一种降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法与流程

1.本发明属于生物技术和发酵工程领域，具体涉及一种降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，特别是涉及利用山梨醇/甲醇混合流加技术，降低发酵过程中的产热量。


背景技术：

2.毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，毕赤酵母菌作为一种单细胞真核生物，既具有原核生物结构简单遗传背景清楚的特点，又具有真核生物严格的基因调控机制和对表达产物的翻译后修饰的能力，自身不含有内毒素、热源、病原体，是一种非常安全的表达宿主，已经成为最有效的表达外源蛋白的表达系统之一。据文献资料统计已有数千种外源蛋白已经实现了在毕赤酵母体系中成功表达，其中有很多已经实现了大规模工业化生产。近些年，毕赤酵母被美国fda认定为gras(generally recognized as safe)，为其在食品及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(alcohol oxidase，aox)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。
3.毕赤酵母是一种优秀的真核表达系统，在表达外源蛋白时具有诸多优点：作为单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；毕赤酵母的醇氧化酶1(aox1)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，始于外源基因的高水平诱导表达；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，且自身分泌到培养基中的蛋白很少，纯化方便；外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起整合到酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象。以上种种优势，均使得毕赤酵母成为重组蛋白药物表达系统的首选，mw05即是在此背景下建立了一整套的生产工艺。将mw05编码基因插入到ppic9k表达质粒并转化巴斯德毕赤酵母gs115，通过同源重组整合入酵母基因组中形成稳定表达的菌株，并建立高密度培养表达工艺。高密度发酵表达外源蛋白一般可分为三个阶段：甘油分批培养、甘油流加培养和甲醇诱导表达。
4.甘油分批培养和甘油流加培养都是为了积累足够的生物量，尽可能地实现高密度发酵。甘油分批培养同时抑制了aox(alcohol oxidase gene，醇氧化酶基因)启动子及外源蛋白表达；甘油流加培养是通过限制性的甘油流加，进一步增加生物量，同时解除过量甘油对aox启动子的抑制作用，为细胞进入诱导期作准备。甘油分批培养阶段若甘油浓度过高，则会反馈抑制细胞生长。一旦甘油耗尽，溶氧浓度(do)会在短时间内迅速上升，此时需流加甘油补充碳源，合理的补加策略可实现细胞的高密度培养，还可避免培养过程中甘油过量。在这两个阶段控制培养条件比如温度、ph、溶氧等在酵母最适生长条件，并且保证适当的营养即可实现培养工艺的优化。
5.甲醇诱导表达阶段是通过添加诱导剂甲醇，实现aox高水平转录和外源蛋白的高效表达。甲醇流加诱导阶段的控制较为复杂，甲醇既是碳源又是诱导剂，甲醇的流加速率直
接影响菌体生长和蛋白表达量，是优化发酵工艺的关键点。甲醇流加速率过低将抑制菌体生长和减少蛋白表达，流加速度过高又将导致甲醇积累，致使菌体死亡。尤其在甲醇流加的初期，由于细胞没有aox酶的积累，甲醇的代谢速度很慢(甘油的存在会抑制paox1的启动，因此在甘油流加培养阶段没有aox酶产生)，此时如果添加甲醇速度过快将导致甲醇积累，高浓度的甲醇将毒害菌体、导致细胞裂解，进而分泌胞内蛋白酶，导致胞外目标蛋白的水解。甲醇诱导阶段的另一个关键是减少表达蛋白在发酵过程中的降解。导致蛋白被降解的原因较多，比如高密度发酵细胞裂解导致的胞内蛋白酶释放，酵母在受到饥饿、碳源更换、ph的改变等因素胁迫时产生的蛋白酶解响应，另外氧化胁迫也是导致目的蛋白降解的原因之一(j.sinha,b.a.plantz,et al,2005)。由于蛋白的表达和降解往往是多种因素共同影响的结果，因此诱导表达阶段的各个条件都要进行优化，包括优化ph值、降低诱导表达的温度、添加抗氧化剂、添加竞争性抑制底物等。


技术实现要素：

6.为解决毕赤酵母重组发酵规模化生产外源蛋白过程中产热量大、制冷设备要求高的技术问题，本公开提供一种产热量小的毕赤酵母发酵工艺，其特征在于发酵罐培养包括甘油培养阶段和诱导阶段，其中所述诱导阶段以甲醇和山梨醇混合碳源进行流加补料，通过山梨醇代替甲醇的碳源功能降低毕赤酵母发酵的产热量，解决毕赤酵母发酵表达外源蛋白过程中能耗过高的问题。
7.具体而言：
8.一方面，本发明提供一种降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，其特征在于发酵罐培养包括甘油培养阶段和诱导表达阶段，其中所述诱导表达阶段以甲醇和山梨醇混合碳源进行流加补料；
9.其中在甲醇诱导开始16h后，以0.6-1.2ml/h/l初始发酵体积的速率流加山梨醇。
10.进一步，本发明所述降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，其特征在于所述甘油培养阶段的操作如下：控制温度30
±
1℃、ph5.0
±
0.2，根据实际情况调节搅拌转速和空气流量，必要时通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过约10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，按11.1ml/h/l-19.4ml/h/l初始发酵体积补入甘油补料，od达225-275，停止流加，进入诱导阶段。
11.进一步，本发明所述降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，其特征在于所述诱导表达阶段按以下方案流加甲醇：
12.诱导0-5h，2.96-3.71ml/h/l初始发酵体积，
13.诱导5-10h，4.78-5.71ml/h/l初始发酵体积，
14.诱导10-16h，6.22-7.76ml/h/l初始发酵体积，
15.诱导16-36h，7.81-9.3ml/h/l初始发酵体积，
16.诱导36h-放罐，9.71-12.3ml/h/l初始发酵体积。
17.进一步，本发明所述降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，其特征在于所述诱导表达阶段还包括甲醇适应后一次性补加ptm1微量元素，同时以4.11-4.37ml/h/l初始发酵体积恒速流加yp补料氮源；诱导48h再次一次性补加ptm1微量元素。
18.进一步，本发明所述降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的方法，其特征在于所述诱
导表达阶段控制温度为25
±
1℃、ph值为5.3-6.0、溶氧≥10％。
19.另一方面，本发明提供一种山梨醇甲醇混补工艺在降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的用途，其特征在于所述山梨醇甲醇混补工艺包括分段梯度提高甲醇流加速度，并且在甲醇诱导开始16h后，以0.6-1.2ml/h/l初始发酵体积的速率流加山梨醇。
20.进一步，本发明所述山梨醇甲醇混补工艺在降低毕赤酵母发酵工艺中产热量的用途，其特征在于按以下方案分段梯度提高甲醇流加速度：
21.诱导0-5h，2.96-3.71ml/h/l初始发酵体积，
22.诱导5-10h，4.78-5.71ml/h/l初始发酵体积，
23.诱导10-16h，6.22-7.76ml/h/l初始发酵体积，
24.诱导16-36h，7.81-9.3ml/h/l初始发酵体积，
25.诱导36h-放罐，9.71-12.3ml/h/l初始发酵体积。
26.为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
27.术语“毕赤酵母”，即巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
28.巴斯德毕赤酵母的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，aox增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在aox基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。
29.术语“aox”，即甲醇脱氢酶也叫甲醇氧化酶，是甲醇代谢途径必需的一种酶，它催化甲醇氧化成甲酸,进而氧化释放出二氧化碳。毕赤酵母中aox1基因启动子因受到甲醇的诱导而启动甲醇脱氢酶基因的表达。sibia(salk institute biotechnology/industrial associates).的研究人员分离了aox基因的启动子和宿主菌株，构建了载体，并开发出了相应的毕赤酵母基因操作技术。醇氧化酶aox1基因启动子是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。毕赤酵母aox1基因启动子表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化。
30.术语“补料”在发酵培养过程中连续或间断性地添加的营养物质，主要包括连续补料和分批补料。
31.术语“连续补料”是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。
32.术语“分批补料”是以某种方式向发酵罐中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，分批补料使发酵液的体积随时间逐渐增加，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
33.术语“诱导物”，能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物。无论在正调控系统还是在负调控系统中，操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此也称这种因子为效应
物，凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物，凡能导致操纵子关闭，阻遏转录过程的效应物称为辅助诱导物。
34.术语“诱导表达”，有些基因表达极易受环境变化影响，在特定环境信号刺激下，有些基因的表达方面为开放或增强，这种表达方式称为诱导表达。
35.术语“诱导型启动子”(inducible promoter)，是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。
36.本发明取得了以下有益的技术效果：
37.通过甘油培养和甘油流加补料，结合毕赤酵母最佳培养条件的优化，实现了重组毕赤酵母的高密度发酵，积累了较高的生物量。
38.在诱导表达阶段，通过耗竭甘油解除了对aox启动子的抑制，通过梯度流加甲醇实现了对aox启动子的诱导表达，通过流加山梨醇补料作为重组毕赤酵母的碳源避免了以甲醇为碳源产生的高热量，同时避免了甲醇对菌体的毒性以及重组目标蛋白的降解。
具体实施方式
39.下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然实施例中给出了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
40.实施例1：低产热量的毕赤酵母发酵工艺
41.1、发酵罐接种：移种前启动批次记录，将移种管灭菌，进入移种程序完成移种，进入培养阶段。
42.2、甘油培养：移种完成后进入甘油培养阶段，控制温度30
±
1℃、ph5.0
±
0.2，根据实际情况调节搅拌转速和空气流量，必要时通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过约10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，按11.1ml/h/l-19.4ml/h/l初始发酵体积补入甘油补料，od达225-275，停止流加，进入诱导阶段。
43.3、甲醇培养：甘油流加阶段结束后，等溶氧和ph均明显上升后，将温度控制为25
±
1℃，ph值控制为5.3-6.0。连接补料管和甲醇，开始以甲醇进行诱导，大致按照表1进行，各提速诱导时间点可根据甲醇代谢情况提前或者延后，最大不超过两小时。
44.表1流加甲醇速度梯度
45.诱导时间(h)0-55-1010-1616-3636-放罐速率(ml/h/l)2.96-3.714.78-5.716.22-7.767.81-9.39.71-12.3
46.甲醇适应后(约5h)以4.11-4.37ml/h/l初始发酵体积恒速流加yp补料，山梨醇补料自诱导16h后以0.834-1.04ml/h/l初始发酵体积恒速流加。整个诱导阶段密切注意溶氧，当溶氧降低接近10％时，通过提高转速、通气量和调节纯氧比例，使其高于10％。诱导过程中每4h取样，测定od以及镜检，诱导24h后每4h至少留取1ml上清于-20℃冰箱保存备检。甲醇适应后(约5h)温度控制为18-25℃继续诱导，一次性补加ptm1 3080g，诱导48h再次补加ptm13080g，诱导60-72h放罐，进入离心收集工序。
47.实施例2：300l发酵罐毕赤酵母发酵工艺对比
48.1、300l发酵罐规模下，山梨醇甲醇混合流加工艺每批生产消耗甲醇约60kg，发热
量计算如下：
49.δhs(甲醇)＝22.68kj/g，即消耗60kg甲醇可以放出1.36
×
106kj的热量，按发酵诱导70h来算，平均每小时放热1.94
×
104kj。按冷却机组的设定温度为10℃(实际要更低)，若设定诱导温度为25℃则每小时需要冷却水的流量约为310l。若按诱导温度为20℃来算的话则每小时需要冷却水的流量约为463l。
50.2、在相同的300l发酵罐规模下，采用传统的甲醇流加工艺每批生产消耗甲醇约130kg，发热量计算如下：
51.δhs(甲醇)＝22.68kj/g，即消耗130kg甲醇可以放出2.95
×
106kj的热量，按发酵诱导70h来算，平均每小时放热4.21
×
104kj。按冷却机组的设定温度为10℃(实际要更低)，若设定诱导温度为25℃则每小时需要冷却水的流量为670l。若按诱导温度为20℃来算的话则每小时需要冷却水的流量为1005l。
52.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。