一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1及其分离筛选与鉴定方法和应用与流程

一种贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1及其分离筛选与鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌 yfb3-1及其分离筛选与鉴定方法和应用。


背景技术：

2.百合枯萎病又称根腐病、茎腐病，是百合生产栽培中最为严重、 造成经济损失最大的一种真菌性病害，具有危害大、分布广、防治难 等特点，严重影响了百合的产量和品质，阻碍了百合产业的发展。镰 刀菌引起的百合枯萎病是其栽培过程中最为普遍和严重的。在百合栽 培过程中的任何温度和湿度条件下，镰刀菌都能够有效存活或者进行 生长繁殖，因此，百合在整个生长周期均可能被染病。连作百合的枯 萎病具有发生广泛、发病严重、防治困难等特点，造成产量和品质急 剧下降，已成为百合种植及其相关产业发展的主要限制因素，因此， 防治百合枯萎病已经成为其种植过程中面临的主要难题。
3.蚯蚓是土壤动物中生物量最大的物种，对土壤生态系统的物质循 环和能量转换起着重要的作用，对维持土壤生态系统的结构和功能起 着重要的调控作用，蚯蚓是土壤改良的“工程师”，与微生物具有互 作关系，通过其肠道将随食物进入体内的部分微生物被杀死，与蚯蚓 存在互利共生的微生物会成为优势菌群，在蚯蚓肠道内迅速扩繁，并 且通过其挖掘和排泄有利于在土壤中进一步繁殖和传播，改变了土壤 微生物群落结构和组成。蚯蚓肠道中分离出的菌群与土壤和新鲜的蚯 蚓粪的菌群存在显著差异，主要有四个生理类群，即植物生长促进剂、 游离活氮固化剂、杀菌剂和磷酸盐溶解剂。
4.蚯蚓可以通过直接或间接作用影响了微生物组成、丰富度和活性， 进而有效调节土壤的微生态系统，促进土壤养分循环，提高土壤生物 肥力，并且减少作物枯萎病的发生。
5.因此，利用蚯蚓调控土壤微生态环境成为了缓解作物连作障碍的 新途径。其肠道内是否具有高效拮抗百合尖孢镰刀菌的微生物以及其 作用和运用方向成为目前研究的主要发展方向。


技术实现要素：

6.针对上述缺点，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1及其 分离筛选与鉴定方法和应用。本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1对百合 枯萎病主要致病菌-尖孢镰刀菌的抑菌效果较强，并对百合的土传病 原真菌三线镰刀菌、茄腐镰刀菌、链格孢、齐整小核菌、疫霉菌、青 霉和黑曲霉都具有较好的拮抗效果，抑制率均在75％以上，具有高效 广谱抗土传病原真菌的能力；本发明方法能够有效从蚯蚓肠道中分离、 纯化、筛选和鉴定贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1，本发明方法易于操作， 能够快速分离蚯蚓肠道内含物，通过筛选和鉴定能够准确可靠得到所 述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆 菌yfb3-1在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctcc m20221140，保藏机构地址：湖北省武汉市武昌区
八一路299号，保藏 日期：2022年7月21日，分类名称：bacillus velezensis yfb3-1。
9.优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1菌落为乳白色，无光泽， 表面皱褶，边缘隆起不整齐，中间凹陷。
10.本发明还要求保护一种用于分离筛选和鉴定上述贝莱斯芽孢杆 菌yfb3-1的方法，包括如下步骤：
11.(1)分离：用无菌水清洗蚯蚓表面，然后用酒精对蚯蚓体表消 毒并致其死亡，接着解剖取出蚯蚓肠道内含物；
12.(2)纯化：将步骤(1)得到的含物加入到装有经过灭菌处理的 无菌水三角瓶中，振荡后制成悬液，再用无菌水将悬液稀释成10-3
梯 度的稀释液、10-4
梯度的稀释液和10-5
梯度的稀释液；将稀释后的10-3
梯度的稀释液涂布在na培养基的平板上进行培养，将稀释后的10-4
梯度的稀释液涂布到孟加拉红琼脂培养基的平板上进行培养，将稀释 后的10-5
梯度的稀释液涂布到改良高氏一号培养基的平板上进行培养； 然后挑取三种培养基平板上长势好的单菌落进行划线纯化菌株；
13.(3)筛选：将百合尖孢镰刀菌在pda上进行活化，接着用打孔 器在活化后的菌落边缘进行打孔，并取菌饼；将菌饼上长有菌丝的一 面朝下转接到新pda平板中央，然后采用十字交叉法点样分离纯化好 的菌株进行培养并筛选出对百合病原真菌尖孢镰刀菌拮抗作用最强 的拮抗菌株；
14.(4)鉴定：将步骤(3)所筛选出的拮抗菌株进行形态学鉴定， 然后进行分子生物学鉴定，鉴定出所述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1。
15.优选的，步骤(1)中所述酒精的体积分数为75％。
16.优选的，步骤(2)中所述振荡时间为15-45min，所述na培养基 的成分包括：蛋白胨7.5-15g，牛肉膏2-5g，nacl 3-6g，琼脂18-22g， 去离子水1000ml；所述孟加拉红琼脂培养基成分包括：蛋白胨3-8g， 葡萄糖8-12g，mgso4·
7h2o 0.25-1.5g，k2hpo
4 1.0g，孟加拉红 0.015-0.045g，琼脂18-22g，去离子水1000ml，质量浓度为1％的链 霉素溶液2-5ml；所述高氏1号培养基的成分包括：kno
3 0.5-1.5g， 可溶性淀粉18-22g，k2hpo
4 0.25-1g，mgso4·
7h2o 0.25-1g，nacl 0.25-1.5g，feso4·
7h2o 0.005-0.015g，琼脂18-22g，去离子水1000ml； 所述培养温度为25-45℃。
17.优选的，步骤(3)中所述pda的制备方法为：将马铃薯去皮切 块并称取100-300g，加水煮沸25-45min后制成浸汁，然后加入葡萄糖 18-22g，琼脂18-22g，加去离子水定容至1000ml；所述培养温度为 25-45℃。
18.优选的，步骤(4)中所述形态学鉴定的方法为：将拮抗菌划线 到所述na培养基固体平板上，在25-45℃条件下恒温培养箱中培养2-5 天，并且记录有单菌落的菌落形态，然后采用革兰氏染色法对菌体染 色，观察菌体的形态特征以及扫描电镜观察菌体形态和测量大小进行 形态学鉴定；所述分子生物学鉴定的方法为：采用细菌16s rdna基 因片段的通用引物扩增，然后进行基因测序进行分子生物学鉴定。
19.本发明还要求保护一种利用上述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1在防治 百合枯萎病上的应用。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.(1)本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1对百合枯萎病主要致病菌
‑ꢀ
尖孢镰刀菌的抑菌
效果较强，并对百合的土传病原真菌三线镰刀菌、 茄腐镰刀菌、链格孢、齐整小核菌、疫霉菌、青霉和黑曲霉都具有较 好的拮抗效果，抑制率均在75％以上，具有高效广谱抗土传病原真菌 的能力。
22.(2)本发明方法能够有效从蚯蚓肠道中分离、纯化、筛选和鉴 定贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1，本发明方法易于操作，能够快速分离蚯 蚓肠道内含物，通过筛选和鉴定能够准确可靠得到所述贝莱斯芽孢杆 菌yfb3-1。
23.(3)本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1对百合尖孢镰刀菌枯萎病具 有较好的预防和治疗效果，在对缓解作物连作障碍有很大的应用价值。
附图说明
24.图1为蚯蚓肠道微生物对尖孢镰刀菌的拮抗效果图；
25.图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1菌落形态图；
26.图3为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1菌膜形态图；
27.图4为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1光学显微镜图；
28.图5为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1扫描电镜图；
29.图6为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1的16s rdna基因序列的 系统发育树；
30.图7为本发明贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1百合部分病原真菌的抑菌 效果图。
具体实施方式
31.以下将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述地实施例是本发明一部分实 施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属 于本发明保护的范围。
32.如无特殊说明外，本发明中的化学试剂和材料均通过市场途径购 买或通过市场途径购买的原料合成。
33.所述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1在中国典型培养物保藏中心的保藏 编号为cctcc m 20221140，保藏日期：2022年7月21日，分类名称： bacillus velezensis yfb3-1，保藏机构地址：湖北省武汉市武昌区八 一路299号。
34.百合品种为卷丹百合，由湖南龙山绿叶农产品有限公司提供。蚯 蚓品种为赤子爱胜蚓大平2号，收集于中国科学院亚热带农业生态研 究所长沙市农业与环境监测研究站开展接种蚯蚓缓解百合连作障碍 试验的土壤。
35.供试病原菌：尖孢镰刀菌(f.oxysportum)、三线镰刀菌(f. trilobium)和链格孢(a.alternata)来源于湖南农业大学植保学院， 齐整小核菌(s.rolfsii)、疫霉菌(phytophthora parasitica)、茄病镰刀 菌(f.solani)、青霉(penicillium cyclopium)、黑曲霉(aspergillus niger) 和枯草芽孢杆菌(b.subtilis)来源于湖南省农业环境生态研究所，其 中以上的病原真菌均从染病百合植株或种球上分离获得。
36.市售芽孢杆菌复合制剂为北京臻裕疆某农业科技有限公司生产 粉剂，含有枯草芽孢杆菌、侧芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和胶质芽孢杆 菌，有效活菌总数≥2
×
108cfu/g。
37.na固体培养基的成分如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，nacl 5.0g，琼脂20.0g，去
离子水1000ml，ph自然，121℃灭菌30min。
38.孟加拉红琼脂培养基的成分如下：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g， mgso4·
7h2o 0.5g，k2hpo
4 1.0g，孟加拉红0.033g，琼脂20.0g，去 离子水1000ml，质量浓度1％的链霉素溶液3ml；
39.高氏1号培养基的成分如下：kno
3 1.0g，可溶性淀粉20.0g， k2hpo
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g，琼 脂20.0g，去离子水1000ml；
40.pda的制备方法如下：将马铃薯去皮切块并称取200.0g，加800ml 去离子水煮沸30min后制成浸汁，然后进行过滤得到滤液，在滤液中 加入葡萄糖20.0g和琼脂20.0g，最后加去离子水定容至1000ml。
41.实施例1
42.一种上述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1的分离筛选和鉴定方法，包括 如下步骤：
43.(1)分离：首先无菌水清洗蚯蚓表面，再用75％的酒精对蚯蚓 体表消毒并致其死亡，然后解剖取出蚯蚓肠道内含物；
44.(2)纯化：将步骤(1)得到的含物加入到装有经过灭菌处理的 无菌水三角瓶中，振荡30min后制成悬液，再用无菌水将悬液稀释成 10-3
梯度的稀释液、10-4
梯度的稀释液和10-5
梯度的稀释液；将稀释后 的10-3
梯度的稀释液涂布在na培养基的平板上进行培养，将稀释后的 10-4
梯度的稀释液涂布到孟加拉红琼脂培养基的平板上进行培养，将 稀释后的10-5
梯度的稀释液涂布到改良高氏一号培养基的平板上进行 培养；置于30℃培养，待菌落长到一定程度出后，然后挑取三种培养 基平板上长势好的单菌落进行划线纯化菌株(菌落形态相同的归纳为 一株)，保存备用。
45.(3)筛选：将百合尖孢镰刀菌在pda上进行活化，接着用直径 为0.6cm的打孔器在活化后的菌落边缘进行打孔，并取菌饼；将菌饼 上长有菌丝的一面朝下转接到新pda平板中央，然后采用十字交叉法 在距离平板正中央2.5cm处点样分离纯化好的菌株，以不接种作为对 照。置于30℃培养，待对照的病菌长满整个平板为止，测量各病原菌 直径、抑菌带宽等指标，计算抑制率，根据抑制率大小筛选出对百合 病原真菌尖孢镰刀菌拮抗作用最强的拮抗菌株。按照以下公式计算抑 制率：
46.抑制率＝[(对照病原菌半径-0.3)-(处理病原菌半径-0.3)]/(对照病原菌 半径-0.3)
×
100％。
[0047]
(4)鉴定：将步骤(3)所筛选出的拮抗菌株进行形态学鉴定， 然后进行分子生物学鉴定，鉴定出所述贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1。
[0048]
形态学鉴定：将优选的蚯蚓肠道拮抗菌划线到na培养基固体平 板上，在30℃条件下恒温培养箱中培养3天，记录有单菌落的菌落形 态，采用革兰氏染色法对菌体染色，观察菌体的形态特征，扫描电镜 观察菌体形态和测量大小。
[0049]
分子生物学鉴定：将待测菌株接种到灭菌好的nb培养基中30℃ 培养48h后，取发酵菌液10000r/min离心10min，收集沉淀，用无菌生 理盐水混匀再次离心，收集菌体沉淀，置于在-80℃下迅速冷冻后， 利用冰袋快递到送至长沙奥基生物科技有限公司，采用细菌16s rdna基因片段的通用引物(27f和1492r)扩增，进行基因测序。
[0050]
从接种蚯蚓缓解连作百合试验的蚯蚓肠道中分离纯化得到146株 菌株(包括细菌、真菌和放线菌)。利用平板对峙法并以尖孢镰刀菌 为靶标，对分离纯化好的菌株进行抑
菌试验初筛，一共筛选到对尖孢 镰刀菌具有明显抑菌效果的菌株33株(其中细菌18株、真菌3株、放 线菌12株)，对百合尖孢镰刀的抑制率超过76％的菌株有11株，如表1 所示：
[0051]
表1蚯蚓肠道微生物对尖孢镰刀菌的拮抗效果
[0052][0053]
注：数据为四次重复的平均值。小写字母表示不同处理间差异显著(p《0.05)
[0054]
由表1可知，细菌菌株yfb3-1对尖孢镰刀的抑菌效果最好，其抑 制率显著大于其他菌株，为80.03％。图1为蚯蚓肠道微生物对尖孢镰 刀菌的拮抗效果图，图中a为阴性对照，b为阳性对照(枯草芽孢杆 菌)，c为yfb1-4，d为yfb3-1，e为yfb6-2。
[0055]
对拮抗细菌yfb3-1进行形态学鉴定，拮抗细菌yfb3-1在na培养 基上，如图2所示，在28℃的培养条件下生长3d形成的纯培养物具有 如下特征：菌落为乳白色，无光泽，表面皱褶，边缘隆起不整齐，中 间凹陷；如图3所示，液体静止培养时形成乳白色菌膜；如图4所示， 经革兰氏染色后，显微镜下观察发现yfb3-1菌体呈蓝紫色，为革兰 氏阳性细菌，大部分为椭圆形，小部分为杆状，直或略弯，单个或短 链状排列；如图5所示，芽孢呈椭圆形，芽孢中生，长度1.4～1.8μm， 宽0.7μm。根据菌落、菌体的形态特征，初步确定yfb3-1属于为芽孢 杆菌类。
[0056]
对拮抗细菌yfb3-1进行分子生物学鉴定，以待测菌株yfb3-1的 基因组dna为模板，利用细菌通用引物27f/1492r，对yfb3-1进行 pcr扩增，得到1条长度1417bp的dna片段。将菌株yfb3-1的16s rdna基因序列输入到ncbi数据库中进行blast相似性比对分析，以 16s rdna基因序列同源性为基础，从结果中选取12株具有代表性的 菌株，采用mega 7.0软件构建该菌株的系统发育树，如图6所示，菌 株yfb3-1的遗传进化距离与芽孢杆菌属最近，与已知菌株 b.velezensis wh-1(mk522153.1s)处于一个最小的分支，同源性达 到99％，可以确定菌株yfb3-1为贝莱斯芽孢杆菌。
[0057]
对贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1进行抗菌谱测定，取试验所需的百合 不同病原真菌在pda培养基上进行活化。将不产和产生孢子较差的病 原真菌，如尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、疫霉菌、三线镰刀菌、齐整小 核菌、链格孢，用直径为0.6cm的打孔器在病菌边缘进行打孔取菌饼， 将菌饼上长有菌丝的一面朝下转接到新的pda平板中央。而产孢子较 好的百合病原真菌如黑曲霉和青霉，采用点样法接种到pda平板中央。
[0058]
抑菌试验方法和利用菌饼转接法的抑制率计算公式如下：采用十 字交叉法在距离平板正中央2.5cm处点样分离纯化好的菌株，以不接 种作为对照。置于30℃培养，待对照的病菌长满整个平板为止，测量 各病原菌直径、抑菌带宽等指标，计算抑制率。抑制率计算
公式如下：
[0059]
抑制率＝[(对照病原菌半径-0.3)-(处理病原菌半径-0.3)]/(对照病 原菌半径-0.3)
×
100％。
[0060]
利用病孢子点样法的抑制率计算公式如下：
[0061]
抑制率＝(对照病原菌半径-处理病原菌半径)/对照病原菌半径
ꢀ×
100％。
[0062]
结果如表2所示：
[0063]
表2 yfb3-1的抑菌谱结果
[0064][0065]
注：数据为四次重复的平均值。小写字母表示不同处理间差异显著(p《0.05)
[0066]
由表2可知，贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1对百合尖孢镰刀菌、三线镰 刀菌、茄腐镰刀菌、链格孢、齐整小核菌、疫霉菌、青霉和黑曲霉八 种病原真菌都具有较好的抑菌效果，抑菌效果图如图7所示，图中a 为尖孢镰刀菌；b为茄腐镰刀菌；c为三线镰刀菌；d为链格孢；e为 齐整小核菌；f为黑曲霉。
[0067]
采用盆栽防治试验，选择圆形花盆(上内直径0.25m
×
下内直径 0.16m
×
内高0.16m)，每个花盆栽种3株百合种球，第一年9月25日左右 栽种后放置在网室进行过冬出苗管理，第二年4月3日左右等百合出苗， 将出苗高度为0.15m的百合花盆转移到具有一定光照室内备用。
[0068]
预防试验：先将贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1经灭菌好的nb培养基发 酵后稀释为菌体浓度为107cfu/ml的菌液，以无菌水为阴性对照， 以商品芽孢杆菌溶于无菌水制成菌体浓度为107cfu/ml的菌液为阳 性对照，每株百合用50ml菌液或无菌水灌根3d后，在距离每株百合 3cm处接种百合病原真菌尖孢镰刀菌的直径1cm的菌饼1个，每处理栽 培5盆，每盆种植有3株百合种球，重复3次，一共45盆。室内温度控 制在28℃，相对湿度保持在90％左右，灌根20d后观察百合发病情况。
[0069]
治疗试验：先在距离每株百合3cm处接种百合病原真菌-尖孢镰刀 菌的1个直径1cm的菌饼7d后，再以贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1的配制菌 液为处理，以无菌水为阴性对照，以市售芽孢杆菌复合制剂的菌液为 阳性对照，每株百合用50ml菌液或无菌水灌根，每处理栽培5盆，每 盆种植有3株百合种球，重复3次，一共45盆。室内温度控制在28℃， 相对湿度保持在90％左右，灌根20d后观察百合发病情况。以株为单 位进行调查，根据百合枯萎病发病程度进行相关的分级调查，统计好 总株数、各级病株数。调查分级标准如下：0级为植株茎秆正常，全 株无病叶；1级为病株底部变黄或变紫叶片数不超过整株叶片数的 25％，茎顶端变浅紫色，心叶向一侧轻度弯曲；2级为病株底部叶片 枯萎或枯萎叶片数占整株的25％～50％，茎上部变紫色且明显弯曲； 3级为病株枯萎的叶片超过50％，茎中上部变紫色，且严重弯曲；4级 为全株的叶片都枯萎或整株枯死，茎基部维管束变褐。其中：
[0070]
发病率＝发病株数/总株数
×
100％
[0071]
病情指数＝σ(各级病株数
×
相对级数值)/(总株数
×
最高级数值)
×
100
[0072]
相对防治效果＝(对照的病情指数-处理的病情指数)/对照的病情指 数
×
100％
[0073]
结果如表3所示：
[0074]
表3贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1对百合枯萎病的防治效果
[0075][0076]
由表3可知，在预防条件下，灌根贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1菌液， 其尖孢镰刀菌引起的百合枯萎病发病率和病情指数最低，分别为 35.56％和13.33，都显著低于无菌水和商用生防菌剂对照，其相对于 无菌水的防治效果为64.18％，比市售芽孢杆菌复合制剂的防效提高 了34.38％。在治疗条件下，灌根贝莱斯芽孢杆菌yfb3-1菌液，其尖 孢镰刀菌引起的百合枯萎病发病率和病情指数最低，分别为62.22％ 和25.56，都显著低于清水对照，其相对于清水的防治效果为30.3％， 比市售芽孢杆菌复合制剂的防效提高了33.3％。因此，贝莱斯芽孢杆 菌yfb3-1在灌根条件下对百合尖孢镰刀菌枯萎病具有较好的预防和 治疗效果。
[0077]
以上内容是结合具体实施实例对本发明所做的进一步详细说明， 不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做 出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0078]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例 而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任 何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。