补骨脂有效成分治疗雄激素依赖性疾病的用途

1.本发明涉及药物技术领域，涉及黄酮类化合物和/或香豆素类化合物在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。


背景技术：

2.目前，在正常人体内，适量的雄激素在男性生殖系统的发育过程中具有关键的作用，当适量的雄激素t(睾酮)与雄激素受体(androgen receptor，ar)结合时，会促进前列腺基质细胞和上皮细胞的分化与增殖。而在前列腺基质细胞中的5α-还原酶会将t转化为dht(二氢睾酮)，dht活性比t强，能够竞争性地代替t与雄激素受体结合，进而促使前列腺基质细胞的快速增殖。当dht的含量过多时，细胞增殖与凋亡的失衡，将会引发疾病。dht过多会引起雄激素紊乱，与之相关的疾病有：痤疮，雄激素性脱发，前列腺增生(bph)和前列腺癌等。
3.5α-还原酶是一种参与激素代谢的酶，主要有两种表型，1型和2型(steroid 5α-reductase type 1，srd5a1；steroid 5α-reductase type 2，srd5a2)。分布在皮肤、毛发、前列腺、附睾等。目前临床上使用的5α-还原酶抑制剂有非那雄胺、度他雄胺。而这两类药物据报道在实际应用中都有显著的副作用。临床研究发现gleason评分比较高(7-10分)的患者，非那雄胺和度他雄胺的长期使用会增加其肿瘤生成的风险，gleason评分是临床上用来反映前列腺癌gleason结构类型与生物学行为之间关联的系统。(评分指标为：低危＜7；中危＝7；高危＞7)。另外在目前用于治疗bph的保列治(成分为5mg非那雄胺制剂)和用于治疗脱发的保法止(成分为1mg非那雄胺制剂)的治疗记录中，均发现有增加患者抑郁的风险，除此之外，相关的副作用还包括可能导致患者性欲减弱、勃起障碍症、心血管疾病，以及增加膀胱癌和男性乳腺癌的发病风险等。因此，寻找一种有效且安全的5α-还原酶抑制剂具有极大的临床意义。
4.补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，性苦、辛、温，归肾、脾经。在传统疗法中，补骨脂具有纳气平喘、温脾止泻的作用，外用可以消风祛斑，治疗牛皮癣等皮肤病。
5.现有技术中的用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物主要有以下几方面的缺陷：
6.缺陷一：副作用明显。非那雄胺有增加患者抑郁的风险，可导致患者性欲减弱、勃起障碍症、心血管疾病，以及增加膀胱癌和男性乳腺癌的发病风险，易产生乳房触痛或肿大、过敏反应(包括皮疹、瘙痒、荨麻疹和口唇肿胀)和睾丸疼痛；度他雄胺易导致男子女性型乳腺发育(包括乳房增大、乳房触痛)、阳痿、射精障碍及性欲降低。
7.缺陷二：工艺复杂且成本较高。
8.基于以上原因，需要对用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物进一步研究，以解决常见的药物例如非那雄胺、度他雄胺副作用明显、工艺复杂且成本较高的问题。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的在于提供了一种新型的治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物，以解决现有技术中的常见的药物例如非那雄胺、度他雄胺副作用明显、工艺复杂且成本较高的问题。
10.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了黄酮类化合物和/或香豆素类化合物在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
11.根据本发明的另一方面，提供了一种包含黄酮类化合物和/或香豆素类化合物和适量的辅料的制剂在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
12.进一步地，该黄酮类化合物包含以下中的一种或多种：查尔酮类黄酮、二氢黄酮类黄酮和异黄酮类黄酮。
13.进一步地，该查尔酮类黄酮包含以下式i的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0014][0015]
其中，r1、r2和r3相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0016]
进一步地，该二氢黄酮类黄酮包含以下式ii的化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0017][0018]
其中，r4、r5和r6相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧
基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0019]
进一步地，该异黄酮类黄酮包含以下式iii的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0020][0021]
其中，r7、r8和r9相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0022]
进一步地，该香豆素类化合物包含以下式iv的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0023][0024]
其中，r
10
为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0025]
进一步地，该黄酮类化合物和/或香豆素类化合物源自于补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位。
[0026]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材醇提取物。
[0027]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材60％～90％醇提取物。
[0028]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材70％～80％醇提取物。
[0029]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材75％醇提取物。
[0030]
进一步地，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位、补骨脂药材75％醇提取物石油醚部位或补骨脂药材75％醇提取物正丁醇部位。
[0031]
进一步地，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位。
[0032]
进一步地，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、氟、氯、溴、碘、c1至c
10
烷基基团、c1至c
10
烷氧基基团、c2至c
10
链烯基基团、c2至c
10
炔基基团、c1至c
10
氟代烷基基团、c1至c
10
氟代烷氧基基团、c2至c
10
氟代链烯基基团、c2至c
10
氟代炔基基团、c1至c
10
氯代烷基基团、c1至c
10
氯代烷氧基基团、c2至c
10
氯代链烯基基团、c2至c
10
氯代炔基基团、c1至c
10
溴代烷基基团、c1至c
10
溴代烷氧基基团、c2至c
10
溴代链烯基基团、c2至c
10
溴代炔基基团、c1至c
10
碘代烷基基团、c1至c
10
碘代烷氧基基团、c2至c
10
碘代链烯基基团或c2至c
10
碘代炔基基团。
[0033]
进一步地，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、c1至c6烷基基团、c1至c6烷氧基基团或c2至c
10
异链烯基基团。
[0034]
进一步地，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、甲基、甲氧基或c2至c
10
异链烯基基团。
[0035]
进一步地，c2至c
10
异链烯基基团为异戊烯基或香叶草基。
[0036]
进一步地，式i的化合物为补骨脂查尔酮。
[0037]
进一步地，式ii的化合物为补骨脂二氢黄酮甲醚或补骨脂二氢黄酮。
[0038]
进一步地，式iii的化合物为3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮。
[0039]
进一步地，式iv的化合物为补骨脂定。
[0040]
根据本发明的另一方面，提供了补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0041]
根据本发明的另一方面，提供了一种包含补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位和适量的辅料的制剂在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0042]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂醇提取物。
[0043]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材60％～90％醇提取物。
[0044]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材70％～80％醇提取物。
[0045]
进一步地，该补骨脂提取物为补骨脂药材75％醇提取物。
[0046]
进一步地，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位、补骨脂药材75％醇提取物石油醚部位或补骨脂药材75％醇提取物正丁醇部位。
[0047]
进一步地，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位。
[0048]
进一步地，该辅料选自以下的一种或多种：填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂或者注射用辅料。
[0049]
进一步地，该辅料占该制剂重量的0～99.5％。
[0050]
进一步地，该辅料占该制剂重量的75～95％。
[0051]
进一步地，该制剂为口服制剂、注射制剂或栓剂。
[0052]
进一步地，该口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
[0053]
进一步地，该注射制剂为小容量注射剂、大容量注射剂或粉针剂。
[0054]
进一步地，该粉针剂为冻干粉针剂。
[0055]
进一步地，该填充剂选自以下的一种或多种：玉米淀粉、糊精、微晶纤维素、改良淀粉、预胶化淀粉、甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、d-山梨醇、赤藻糖醇、木糖醇或果糖。
[0056]
进一步地，该崩解剂选自以下的一种或多种：低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基淀粉钠、淀粉羟基乙酸钠或交联羧甲纤维素钠。
[0057]
进一步地，该粘合剂选自以下的一种或多种：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。
[0058]
进一步地，该润滑剂选自以下的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸锌、液状石蜡、聚乙二醇、二氧化硅、胶体二氧化硅、微粉硅胶、滑石粉或氢化植物油。
[0059]
进一步地，该矫味剂选自以下的一种或多种：香橙香精、草莓香精、香草香精、柠檬香精、薄荷香精、樱桃香精、薄荷脑、阿司帕坦、三氯蔗糖、甜菊苷、甘草、半乳蔗糖、蔗糖和糖精钠。
[0060]
进一步地，该注射用辅料选自以下的一种或多种：亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸盐酸盐、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、右旋糖酐、葡萄糖或甘油。
[0061]
进一步地，该雄激素依赖性疾病或病症为人或哺乳动物的雄激素依赖性疾病或病症。
[0062]
进一步地，该雄激素依赖性疾病或病症为与5α-还原酶相关的雄激素依赖性疾病或病症。
[0063]
进一步地，该雄激素依赖性疾病或病症为前列腺癌、前列腺痛、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、下泌尿道综合征、前列腺炎、痤疮、皮脂溢、雄激素性脱发、多毛症、性早熟、肾上腺过度增生或多囊卵巢综合征。
[0064]
应用本发明的技术方案，本发明的黄酮类化合物和/或香豆素类化合物在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。该黄酮类化合物和/或该香豆素类化合物对于5-α还原酶具有较强的抑制作用，可用于雄激素依赖性疾病或病症的治疗从而能够很好地解决常见的药物例如非那雄胺、度他雄胺副作用明显、工艺复杂且成本较高的问题。
附图说明
[0065]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本技术要求保护的范围。
[0066]
图1是补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液的液相色谱图。其中，峰1为补骨脂素(psoralen)，峰2为异补骨脂素(isopsoralen)，峰3为补骨脂二氢黄酮(bavachin)，峰4为新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)，峰5为补骨脂宁(corylin)，峰6为异补骨脂查耳酮(isobavachalcone)，峰7为补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin)，峰8为补骨脂定(psoralidin)，峰9为3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮(corylifol a)，峰10为补骨脂查耳酮(bavachalcone)，峰11为补骨脂酚(bakuchiol)。
[0067]
图2是补骨脂查尔酮毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0068]
图3是补骨脂宁毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0069]
图4是补骨脂二氢黄酮甲醚毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0070]
图5是补骨脂二氢黄酮毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0071]
图6是补骨脂定毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0072]
图7是补骨脂素毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0073]
图8是异补骨脂素毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0074]
图9是3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮毒性评价图。评价指标为细胞增殖率(％)。
[0075]
图10是补骨脂供试品溶液5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。
[0076]
图11是补骨脂石油醚部位供试品溶液5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。
[0077]
图12是补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。
[0078]
图13是补骨脂正丁醇部位供试品溶液5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。
[0079]
图14是补骨脂水部位供试品溶液5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。
[0080]
图15是待测化合物5α-还原酶的活性检测结果示意图。评价指标为抑制率(％)。其中化合物1：补骨脂查尔酮，2：补骨脂宁，3：补骨脂二氢黄酮甲醚，4：补骨脂二氢黄酮，5：补骨脂定，6：补骨脂素，7：异补骨脂素；8：3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮。
具体实施方式
[0081]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0082]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0083]
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
[0084]
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
[0085]
本发明将应用以下定义除非其他方面表明。根据本发明的目的，化学元素根据元素周期表，cas版本和化学物理手册，75
th ed.，1994来定义。另外，有机化学一般原理见“organic chemistry”，thomas sorrell，university science books，sausalito：1999，和“march’s advanced organic chemistry”，michael b.smith和jerry march，john wiley&
sons，new york：2007，因此所有的内容都融合了参考文献。
[0086]
正如背景技术部分所描述的，现有的用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的常见药物例如非那雄胺、度他雄胺副作用明显、工艺复杂且成本较高的问题。为了解决上述问题，本发明提供了黄酮类化合物和/或香豆素类化合物在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0087]
在本发明中，术语“治疗”也包括“预防”，除非存在与此相反的具体说明。术语“治疗(的)”和“治疗(地)”应该作相应的理解。
[0088]
本文中使用的术语“治疗”是指治疗哺乳动物(优选人)的病症或疾病，并且包括：(1)预防病症或疾病在易感染但还未诊断患有该疾病的受试者中出现，(2)抑制所述病症或疾病，即阻止其发展，(3)减轻所述病症或疾病，即引起病症的消退，或(4)减轻由疾病引起的病症，即终止疾病的症状。
[0089]
如本文中使用的，术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。
[0090]
本发明还提供一种治疗雄激素依赖性疾病或病症的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的黄酮类化合物和/或香豆素类化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药。
[0091]
本发明所使用的短语“治疗有效量”是指足以显著地和积极地改变待治疗症状和/或病况(例如，提供积极的临床反应)的化合物或组合物的量。用于药物组合物的活性成分的有效量随待治疗的具体病况、病况的严重程度、治疗的持续时间、并行治疗的性质、所用的具体活性成分、所用的具体的药学可接受的赋形剂/载体、和主治医师的知识和专业技能内的类似因素而变化。因此，提前指定确切的有效量是没有用的。
[0092]
可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。
[0093]
所给药的本发明的化合物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。
[0094]
本发明所使用的术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：s.m.berge et al.，j.pharmaceutical sciences，66：1-19，1977所记载的。
[0095]
药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬
氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和n

(c
1-4
烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含n的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，c
1-8
磺酸化物和芳香磺酸化物。
[0096]
本发明所使用的术语“酯”是指本发明的化合物在体内(in vivo)水解的酯并且包括容易在人体内分解留下母体化合物或其盐的酯。合适的酯基包括例如衍生自药学上可接受的脂肪族羧酸(尤其链烷酸、链烯酸、环链烷酸和链烷二酸)的酯基，其中各烷基或烯基部分宜具有6个以下碳原子。特定酯的代表性实例包括(但不限于)甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
[0097]
本发明所使用的术语“异构体”包括所有的同分异构形式(例如对映异构，非对映异构，和几何异构(或构象异构))：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体，和(z)、(e)的构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体，非对映异构体，或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。
[0098]
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：s.p.parker，ed.，mcgraw-hill dictionary ofchemical terms(1984)mcgraw-hill book company，new york；and eliel，e.and wilen，s.,“stereochemistry of organic compounds”，johnwiley&sons，inc.，new york，1994。本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀d、l或r、s用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或( )、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀( )或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50∶50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
[0099]
本发明所使用的术语“氘代物”指本发明化合物中的1个或多个氢原子被氘替换后所得的化合物。
[0100]
本发明所使用的术语“14
c标记物”指在本发明化合物中，放射性核素碳-14(即
14
c)取代化合物中它的稳定同位素碳-12(即
12
c)，并以碳-14(即
14
c)作为标记的放射性标记化合物。
[0101]
某些同位素标记的本发明的化合物(如用3h和
14
c标记的那些)用于化合物中和/或底物组织分布试验中。氚(即3h)和碳-14(即
14
c)同位素因其易于制备和检测而特别优选。而且，含较重的同位素的取代基如氘(即2h)可具有某些治疗优势，这是因为其更好的代谢稳定性(如增加的体内半衰期或减小的剂量需求)并因此可在某些情况下优选使用。同位素标记的本发明的化合物可通常通过本领域公知的那些方法来制备，通过用合适的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂。
[0102]
本发明所使用的术语“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
[0103]
本发明的一种或多种化合物也作为溶剂化物存在，或选择性地转化为溶剂化物。溶剂化物的制备一般公知。因此，例如m.caira等人j.pharmaceutical sci.，93(3)，601-611(2004)描述了在乙酸乙酯和水中的抗真菌的氟康唑的溶剂化物制备。溶剂化物、半溶剂化物、水合物等的类似的制备在e.c.van tonder等人aaps pharmscitech.，5(1)，article 12(2004)；和a.l.bingham等人chem.commun.，603-604(2001)中有描述。一般的非限制性的方法包括：在高于室温的温度下，溶解需要的溶剂(有机或水或其混合物)的需要的量的本发明的化合物，接着以足以形成结晶的速率冷却溶液，再用标准的方法分离。分析技术(如i.r.光谱)表明作为溶剂化物(或水合物)的晶体中的溶剂(或水)的存在。
[0104]
本发明所使用的术语“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。
[0105]
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为本发明的黄酮类化合物和/或香豆素类化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(c
1-24
)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：t.higuchi and v.stella，pro-drugs as novel delivery systems，vol.14of the a.c.s.symposium series，edward b.roche，ed.，bioreversible carriers in drug design，american pharmaceutical association and pergamon press，1987，j.rautio et al，prodrugs：design and clinical applications，nature review drug discovery，2008，7，255-270，and s.j.hecker et al，prodrugs of phosphates and phosphonates，journal ofmedicinal chemistry，2008，51，2328-2345。
[0106]
根据本发明的另一方面，提供了一种包含黄酮类化合物和/或香豆素类化合物和适量的辅料的制剂在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0107]
在一种优选的实施方式中，该制剂包括适合于经口、直肠、阴道内、鼻内、局部和非
肠道(包括皮下、肌肉内和静脉内)给药的那些。
[0108]
在一种优选的实施方式中，该制剂为适合于经口给药的那些。
[0109]
在一种优选的实施方式中，该制剂可作为单位剂型存在或者可通过药学领域中已知的任何方法制备。所有的方法都包括使活性化合物与构成一种或多种成分的辅料结合的步骤。通常，制剂通过将活性化合物与液体辅料、蜡质固体辅料或细碎固体辅料均匀地和紧密地结合而制备，然后，如果需要，将产物成形为所需的剂型。
[0110]
在一种优选的实施方式中，该黄酮类化合物包含以下中的一种或多种：查尔酮类黄酮、二氢黄酮类黄酮和异黄酮类黄酮。
[0111]
在一种优选的实施方式中，该查尔酮类黄酮包含以下式i的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0112][0113]
其中，r1、r2和r3相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0114]
在一种优选的实施方式中，该二氢黄酮类黄酮包含以下式ii的化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0115][0116]
其中，r4、r5和r6相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧
基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0117]
在一种优选的实施方式中，该异黄酮类黄酮包含以下式iii的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0118][0119]
其中，r7、r8和r9相同或不同且为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0120]
在一种优选的实施方式中，该香豆素类化合物包含以下式iv的化合物或其药学上可接受的盐、酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药中的一种或多种：
[0121][0122]
其中，r
10
为氢、卤素、羟基、c
1-12
烷基、c
1-12
卤代烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
链烷酰基、三氟甲基、氰基、氨基、c
2-12
链烯基、c
2-12
卤代链烯基、c
2-12
炔基、c
2-12
卤代炔基、羧基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-3
烷基，或选自苯基、苄基、苯基c
2-4
烷基和5-6元杂环基的任选被取代的基团。
[0123]
在一种优选的实施方式中，该黄酮类化合物和/或香豆素类化合物源自于补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位。
[0124]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材醇提取物。
[0125]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材60％～90％醇提取物。
[0126]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材70％～80％醇提取物。
[0127]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材75％醇提取物。
[0128]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位、补骨脂药材75％醇提取物石油醚部位或补骨脂药材75％醇提取物正丁醇部位。
[0129]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位。
[0130]
相比于其它部位例如补骨脂药材75％醇提取物水部位、正丁醇部位和石油醚部位，补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位对于hacat细胞中的5α-还原酶显示出更强的抑制作用。
[0131]
在一种优选的实施方式中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、氟、氯、溴、碘、c1至c
10
烷基基团、c1至c
10
烷氧基基团、c2至c
10
链烯基基团、c2至c
10
炔基基团、c1至c
10
氟代烷基基团、c1至c
10
氟代烷氧基基团、c2至c
10
氟代链烯基基团、c2至c
10
氟代炔基基团、c1至c
10
氯代烷基基团、c1至c
10
氯代烷氧基基团、c2至c
10
氯代链烯基基团、c2至c
10
氯代炔基基团、c1至c
10
溴代烷基基团、c1至c
10
溴代烷氧基基团、c2至c
10
溴代链烯基基团、c2至c
10
溴代炔基基团、c1至c
10
碘代烷基基团、c1至c
10
碘代烷氧基基团、c2至c
10
碘代链烯基基团或c2至c
10
碘代炔基基团。
[0132]
在一种优选的实施方式中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、c1至c6烷基基团、c1至c6烷氧基基团或c2至c
10
异链烯基基团。
[0133]
在一种优选的实施方式中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
相同或不同且为氢、羟基、甲基、甲氧基或c2至c
10
异链烯基基团。
[0134]
在一种优选的实施方式中，c2至c
10
异链烯基基团为异戊烯基或香叶草基。
[0135]
在一种优选的实施方式中，式i的化合物为补骨脂查尔酮。
[0136]
在一种优选的实施方式中，式ii的化合物为补骨脂二氢黄酮甲醚或补骨脂二氢黄酮。
[0137]
在一种优选的实施方式中，式iii的化合物为3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮。
[0138]
在一种优选的实施方式中，式iv的化合物为补骨脂定。
[0139]
相比于其它黄酮类化合物或香豆素类化合物，补骨脂查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂二氢黄酮、补骨脂定和3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮对于hacat细胞中的5α-还原酶显示出更强的抑制作用，并展现出一定的剂量依赖性。
[0140]
根据本发明的另一方面，提供了补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0141]
根据本发明的另一方面，提供了一种包含补骨脂药材或补骨脂提取物或补骨脂有效部位和适量的辅料的制剂在制备用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的药物中的用途。
[0142]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂醇提取物。
[0143]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材60％～90％醇提取物。
[0144]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材70％～80％醇提取物。
[0145]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂提取物为补骨脂药材75％醇提取物。
[0146]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位、补骨脂药材75％醇提取物石油醚部位或补骨脂药材75％醇提取物正丁醇部位。
[0147]
在一种优选的实施方式中，该补骨脂有效部位为补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位。
[0148]
在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂或者注射用辅料。
[0149]
在一种优选的实施方式中，该辅料占该制剂重量的0～99.5％。
[0150]
在一种优选的实施方式中，该辅料占该制剂重量的75～95％。
[0151]
在一种优选的实施方式中，该制剂为口服制剂、注射制剂或栓剂。
[0152]
在一种优选的实施方式中，该口服制剂可作为离散的单元形式存在，其各自包含预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒形式存在；或作为在含水液体或非水液体中的悬浮液或溶液形式存在。可通过，任选与一种或多种辅助成分一起，压缩或模制而生产片剂。压制片可通过在适当的机器中压缩任选与辅助成分混合的自由流动形式的活性化合物如粉末或颗粒而制备。模制片可通过在适当的机器中模制活性化合物(优选为粉末形式)与适当的载体的混合物而制备。
[0153]
在一种优选的实施方式中，注射制剂包括含活性化合物的无菌含水制品的制剂，该制品可与接受者的血液等渗。这种制剂适当地包括与接受者对象的血液为等渗的化合物的溶液或悬浮液。这种制剂可以包含蒸馏水、含5％葡萄糖的蒸馏水或盐水和活性化合物。有用的制剂还包括含本发明的化合物的固态形式的浓溶液或固体，其在用适当的溶剂稀释时得到适合于非肠道给药的溶液。
[0154]
在一种优选的实施方式中，栓剂为用于阴道或直肠给药的制剂，其使用常规的载体即无毒且对粘膜无刺激性的、与本发明的化合物相容的、并且具有储存稳定性和不与本发明的化合物的无定形或结晶形式结合或妨碍其释放的基质。适当的基质包括：可可脂、聚乙二醇-表面活性剂组合、聚氧化烯-40-硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油明胶和氢化植物油。当使用甘油明胶栓剂时，可使用防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
[0155]
在一种优选的实施方式中，该口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
[0156]
在一种优选的实施方式中，该注射制剂为小容量注射剂、大容量注射剂或粉针剂。
[0157]
在一种优选的实施方式中，该粉针剂为冻干粉针剂。
[0158]
在一种优选的实施方式中，该填充剂选自以下的一种或多种：玉米淀粉、糊精、微晶纤维素、改良淀粉、预胶化淀粉、甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、d-山梨醇、赤藻糖醇、木糖醇或果糖。
[0159]
在一种优选的实施方式中，该崩解剂选自以下的一种或多种：低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基淀粉钠、淀粉羟基乙酸钠或交联羧甲纤维素钠。
[0160]
在一种优选的实施方式中，该粘合剂选自以下的一种或多种：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。
[0161]
在一种优选的实施方式中，该润滑剂选自以下的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸锌、液状石蜡、聚乙二醇、二氧化硅、胶体二氧化硅、微粉硅胶、滑石粉或氢
化植物油。
[0162]
在一种优选的实施方式中，该矫味剂选自以下的一种或多种：香橙香精、草莓香精、香草香精、柠檬香精、薄荷香精、樱桃香精、薄荷脑、阿司帕坦、三氯蔗糖、甜菊苷、甘草、半乳蔗糖、蔗糖和糖精钠。
[0163]
在一种优选的实施方式中，该注射用辅料选自以下的一种或多种：亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸盐酸盐、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、右旋糖酐、葡萄糖或甘油。
[0164]
在一种优选的实施方式中，该雄激素依赖性疾病或病症为人或哺乳动物的雄激素依赖性疾病或病症。
[0165]
在一种优选的实施方式中，该雄激素依赖性疾病或病症为与5α-还原酶相关的雄激素依赖性疾病或病症。
[0166]
在一种优选的实施方式中，该雄激素依赖性疾病或病症为前列腺癌、前列腺痛、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、下泌尿道综合征、前列腺炎、痤疮、皮脂溢、雄激素性脱发、多毛症、性早熟、肾上腺过度增生或多囊卵巢综合征。
[0167]
本发明还提供了用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的方法中的试剂盒。所述试剂盒可包括本发明提供的化合物或组合物、第二药物或组合物、以及向医护人员提供关于用于治疗雄激素依赖性疾病或病症的信息的说明书。说明书可以打印形式或以电子介质(例如软盘、cd或dvd)的形式提供，也可以获得此类说明的网站地址的形式提供。本发明提供的化合物或组合物的单位剂量、或第二药物或组合物可包括此剂量，使得当施用于受试者时，所述化合物或组合物的治疗或预防有效血浆水平可在受试者中维持至少1天。在一些实施方案，化合物或组合物可作为无菌水性药物组合物或干粉(例如，冻干)组合物被包含在内。其中，所述第二药物可以是本领域技术人员已知的任何药物，其可有效治疗雄激素依赖性疾病或病症，包括目前已被中国国家药品监督管理局或中国以外的其他类似机构批准的那些药物。
[0168]
在一种优选的实施方式中，可提供合适的包装。本发明所使用的“包装”包括固体基质或通常用于体系中的固体基质或材料，并能够将本发明提供的化合物和/或适合施用于受试者的第二药物保持在固定范围内。此类材料包括玻璃和塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料、和塑料箔叠层包络等。若采用电子束灭菌技术，所述包装应具有足够低的密度以允许对内容物进行灭菌。
[0169]
实施例
[0170]
本发明实施例所采用的常规试剂和材料如表1所示。
[0171]
表1本发明实施例所采用的常规试剂和材料
[0172][0173][0174]
本发明实施例所采用的常规仪器与设备如表2所示。
[0175]
表2本发明实施例所采用的常规仪器与设备
[0176][0177]
本发明的待测化合物(补骨脂查尔酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂二氢黄酮、补骨脂定、补骨脂素、异补骨脂素和3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮(corylifol a))购自于上海源叶生物科技有限公司，纯度大于98％。
[0178]
实验数据计量资料以均数
±
标准差表示，两均数的比较用graphpad-prism统计软件中one-wayanova分析，p《0.05表示差异有统计学意义，其中*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
[0179]
实施例一 补骨脂供试品溶液的制备
[0180]
取补骨脂药材粉末50g，置于1000ml的圆底烧瓶中，加入75％乙醇500ml，90℃回流2小时,重复两次，合并提取液，减压浓缩至100ml，取其中50ml冻干，即得75％乙醇提取物的冻干品，得率为24.0％。该冻干品用dmso溶解为1g生药/ml的浓度，再用pbs缓冲液将其稀释到1mg生药/ml，得到补骨脂供试品溶液。
[0181]
实施例二 补骨脂各提取部位供试品溶液的制备
[0182]
取实施例一剩余的50ml补骨脂药材浓缩提取液，分别按顺序用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水对提取液进行萃取，对萃取液进行减压浓缩，真空减压干燥，即得。得率分别为5.1％、10.9％、11.6％和9.7％。按照补骨脂的生药量计算(称取的提取物质量/得率)，将上述四种干燥品分别用dmso溶解为1g生药/ml的浓度，再用pbs缓冲液将其稀释到1mg生药/ml，得到补骨脂石油醚部位供试品溶液、补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液、补骨脂正丁醇部位供试品溶液和补骨脂水部位供试品溶液。
[0183]
实施例三 待测化合物供试品溶液和阳性对照药度他雄胺溶液配制
[0184]
称取待测化合物和阳性对照药度他雄胺适量，分别以dmso溶解，配成浓度为100mm的母液，保存于-20℃。待实验时，使用pbs缓冲液将母液稀释到1mm，得到补骨脂查尔酮供试品溶液、补骨脂宁供试品溶液、补骨脂二氢黄酮甲醚供试品溶液、补骨脂二氢黄酮供试品溶液、补骨脂定供试品溶液、补骨脂素供试品溶液、异补骨脂素供试品溶液和阳性对照药度他雄胺溶液。
[0185]
实施例四 补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液的化合物鉴别
[0186]
将补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液注入液相色谱仪，进样量为10μl，检测波长312nm，洗脱条件见表3。参考文献方法(zhangy,chen z,xu x,et al.rapid separation and simultaneous quantitative determination of 13 constituents in psoraleae fructus by a single markerusing hplc with diode array detection[j].j sep sci,2017,40:4191-4202)，以补骨脂二氢黄酮(100μg/ml)为对照品，采用高效液相色谱仪(waters e2695高效液相色谱系统，pda检测器)和色谱柱(thermoaccucore c
18
(4.6*100mm，2.6μm))运用一测多评法鉴别补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液中的11个化合物。
[0187]
结果如图1所示。
[0188]
从图1中可以看出，所对应的11个化合物分别为：峰1为补骨脂素(psoralen)，峰2为异补骨脂素(isopsoralen)，峰3为补骨脂二氢黄酮(bavachin)，峰4为新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)，峰5为补骨脂宁(corylin)，峰6为异补骨脂查耳酮(isobavachalcone)，峰7为补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin)，峰8为补骨脂定(psoralidin)，峰9为3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮(corylifol a)，峰10为补骨脂查耳酮(bavachalcone)，峰11为补骨脂酚(bakuchiol)。
[0189]
表3补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液高效液相色谱洗脱条件(b为甲醇，c为乙腈，d为0.1％甲酸)
[0190][0191]
实施例五 待测化合物细胞毒性评价
[0192]
取对数生长期的hacat细胞，以1*104/孔接种于96孔板中，每孔100μl细胞培养液，在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后加药，加入各待测化合物供试品溶液(终浓度分别为25μm，50μm，100μm)和阳性对照药度他雄胺溶液(终浓度为5μm)各10μl，空白对照组为无药物的细胞培养液10μl，待其与细胞作用24h后，将cck-8试剂与培养基按1：10混合，去掉含药物的培养基之后，加入含cck-8的培养基100μl进行反应，反应时间为半小时，使用酶标仪进行检测，在波长480nm下检测每个孔的吸光度值，其od值与活细胞的数量成正比，两次独立重复实验。
[0193]
结果如图2至图9所示。
[0194]
从图2至图9中可以看出，补骨脂查尔酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂二氢黄酮、补骨脂定、补骨脂素、异补骨脂素和3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮的最大加药浓度分别为50μm、100μm、50μm、100μm、25μm、50μm、100μm和50μm。
[0195]
实施例六 补骨脂供试品溶液5α-还原酶的活性检测
[0196]
使用对数生长期的hacat细胞，以2
×
105/孔的密度接种于24孔板中，每孔300μl，在培养箱中培养，待细胞贴壁后加药，加入补骨脂供试品溶液(终浓度分别为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml)和阳性对照药度他雄胺溶液(终浓度为5μm)各150μl，空白对照组为无药物的细胞培养液150μl，待其与细胞作用30min后，加入含25μm t和250μm nadph的培养基150μl，在培养箱中反应24h后，取出培养基，置于5ml离心管中，加入内标t-d3使其终浓度为10ng
·
ml-1
，再加入3倍体积的乙酸乙酯，上下颠倒混匀，离心10000g，5min，取出同体积的上清液，氮气吹干。样品置于-20℃中保存。将吹干的样品用1ml的甲醇复溶，进入lc-ms中进行检测。抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(dht/t-d
3空白对照组-dht/t-d
3样品组
)/dht/t-d
3空白对照组
*100％。
[0197]
色谱条件：使用ab uhplc-esi-ms系统分离，色谱柱使用acquity uplc beh c18色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm particle size；waters corporation)，柱温：40℃。流速：0.4ml
·
min-1
，等度洗脱，流动相为0.5mm乙酸铵-乙腈(30％-70％)，进样体积为5μl。
[0198]
质谱条件：ms参数设定如下：雾化气流速：3l
·
min-1
，加热气体流速：10l
·
min-1
，界面温度：300℃，脱溶剂管温度：250℃，干燥气体流速：10l
·
min-1
，界面电压：3kv，cid气体：270kpa，转换打拿极电压：10kv，检测器电压：2kv，使用t-d3(10ng
·
ml-1
)作为内标分子用于校准分子量。
[0199]
结果如图10所示。
[0200]
从图10中可以看出，补骨脂药材75％醇提取物对于hacat细胞中的5α-还原酶显示出较强的抑制作用，并展现出一定的剂量依赖性。
[0201]
实施例七 补骨脂各提取部位供试品溶液5α-还原酶的活性检测
[0202]
使用对数生长期的hacat细胞，以2
×
105/孔的密度接种于24孔板中，每孔300μl，在培养箱中培养，待细胞贴壁后加药，加入补骨脂石油醚部位供试品溶液、补骨脂乙酸乙酯部位供试品溶液、补骨脂正丁醇部位供试品溶液和补骨脂水部位供试品溶液(终浓度分别为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml)和阳性对照药度他雄胺溶液(终浓度为5μm)各150μl，空白对照组为无药物的细胞培养液150μl，待其与细胞作用30min后，加入含25μm t和250μm nadph的培养基150μl，在培养箱中反应24h后，取出培养基，置于5ml离心管中，加入内标t-d3使其终浓度为10ng
·
ml-1
，再加入3倍体积的乙酸乙酯，上下颠倒混匀，离心10000g，5min，取出同体积的上清液，氮气吹干。样品置于-20℃中保存。将吹干的样品用1ml的甲醇复溶，进入lc-ms中进行检测。抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(dht/t-d
3空白对照组-dht/t-d
3样品组
)/dht/t-d
3空白对照组
*100％。
[0203]
实施例七的色谱条件、质谱条件与实施例六相同。
[0204]
结果如图11至图14所示。
[0205]
从图11至图14中可以看出，相比于其它部位例如补骨脂药材75％醇提取物水部位、正丁醇部位和石油醚部位，补骨脂药材75％醇提取物乙酸乙酯部位对于hacat细胞中的5α-还原酶显示出更强的抑制作用。其中在0.5mg/ml上，乙酸乙酯部位、水部位、正丁醇部位和石油醚部位的抑制率分别为73.04％、12.86％、58.72％和56.90％。
[0206]
实施例八 待测化合物5α-还原酶的活性检测
[0207]
使用对数生长期的hacat细胞，以2
×
105/孔的密度接种于24孔板中，每孔300μl，在培养箱中培养，待细胞贴壁后加药，加入补骨脂查尔酮供试品溶液、补骨脂宁供试品溶
液、补骨脂二氢黄酮甲醚供试品溶液、补骨脂二氢黄酮供试品溶液、补骨脂定供试品溶液、补骨脂素供试品溶液、异补骨脂素供试品溶液(终浓度分别为50μm、100μm、50μm、100μm、25μm、50μm和100μm)和阳性对照药度他雄胺溶液(终浓度为5μm)各150μl，空白对照组为无药物的细胞培养液150μl，待其与细胞作用30min后，加入含25μm t和250μm nadph的培养基150μl，在培养箱中反应24h后，取出培养基，置于5ml离心管中，加入内标t-d3使其终浓度为10ng
·
ml-1
，再加入3倍体积的乙酸乙酯，上下颠倒混匀，离心10000g，5min，取出同体积的上清液，氮气吹干。样品置于-20℃中保存。将吹干的样品用1ml的甲醇复溶，进入lc-ms中进行检测。抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(dht/t-d
3空白对照组-dht/t-d
3样品组
)/dht/t-d
3空白对照组
*100％。
[0208]
实施例八的色谱条件、质谱条件与实施例六相同。
[0209]
结果如图15所示。
[0210]
从图15中可以看出，化合物补骨脂查尔酮(50μm)(抑制率为75.19％)、补骨脂二氢黄酮甲醚(50μm，抑制率为37.94％)、补骨脂二氢黄酮(100μm，抑制率为64.27％)、补骨脂定(25μm，抑制率为60.83％)和3'-香叶草基-4',7-二羟基异黄酮(corylifol a)(50μm，抑制率为69.42％)。
[0211]
对5α-还原酶有显著的抑制作用(p《0.001)，异补骨脂素(100μm)对5α-还原酶有显著的促进作用(p《0.001，抑制率为-119.317％)，补骨脂宁(100μm，抑制率为0.85％)和补骨脂素(50μm，抑制率为5.90％)对5α-还原酶既无抑制作用也无促进作用。
[0212]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0213]
以上对本技术实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本技术的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本技术的思想，基于本技术的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本技术保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。