一种吸入制剂药代动力学评价平台及其方法与流程

1.本发明属于吸入制剂临床前研究领域，具体涉及一种吸入制剂药代动力学评价平台及其方法。


背景技术：

2.随着空气污染及人口老龄化加剧，呼吸系统疾病增多，更多机构已经开始统筹布局吸入制剂和鼻喷雾剂等治疗领域。在我国，呼吸系统疾病是仅次于心血管和糖尿病的第三大慢性疾病，其中哮喘和慢阻肺（copd）患者基数庞大。吸入制剂在呼吸系统疾病防治方面具有其他给药方式不能替代的优势，被公认为治疗哮喘和慢性阻塞性肺病的主要方式。gina《全球哮喘防治创议》、gold《慢性阻塞性肺病全球倡议》等指南文件中，均把吸入疗法列为支气管哮喘及copd的首选疗法。
3.吸入制剂有效性不仅取决于药物肺部沉积量，还与药物能否到达肺部与药物粒径密切相关。粒径和粒径分布的检测在吸入给药毒性试验中非常重要，吸入给药对产生气溶胶的粒径要求非常严格，过大或者过小的粒径都不满足要求，通常需要将粒径大小控制在2到5微米之间，才能很好的被肺部吸收。不同类型的吸入制剂有各自的有优缺点，但在吸入制剂的发展中形成了一个共识，即肺部吸入剂的疗效，取决于药物和装置的共同作用。
4.吸入制剂的安全性有效性受药物空气动力学、粒度、抛射剂、装置等多因素影响，而仿制上市制剂、剂型改变、变更抛射剂均可能影响药物的吸收和药物在肺部的沉积。当前有很多吸入制剂需要进行非临床评价，但由于行业相应研究能力不足，导致药物研发机构要排队等待研究档期，大大延缓了这些药物的研发进度，影响到这些药物可及性的满足需求。吸入制剂的制剂本身比较特殊，药物活性强，直接作用于肺部并伴有全身吸收，故需要评价肺部、系统暴露后的安全性。常规的安全性评价技术并不能完全解决吸入制剂的所有安全性担忧。
5.由于吸入药物的特殊性，口服和静脉药物等可提前配制制剂进行给药，吸入药物在气溶胶发生过程中，气溶胶浓度、粒径和粒径分布会有所波动，所以需要对剂量和粒径进行充分的测定，在动物的给药过程中定期检测气溶胶浓度从而获得给药剂量，在一个给药周期中，定期检测气溶胶浓度频率非常高，目前没有更有效的检测和质量控制方法。
6.吸入制剂粒径和粒径分布的检测在吸入给药试验中非常重要，吸入给药对产生气溶胶的粒径要求非常严格，过大或者过小的粒径都不满足要求，通常需要将粒径大小控制在1到4微米之间，才能很好的被肺部吸收，合理的吸入制剂给药装置及给药方式，对药物动力学代谢影响非常重要。目前，尚未建立不同动物模型及行之有效的的药代动力学评价平台及方法。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术中存在的上述问题，将实验动物模型、雾化制剂给药装置、雾化制剂检测系统、样品采集及检测系统、药代动力学分析系统联合应用，建立了一种吸入制
剂药代动力学评价平台，所述平台能够解决吸入制剂临床前药物代谢研究一致性及有效性存在的问题，为吸入制剂研发提供一种共识明确、行之有效的评价平台。
8.本发明的另一发明目的是提供上述吸入制剂药代动力学评价平台的评价方法，所述方法专业可靠、准确度高。
9.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种吸入制剂药代动力学评价平台，包括实验动物模型、雾化制剂给药装置、雾化制剂检测系统、样品采集及检测系统、和药代动力学分析系统；所述实验动物模型是基于生理学相似或近似原理而建立的以大鼠、犬或猴为基础的实验动物模型；所述雾化制剂给药装置为口鼻暴露吸入给药装置；所述雾化制剂检测系统包含气溶胶浓度检测系统、粒径大小及分布检测分析系统、及环境空气监测系统；所述样品采集及检测系统能够按照预设采集时间对实验动物进行定量抽血，并通过lc-ms/ms分析方法进行血药浓度检测；所述药代动力学分析系统通过非房室模型统计矩法进行药代动力学参数分析。
10.一种上述评价平台的评价方法，包括以下步骤：s1.给药制剂的配制：称取待分析吸入制剂，加生理盐水配制成浓度为0.1-3mg/ml给药制剂组，同体积生理盐水为空白组；s2.实验动物模型的构建：以大鼠构建小动物实验模型，以犬或猴构建大动物实验模型，所述实验动物均为雌雄各半，每天提供12小时日光照射，监测并控制环境温度范围在18-26℃，相对湿度范围在40-70%；s3.吸入制剂给药：按设定速率通过雾化制剂给药装置吸入给药，大动物给药时间为100min，小动物给药时间为4-40min，每组给药浓度为0.8-1.2mg/ml，给药剂量为根据实验动物体重按照100ug/kg给药；s4.吸入制剂检测：气溶胶浓度监测，实时浓度稳定后，进行气溶胶采样，并对气溶胶粒径大小和分布进行检测；s5.样品采集及检测：按照预设采集时间对实验动物进行定量抽血，制备待测血浆样品，并通过lc-ms/ms分析方法进行血药浓度检测；s6.药代动力学分析：血药浓度数据处理后，通过非房室模型统计矩法进行药代动力学参数分析。
11.进一步的，步骤s3的给药速率设置为：小动物气溶胶发生15l/min,稀释0l/min，抽气16l/min，抽气流量由给药装置自动调整；大动物气溶胶发生40l/min,稀释0l/min，抽气42l/min，抽气流量由给药装置自动调整。
12.进一步的，步骤s4的气溶胶采样方法为：采样两次，每次采样时间为10min，且两次采样时间间隔10min以上，采样流量为2l/min。
13.进一步的，步骤s4的气溶胶粒径大小和分布检测方法为：气溶胶发生期间，分别对粒径大小及粒径分布进行1次检测。
14.进一步的，步骤s4包括环境空气监测及控制：实时监测并控制氧浓度范围为19%-22%，温度范围为18-26℃，二氧化碳浓度小于1%，相对湿度范围为30-70%。
15.进一步的，步骤s5大动物样品采集时间为12个采集时间点：给药前、吸入给药开始后30min、60min、100min、130min、3h、4h、6h、8h、10h、12h和24h；小动物样品采集时间为12个采集时间点：给药前、吸入给药开始后0.033h、0.083h、0.167h、0.333h、0.667h、1h、2h、4h、8h、10h和24h。
16.进一步的，步骤s6的血药浓度数据处理方法为：给药前的血药浓度数据按照“0”计算，给药后t
max
之前的低于定量下线（blq）的浓度数据按照“0”计算，t
max
之后的blq浓度数据不参与计算。
17.进一步的，步骤s6通过使用phoenix winnonlin
®ꢀ
7.0软件的非房室模型统计矩法计算药代动力学参数。
18.进一步的，步骤s6的药代动力学参数包含c
max
、t
max
、auc
(0-t)
、auc
(0-∞)
、t
1/2
、cl、vd、mrt
(0-t)
和mrt
(0-∞)
。
19.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的吸入制剂药代动力学评价平台及其方法专业可靠、分析成本低、专属性强、准确度高，适用于吸入制剂类创新药的体内外评价；本发明提供的吸入制剂药代动力学评价平台和方法针对吸入制剂的特殊性，能更有效的检测和控制吸入制剂给药周期中气溶胶的浓度和粒径，从而获得精准的吸入制剂给药剂量，以及可控的吸入制剂气溶胶粒径大小。
附图说明
20.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
21.图1为本发明吸入制剂药代动力学评价平台的示意图；图2为本发明吸入制剂药代动力学评价方法的流程图；图3为sd大鼠不同时间点的平均血药浓度-时间曲线；图4为比格犬不同时间点的平均血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
22.下面结合本发明具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
23.本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。
24.实施例：请参阅图1，本发明的一种吸入制剂药代动力学评价平台，包括实验动物模型、雾化制剂给药装置、雾化制剂检测系统、样品采集及检测系统、和药代动力学分析系统；所述实验动物模型是基于生理学相似或近似原理而建立的以大鼠、犬或猴为基础的实验动物模型；所述雾化制剂给药装置为口鼻暴露吸入给药装置；所述雾化制剂检测系统包含气溶胶浓度检测系统、粒径大小及分布检测分析系统、及环境空气监测系统；
所述样品采集与检测系统能够按照预设采集时间对实验动物进行定量抽血，并通过lc-ms/ms分析方法进行血药浓度检测；所述药代动力学分析系统通过非房室模型统计矩法进行药代动力学参数分析。
25.1.方法，如图2所示。
26.1.1给药制剂的配置给药制剂现配现用，配制方法为：第1组：准确称取110mg吸入制剂置于合适容器中，加生理盐水，定容至110ml，涡旋震荡混匀，得1mg/ml给药制剂组；第2组：生理盐水，定容至110ml，涡旋震荡混匀，得空白组。
27.1.2 实验动物模型的建立（1）小动物实验模型：sd大鼠，周龄为6-10周龄，体重范围为160-300g，雄雌各4-12只，其中1-3只雄性和1-3只雌性实验备用；饲养于大小鼠饲养笼中，每笼1只；每天提供约12小时的日光照射；黑暗时间可以因研究相关活动的需求而间歇性中断；每天监测动物房环境温度和相对湿度，控制在20-26℃和40-70%的范围内；（2）大动物实验模型：比格犬，年龄为6-12月龄，体重范围为5-12kg，雄雌各4-8只，其中1-3只雄性和1-3只雌性实验备用；饲养于不锈钢移动笼，每笼1只；每天提供约12小时的光照；黑暗时间可以因研究相关活动的需求而间歇性中断；每天监测动物房环境温度和相对湿度，控制在18-26℃和40-70%的范围内。
28.需要说明的是，步骤1.2（2）大动物实验模型还可以为：食蟹猴，年龄为36-54月龄，体重范围为2.5-5kg，雄雌各2-8只，其中1只雄性和1只雌性实验备用；饲养于不锈钢移动笼，每笼1只；每天提供约12小时的光照；黑暗时间可以因研究相关活动的需求而间歇性中断；每天监测动物房环境温度和相对湿度，控制在18-26℃和40-70%的范围内。
29.1.3 吸入制剂给药给药途径为吸入给药，使用动物口鼻固定器，将动物固定在吸入塔上，用液体发生装置将给药制剂进行气溶胶发生吸入给药。其中sd大鼠选择小动物口鼻吸入暴露系统，比格犬或食蟹猴选择大动物口鼻暴露系统；（1）口鼻暴露吸入给药装置：空气压缩机压缩空气或氧气，气相从出气口以高速气流通过细口喷嘴；根据venturi效应，在喷嘴周围产生负压，携带贮液罐药液卷进高速气流并将其粉碎成大小不一的雾滴，其中99%以上的为大颗粒的雾滴组成，通过喷嘴的拦截碰撞落回贮液罐内重新雾化剩下的细小雾粒，在空气中形成气溶胶态药液微粒，以高速喷出，粒谱直径从5μm左右，粒径稳定；（2）吸入给药速率设置：大动物气溶胶发生40l/min，稀释0l/min，抽气42l/min，抽气流量由给药装置自动调整；小动物气溶胶发生15l/min，稀释0l/min，抽气16l/min，抽气流量由给药装置自动调整；（3）给药浓度及时间：口鼻暴露吸入给药，大动物给药时间为100min，小动物给药时间为4-40min，每组给药浓度1mg/ml，剂量按100ug/kg，实际给药剂量根据动物体重计算。
30.1.4 吸入制剂检测（1）气溶胶采样：使用多孔玻板进行采样，在多孔玻板中注入 10ml生理盐水，在实时质量浓度监测仪浓度显示稳定后，采样两次，每次采样时间10min，采样时间间隔10min以
上，采样流量2l/min；采样后供分析，分析后的浓度应在平均值的
±
20%以内；（2）粒径检测：气溶胶发生期间进行粒径检测1次，采用新一代药用撞击器copleymodel170和新帕泰克helos及粒径监测分析系统，分别对粒径大小及粒径分布进行检测；（3）环境空气监测与控制；氧浓度控制在19%-22%之间；二氧化碳浓度小于1%；温度控制在18-26℃；相对湿度为30-70%；sd大鼠、比格犬口鼻暴露实验条件及粒径结果分别见下表1和表2。
31.表1 sd大鼠口鼻暴露实验条件及相应粒径参数。
32.表2 比格犬口鼻暴露实验条件及相应粒径参数。
33.1.5 样品采集及检测（1）大动物样品采集时间共12个采集时间点：给药前、吸入给药开始后30min、60min、100min（给药结束）、110min、130min、3h、4h、6h、8h、10h和24h；小动物样品采集时间共12个采集时间点：给药前、吸入给药开始后0.033h、0.083h、0.167h、0.333h、0.667h、1h、2h、4h、8h、10h和24h；（2）样品采集方式与处理：所有实验动物经颈静脉或其他合适静脉穿刺采血，每次约1ml，置于k2edta抗凝管，加入含50ul500mm 柠檬酸水溶液，全血：500mm柠檬酸水溶液体积比为20:1，配制后2-8℃保存，采血后至离心前始终置于冰上。将采集好的全血样品置于标记好的离心管中，置于冰上转移至样品离心室，并在1小时之内离心分离血浆，离心条件为2200g，10分钟，2-8℃，血浆样本在分析前暂时存放于超低温冰箱内；（3）lc-ms/ms分析，测定各组样品中吸入制剂药物浓度，实验条件为：
①ꢀ
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，规格为25cm
×
4.6mm，5μm；
②ꢀ
流动相：ph2.5的0.2%三乙胺和乙腈体积比为80:20，流速：0.8ml/min，检测波长：237nm；
③ꢀ
稀释溶剂：0.05%磷酸溶液和乙腈体积比为90:10；
④ꢀ
对照品溶液的制备：称取噻格溴铵5-20.00mg，用稀释溶剂溶解并定容至100ml，摇匀；
⑤ꢀ
标准曲线系列溶液：精密量取对照品溶液适量，用稀释溶剂稀释制成每1ml含250ng、100ng、50ng、25ng、10ng、5ng的一系列溶液，精密量取各线性溶液20
µ
l，分别注入液
相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归；
⑥ꢀ
样品测定：取50μl样品，立即加入200μl内标工作液，空白补加相同体积的乙腈，涡旋混匀，18000g离心7分钟，取180μl上清液到相应的96孔进样板中，再加入40μl超纯水，混匀，lc-ms/ms进样分析。
34.分析样品的同时采用质控样品评价分析批的日内准确度。质量控制标准：每个质控浓度水平至50%质控样品并且所有质控浓度水平至少2/3的质控样品的准确度应在85.00-115.00%之间。
35.1.6 药代动力学分析（1）血药浓度数据处理进行药代参数计算时，给药前的血药浓度数据按照“0”计算，给药后t
max
之前的低于定量下线（blq）的浓度数据按照“0”计算，t
max
之后的blq浓度数据一律不参与计算；（2）采用phoenix winnonlin
®ꢀ
7.0软件的非房室模型统计矩法计算以下主要药代动力学参数：c
max
、t
max
、auc
(0-t)
、auc
(0-∞)
、t
1/2
、cl、vd、mrt
(0-t)
和mrt
(0-∞)
。
36.2. 结果应用建立的lc-ms/ms分析方法测定sd大鼠在给药剂量分别为11.39mg/kg、11.19mg/kg、11.01mg/kg下，在各时间点的血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见图3。
37.应用建立的lc-ms/ms分析方法测定比格犬不同供试品给药下，在各时间点的血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见图4。
38.采用phoenix winnonlin
®ꢀ
7.0软件的非房室模型统计矩法，计算药代动力学参数，相关药代动力学参数见表3和表4。
39.表3 sd大鼠主要药代动力学参数汇总。
40.表4 比格犬主要药代动力学参数汇总
。