cd8 t细胞(图11c)。结果：刺突特异性的产生ifn-γ的cd4 t细胞应答
[0251]
为了评估单次疫苗接种scv-covid19c是否诱导抗原特异性cd4t细胞应答，用跨越sars-cov-2的s1(池1)和s2(池2)区域的肽池再刺激脾细胞。疫苗接种scv-covid19c诱导了s1和s2特异性的产生三细胞因子的cd4 t细胞，这表示在图11d中。结论
[0252]
单次疫苗接种scv-covid19c产生具有细胞毒性潜力的cd8 t细胞(产生颗粒酶b)和刺突特异性多功能cd8和cd4 t细胞。实施例7在施用单剂scv-covid19c疫苗后，既有免疫并不会影响刺突特异性抗体应答的量和质量
[0253]
既有免疫对病毒载体的影响是开发病毒载体疫苗的主要问题。使用基于正痘病毒的疫苗有一个潜在的缺点，即由于直到20世纪70年代中期实施的天花疫苗接种计划并最终完成天花的消灭，一部分成年人群对疫苗载体具有免疫力。因此，人们非常担心正痘病毒特异性的既有免疫会干扰后续的scv-covid19疫苗接种，这可能会导致疫苗的免疫原性和功效降低。在此，我们在临床前小鼠模型中研究了既有痘苗病毒免疫力对单次接种scv-covid19c或同源初免-加强接种同一疫苗的免疫原性的影响。实验策略
[0254]
将6-9周龄雌性和雄性c57bl/6混合小鼠(每组n＝5只小鼠)分成两个处理组：(1)在以107pfu/小鼠的剂量疫苗接种scv-covid19c前40天，施用痘苗病毒以诱导针对痘病毒的既有免疫状态的小鼠，和(2)不存在既有免疫的幼稚小鼠，以107pfu/小鼠的剂量疫苗接种scv-covid19c。
[0255]
使用疫苗接种后第28、44和80天获取的血液样品来监测抗原特异性抗体应答的量级和持久性。通过终点elisa和伪中和测定法(cpass
tm
；genscript)确定刺突(s1)蛋白特异性igg水平和sars-cov-2病毒特异性中和抗体水平。方法
[0256]
s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定和cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测如实施例5所述。结果
[0257]
单次接种scv-covid19c，在疫苗接种后第28天、44天和80天，对存在既有免疫和不存在既有免疫的小鼠诱导了可比水平的s1特异性抗体(图12a)。与此数据一致的是，两组小鼠的中和抗体水平(使用genscript的cpass
tm
试剂盒进行测定)也可比(图12b)。既有免疫力不影响初免-加强疫苗接种后的抗体应答实验策略
[0258]
将6-9周龄雌性和雄性c57bl/6混合小鼠分成两个处理组：(1)在采用同源初免-加强策略(在第0天和第28天)疫苗接种scv-covid19c前40天，施用痘苗病毒以诱导针对痘病毒的既有免疫状态的小鼠，和(2)不存在既有免疫的幼稚小鼠，采用同源初免-加强策略(在第0天和第28天)疫苗接种scv-covid19c。
[0259]
在第28天(加强免疫之前)和加强剂后第14天和第50天获取血液样品，以监测抗体应答的量级和持久性。通过终点elisa和伪中和测定法(cpass
tm
；genscript)确定刺突(s1)蛋白特异性igg水平和sars-cov-2病毒特异性中和抗体水平。方法
[0260]
s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定和cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测如实施例5所述。结果
[0261]
在d28时施用加强剂后，观察到刺突(s1)特异性抗体应答显著增加。既有免疫不影响s1特异性抗体水平(图13a)和中和抗体水平(图13b)。结论
[0262]
无论是以单剂还是采用同源初免-加强策略疫苗接种scv-covid19c后，既有免疫都不影响抗原特异性抗体应答的质量、量或动力学。实施例8单次疫苗接种scv-covid19c在衰老小鼠中诱导抗原特异性抗体应答
[0263]
年龄是sars-cov-2感染后不良健康结果的最严重风险因素之一，因此，期望任何新的候选疫苗都应该在更年长成人中引发强健的免疫应答。在此，我们在衰老小鼠中测试了单剂scv-covid19c疫苗接种诱导的抗体应答。实验策略
[0264]
为了根据年龄评估抗体应答水平，通过肌内施用scv-covid19c(107pfu/小鼠)，对6-9周龄雌性(n＝10；称为年轻小鼠)和9-10月龄雌性(n＝20；称为衰老小鼠)c57bl/6小鼠组进行疫苗接种。在疫苗接种后第14天和第21天收集血液样品并分离出血清用于抗体分析。通过终点elisa和伪中和测定法(cpass
tm
；genscript)确定刺突(s1)蛋白特异性igg水平和sars-cov-2病毒特异性中和抗体水平。方法
[0265]
s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定和cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测如实施例5所述。结果
[0266]
在疫苗接种后第14天和第21天，年轻小鼠和衰老小鼠的s1特异性抗体水平相当(图14a)。同样，在疫苗接种后第14天和第21天，未检测到年轻和衰老小鼠之间的中和抗体滴度的差异(图14b)。结论
[0267]
单剂scv-covid19c在衰老小鼠中诱导的抗原特异性免疫应答与在年轻小鼠中观察到的水平相当。实施例9同源初免-加强引起抗体应答的显著加强，这种加强在疫苗接种后维持长达3个月
[0268]
为了测试初免-加强策略是否能在年轻和衰老小鼠中增强体液应答，对同源初免-加强方法进行了评估。实验策略
[0269]
在年轻小鼠和衰老小鼠中，在接受第一针(初免剂)scv-covid19c(107pfu)疫苗后二十八(28)天，通过肌内注射施用scv-covid19c(107pfu)的加强剂。在加强免疫后21天时，获取血液样品用于评估s1特异性抗体水平和中和抗体滴度。为了进行持久性研究，在加强免疫后3周、9周和12周时，获取血液样品用于评估s1特异性抗体滴度和中和抗体的抑制百分比。方法
[0270]
s1特异性抗体终点滴度的酶联免疫吸附测定和cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测如实施例5所述。
结果
[0271]
采用同源初免-加强疫苗接种方案施用加强剂的scv-covid19c，在加强免疫后21天时，在年轻和衰老小鼠中均显著增加了刺突(s1)特异性抗体和中和抗体应答(图15a、15b)。在加强免疫后第21天时，未发现年轻和衰老小鼠之间的中和抗体水平存在统计学差异。在加强免疫后第3、9和12周时对中和抗体水平进行了分析，并且观察到抗体水平得以维持，在年轻和衰老小鼠的时间匹配的比较中未发现显著性差异(图15c)。结论
[0272]
第二剂scv-covid19c疫苗的施用显著提高了刺突特异性抗体应答的量和质量，其中抗体应答在加强免疫后维持长达3个月(在分析时)。实施例10scv-covid19c的同源初免-加强诱导长期t细胞应答
[0273]
记忆型cd8 t细胞的存在对病毒感染应答时特别重要，因为它通过促进有效的病原体清除来补充体液应答。如果中和抗体的保护能力或量级受损，t细胞记忆可作为强大的二级防御。最重要的是，长期t细胞应答可能表明疫苗接种所赋予的免疫力可以是持久的。实验策略
[0274]
将处理组分为两个分组：6-9周龄年轻小鼠和9-10月龄衰老小鼠。在每个分组中，以单次注射scv-covid19c(107pfu)、在初免后第28天施用第二针(107pfu、107pfu)的同源初免-加强、或仅含载体的对照smx06，对小鼠进行免疫。方法
[0275]
利用多色流式细胞术将记忆型t细胞群表征为短寿效应型细胞(t
sle
；通过cd44、klrg1的高表达和cd62l的低表达来鉴定)、效应记忆型细胞(t
em
；通过cd44的高表达以及klrg1和cd62l的低表达来鉴定)和中央记忆型细胞(t
cm
；通过cd44和cd62l的高表达以及klrg1的低表达来鉴定)(图16)。
[0276]
elispot测定法(之前描述)用于对产生ifn-γ的t细胞进行定量，而胞内细胞因子染色(之前描述)用于鉴定能够产生细胞因子如ifn-γ、tnf-α和il-2的细胞。
[0277]
为了评估scv-covid19c疫苗接种引发的ifn-γt细胞应答的性质，我们用跨越以下区域的序列的三种不同肽池对cd8 t细胞进行再刺激：没有rbd的s1、rbd和rbd后剩余的s1区域，以及s2。结果：同源初免-加强扩大了cd8效应t细胞群
[0278]
图17a显示了单剂或初免-加强接种scv-covid19c的年轻和衰老小鼠中效应记忆型和中央记忆型cd8 t细胞的总数。结果表明，初免-加强疫苗接种引起效应记忆型细胞显著增加，在短寿效应型细胞群和效应记忆型细胞群中都如此。在年轻小鼠中观察到在施用加强剂之后，中央记忆型t细胞显著增加，然而在衰老小鼠中未观察到这种差异。结果：同源初免-加强增加t细胞记忆
[0279]
在年轻和衰老小鼠中，与仅用载体的对照小鼠相比，单次接种scv-covid19c疫苗诱导的刺突特异性ifn-γt细胞应答显著增加。施用加强剂的结果是刺突特异性ifn-γt细胞的显著增加，这在年轻和衰老小鼠中都能观察到(图17b)。
[0280]
通过用跨越s1区域(无rbd；池1)、rbd和剩余的s1区域(池2)和s2区域(池3)的肽池对t细胞进行再刺激，进一步将刺突特异性t细胞应答剖析为s1、rbd或s2特异性的。在年轻
和衰老小鼠中均检测到针对s1、rbd和s2区域的ifn-γt细胞应答，表明t细胞应答的范围广泛。产生ifn-γ的t细胞应答主要针对rbd区域，这可以从通过elispot的ifn-γ斑点形成单位(图17c)、通过胞内细胞因子染色的产生ifn-γ的cd8 t细胞百分比(图17d)和产生三细胞因子的阳性(ifn-γ、tnf-α、il2)cd8 t细胞数量(图17e)中得到证明。正如预期的那样，与单剂疫苗接种相比，在初免-加强方案中观察到抗原特异性t细胞群的显著增加。结论
[0281]
按照单针疫苗接种方案，接种scv-covid19c在年轻和衰老小鼠中均诱导针对刺突蛋白两个亚基(s1和s2；主要针对s1亚基的rbd区域)的多功能cd8 t细胞应答。采用同源初免-加强疫苗接种策略，在年轻和衰老小鼠中均观察到原特异性的产生抗ifn-γ的t细胞应答和效应记忆型群体的显著增加。实施例11scv-covid19c的同源初免-加强可能潜在地与sars-cov发生交叉反应，这是基于刺突rbd中的cd8 t细胞表位实验策略
[0282]
通过以107pfu/小鼠的剂量肌内施用scv-covid19c或仅含载体的对照，对6-9周龄雌性小鼠和9-10月龄小鼠进行疫苗接种，并在疫苗接种后第7天时，通过elispot分析表位特异性t细胞应答。方法
[0283]
利用elispot测定法(先前描述)和胞内细胞因子染色(先前描述)对用rbd区域中的两个cd8 t细胞表位再刺激之后的产生ifn-γ的t细胞进行定量，这两个表位在sars-cov和sars-cov-2之间具有100％的保守性(vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11))。结果
[0284]
通过elispot(图18a)和ics(图18b)，与载体对照相比，在scv-covid19c接种的小鼠中检测到表位特异性的产生ifn-γ的t细胞应答显著增加。结论
[0285]
在接种scv-covid19c后，产生了针对cd8 t细胞表位vvlsfell(seq id no:10)和vnfnfngl(seq id no:11)(它们在sars-cov和sars-cov-2之间保守)的产生ifn-γ的t细胞应答，这表明该疫苗可能能够针对sars-cov和sars-cov-2都提供预防性保护。实施例12单次疫苗接种scv-covid19a产生刺突和膜特异性的cd8 t细胞应答实验策略
[0286]
通过肌内施用scv-covid19a(107pfu/小鼠)或载体对照scv-smx06，对6-9周龄雄性c57bl/6小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种。在疫苗接种后21天采集血液样品，并通过elispot检测针对刺突蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白的t细胞应答。方法
[0287]
利用elispot测定法(如前所述)对产生ifn-γ的t细胞进行定量。为了评估scv-covid19a疫苗接种引发的ifn-γt细胞应答的性质，我们用跨越以下区域的序列的三种不同肽池对cd8 t细胞进行再刺激：没有rbd的s1、rbd和rbd后剩余的s1区域，以及s2。为了确
定是否产生了针对膜或核衣壳的cd8 t细胞应答，用跨越膜蛋白和核衣壳蛋白序列的肽池对细胞进行再刺激。结果
[0288]
跨s1、rbd和s2区域，在scv-covid19a疫苗接种的小鼠中检测到与载体对照相比，刺突特异性的产生ifnγ

的t细胞应答的显著增加(图19a)。与载体对照相比，显示出膜特异性的产生ifnγ

的t细胞应答显著提高(图19b)，而核衣壳特异性t细胞应答在scv-covid19a接种小鼠和载体对照之间是相当的(图19c)。结论
[0289]
单剂scv-covid19疫苗接种诱导了广泛宽度的t细胞应答，这表现为刺突特异性和膜特异性的分泌ifnγ的cd8

t细胞的增加。实施例13单次疫苗接种等比例的scv-covid19c和scv-covid19g诱导刺突特异性抗体应答和针对刺突蛋白和膜蛋白的cd8

t细胞应答实验策略
[0290]
通过肌内施用含有等比例的scv-covid19c(107pfu/小鼠)和scv-covid19g(107pfu/小鼠)的混合疫苗或载体对照scv-smx06，对6-9周龄雄性c57bl/6小鼠组(每组n＝5只小鼠)进行疫苗接种。在疫苗接种后21天收集血液样品并分离出血清用于抗体分析。通过elisa测定刺突(s1)特异性抗体应答，并通过elispot和ics检测针对刺突蛋白和膜蛋白的t细胞应答。方法
[0291]
如前所述进行s1特异性抗体水平的酶联免疫吸附测定。elispot测定法(如前所述)用于使用跨越蛋白质整个长度的肽来鉴定刺突和膜特异性的产生ifn-γ的t细胞应答。结果
[0292]
在免疫后21天时，通过elisa评估s1特异性抗体应答。与仅载体的smx06对照相比，接种由scv-covid19c和scv-covid19g构成的混合疫苗产生了显著更高的s1特异性抗体应答(图20a)。单次接种混合疫苗后，通过ics检测到的刺突特异性的产生ifnγ

的t细胞的水平也高于载体对照(图20b)。与载体对照相比，接种混合疫苗引起针对跨越刺突蛋白和膜蛋白全长的肽的抗原特异性斑点形成单位(sfu)的显著增加(图20c)。结论
[0293]
本文实施例13表明，用由分别编码sars-cov-2刺突蛋白以及sars-cov-2膜和核衣壳蛋白的scv-covid19c和scv-covid19g构成的混合疫苗对动物模型进行免疫，诱导了细胞和体液应答，这表现为s1特异性抗体的产生和刺突特异性的分泌ifnγ的cd8

t细胞的增加。这些表明，混合的scv-covid19疫苗可以针对covid-19的感染因子sars-cov-2提供预防性保护。实施例14为了确定与从单一载体表达每种优势抗原相比，从同一载体表达多种优势抗原是否不利于激发最佳免疫应答
[0294]
当组合不同的减毒活病毒疫苗时，病毒之间的竞争是最常见的问题。可以通过增加组合疫苗的剂次或调整每种疫苗组分的剂量来克服来自优势疫苗组分的竞争，从而规避
这一问题。
[0295]
据报道，在三价白喉-百日咳-破伤风疫苗的组分之间、犬瘟热菌苗和犬瘟热活病毒之间以及当博德特氏菌(bordetella)用作瘟热病毒、2型腺病毒、细小病毒和副流感病毒联合活疫苗的稀释剂时，都存在通过“免疫干扰”进行的抗原性竞争。在某些情况下，接种多组分疫苗引发的抗体比单独施用这些组分时要少。在其它情况下，对一种抗原的应答占优势，而对其他抗原的应答受到压制。在其他情况下，当发生相互竞争时，对所有组分的应答都降低。
[0296]
已经显示抗原性竞争的程度取决于疫苗接种的许多参数，包括竞争性抗原的相对接种部位、抗原施用之间的时间间隔以及优势抗原相对于受压制抗原的剂量。
[0297]
尽管上述问题可以通过从同一载体表达来自几种致病剂的免疫抗原来解决，从而确保每种免疫抗原对免疫系统的同等呈现，并且对于用于抗原递送的单一载体，只需要考虑载体的最佳疫苗接种途径，但是由于抗原呈递细胞如b细胞和树突细胞对抗原的优先捕获和mhc呈递，存在可能发生抗原干扰的风险。具有优势b细胞和/或t细胞表位的抗原将产生比具有次优b细胞或t细胞表位的抗原更强的免疫应答。因此，当用表达来自多种致病剂的多种抗原的单一载体进行接种时，这将导致针对最优势抗原的偏态免疫应答。
[0298]
进行了一项研究以确定来自多种致病病毒的多种优势抗原的表达是否会干扰彼此的免疫应答。从同一载体表达两种优势抗原可能会干扰彼此激发针对其各自病毒的强力免疫应答的能力，即一种优势抗原可能比另一种更具优势。
[0299]
为了确定与从单一载体表达每种优势抗原相比，从同一载体表达多种优势抗原是否不利于激发最佳免疫应答，在小鼠中进行了一项疫苗接种研究。实验策略
[0300]
用重组病毒scv-covid19a或scv-covid19b，或者scv-covid19c、scv-covid19d或scv-covid19e的混合物，或者空载体对照，对野生型c57bl/6和干扰素受体缺陷型(ifnar)雌性小鼠或ace-2缺陷型小鼠接种一次，每个处理组有6只小鼠。所有处理组通过腹膜内注射给予106pfu/小鼠的疫苗，并在疫苗接种后2周和4周时采血。在疫苗接种后6周对所有小鼠进行攻击。中和测定
[0301]
中和抗体的水平经常被用作保护的相关物。因此，在攻击之前，使用在vero细胞上针对sars-cov-2的标准微量中和测定法，计算出所有疫苗组中的中和抗体水平。简而言之，将血清热灭活(在56℃持续30分钟)。将来自每只小鼠的血清在96孔板中进行一式两份的连续稀释，并与100ccid
50
单位的病毒在37℃孵育1小时。在此中和步骤之后，将新分裂的vero细胞(每孔104个细胞)覆盖在血清/病毒混合物上，并孵育5天，直到在显微镜下观察到细胞病变效应。使用结晶紫染色法确定提供100％抗细胞病变效应的血清稀释度。结果
[0302]
在单次施用疫苗后，表达sars-cov-2抗原的两种候选疫苗都诱导针对sars-cov-2病毒的中和抗体。保护小鼠胎仔免受sars-cov-2病毒感染母体的影响，该母体在妊娠前曾接种过重组scv-covid19病毒。
[0303]
本研究的目的是要表明，雌性小鼠在妊娠之前接受过表达sars-cov-2抗原的既往
疫苗接种可以为它们未出生的胎仔提供免于sars-cov-2病毒感染的保护。
[0304]
本研究是通过给雌性ifnar-/-接种scv-covid19a、scv-covid19b或仅用载体接种，然后与雄性ifnar小鼠交配来进行的。然后用sars-cov-2感染妊娠小鼠。实验策略
[0305]
在第0周，以106pfu/小鼠通过肌内途径给予单一载体疫苗scv-covid19a、scv-covid19b或仅用载体，对6-8周龄ifnar-/-疫苗接种一次。在疫苗接种后4周时，对各组小鼠采血，以检查针对疫苗的血清转换。在疫苗接种后6周时，开始定时交配以诱导接种小鼠妊娠。每天检查雌性小鼠是否成功妊娠的证据(阴道栓)。在胚胎日第6.5天时，经由皮下感染用104ccid
50
单位的sars-cov-2感染妊娠小鼠。感染后，在第1至第5天每天对妊娠小鼠采血，以检查病毒血症。在胚胎日第17.5天时，将妊娠小鼠处死，并采集材料以评估感染性sars-cov-2。结果
[0306]
开始变得妊娠前曾接种过scv-covid19a或scv-covid19b的妊娠雌性小鼠能够在sars-cov-2攻击期间阻止sars-cov-2病毒复制，这表现在攻击后未检测到病毒血症。仅接种scv载体的小鼠无法阻止sars-cov-2病毒的病毒复制。
[0307]
在交配和妊娠之前曾接种过单针scv-covid19a或scv-covid19b疫苗的雌性小鼠在攻击后未显示出可检测到的sars-cov-2病毒水平。疫苗接种防止攻击病毒感染胎盘，并通过这种方式阻止sars-cov-2病毒继续传播给易受伤害的胎仔。
[0308]
然而，对于之前仅接种过scv载体的雌性小鼠来说，情况并非如此，其中在妊娠期间的攻击后，一些胎盘可能受到感染，并且可能发生sars-cov-2病毒感染传播给胎仔的情况。结论
[0309]
病毒血症结果显示，与对照疫苗相比，之前曾接种过单针scv-covid19a或scv-covid19b单一载体疫苗的妊娠雌性小鼠被保护免于sars-cov-2攻击。
[0310]
母体在妊娠之前接种疫苗可以防止sars-cov-2病毒感染母体胎盘并阻止向胎仔大脑的继续传播，从而为未出生的胎仔提供保护。
[0311]
母体在妊娠前曾接种疫苗，可以阻断sars-cov-2攻击病毒向胎仔的进一步传播。实施例15单次疫苗接种scv-covd19c产生表位特异性的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)活性
[0312]
cd8细胞毒性t淋巴细胞(ctl)识别i类mhc相关肽，并在抗原依赖性刺激下，通过分泌颗粒酶和穿孔素杀伤病毒感染的细胞。病毒特异性ctl应答在遏制病毒血症方面发挥着关键作用。穿孔素产生细胞膜孔，允许颗粒酶在细胞内递送，导致半胱天冬酶(caspase)的裂解和活化，从而诱导凋亡性死亡。在本实施例中，我们使用放射性同位素
51
铬释放来评估病毒特异性t细胞介导的细胞毒性，从而证明效应t细胞活化。实验策略
[0313]
通过以107pfu/小鼠的剂量肌内施用scv-covid19c或载体对照scv-smx06，对c57bl/6小鼠进行疫苗接种。在疫苗接种后第7天时，收获脾脏并通过标准
51
铬(
51
cr)释放来测定效应细胞对经肽决定簇脉冲的el4靶细胞的直接离体溶细胞性t淋巴细胞活性。溶细胞性t淋巴细胞测定
[0314]
培养el4(h-2b)细胞，并通过肽脉冲和
51
cr标记为测定做准备。洗涤el4细胞，并用代表sars-cov-2免疫显性t细胞表位ynylyrlf(seq id no:9)或vnfnfngl(seq id no:11)的肽脉冲2小时。这两个表位位于sars-cov-2刺突蛋白s1亚基的rbd区域中。每20分钟通过轻轻拍打混合细胞。然后将肽脉冲的el4细胞洗涤两次以去除任何多余的肽，并用20-50μci的
51
cr标记45-60分钟。将细胞洗涤两次以去除多余的
51
cr，并以2
×
104个肽脉冲的、放射性标记的靶细胞/100μl体积重悬。
[0315]
从收获的接种动物的脾脏制备效应细胞。通过将脾细胞穿过70μm细胞过滤器和进行ack裂解，然后在完全培养基中重新悬浮，制备脾细胞单细胞悬液的稀释液。将细胞以2
×
107个细胞/ml重悬，并以3倍连续稀释方式分配到孔内。
[0316]
将靶细胞加入含有效应细胞的孔中，并孵育6小时。对于最大释放对照，将100μl triton x添加到孔中以裂解细胞并将铬完全释放到培养基中。孵育后，将板以1200rpm离心5分钟，并将30μl上清液转移到luma板上，用于测量放射性。让板干燥过夜，并于第二天在microbeta2读板器上评估。使用以下公式确定每种浓度的效应细胞的裂解百分比：
[0317]
特异性裂解百分比＝[样品
51
cr释放(cpm)
–
自发释放(cpm)]/[最大释放(cpm)
–
自发释放(cpm)]x100％。结果
[0318]
结果显示，用肽ynylyrlf(seq id no:9)和vnfnfngl(seq id no:11)脉冲的靶细胞存在特异性裂解(图21a、b)，这表明该疫苗产生了表位特异性的细胞毒性t细胞。结果看起来具有表位特异性，对照小鼠和对照靶细胞(分别为接种smx06的小鼠和未脉冲的靶细胞)未检测到裂解(图21c)。结论
[0319]
单次疫苗接种scv-covid19c产生sars-cov-2表位特异性的溶细胞性t淋巴细胞应答。参考文献altschul等人(1997)nucleic acids res.25:3389-3402ausubel等人(1999)current protocols in molecular biology(supplement 47),john wiley&sons,new yorkboshart等人(1985)cell 41:521brooks等人(1995)j.virol.69(12):7688-7698caddy等人(2020)embo j.40:e106228chen等人(2020)lancet 395(10223):507-513dijkema等人(1985)embo j.4:761drillien r等人(1978)j.virol.28(3):843-850eldi等人(2017)mol.ther.25:2332-2344gorman等人(1982)proc.natl.acad.sci.usa 79:6777ham(1965)proc.natl.acad.sci.usa 53:288-293hammond等人(1997)j.virol.methods 66(1):135-138hsiao等人(2006)j.virol.80(15):7714-7728
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