一种乳制品中四种全氟化合物的快速检测方法

1.本发明属于乳制品检测技术领域，尤其涉及一种乳制品中四种全氟化合物的快速检测方法。


背景技术：

2.全氟化合物(pfcs)是一类常用的人工合成的有机化合物，包括全氟辛酸(pfoa)、全氟辛烷磺酸(pfos)、全氟壬酸(pfna)及全氟癸酸(pfda)等，全氟化合物具有防水、防油和稳定性好等特性，广泛应用于纺织品、化妆品、不粘涂层材料等工业产品和日常生活用品。全氟化合物可在环境中长期存在，通过呼吸、饮食等途径进入生物体，并在生物体内累积和放大，pfcs进入人体后，可影响人体生殖系统、内分泌以及神经系统健康。全氟辛酸(pfoa)和全氟辛烷磺酸(pfos)是应用最频繁的两种全氟化合物。2009年，pfos被正式确认为持久性有机污染物。无疑，展开全氟化合物(pfcs)检测的研究迫在眉睫。
3.人体pfcs的监测研究目前已有广泛报道。血液、尿液和母乳等体液是人体污染物监测中的常用介质。目前，血液和尿液检测方法相对成熟，而乳制品如母乳作为婴幼儿主要的食物来源，与血液和尿液相比，其中的pfcs污染可直接影响幼儿的健康。为此，开发乳制品中pfcs的检测方法对于阻断母婴间pfcs传递、保护婴幼儿身心健康具有重要意义。
4.针对人体组织样本，因血液和乳制品的蛋白和磷脂含量高，磷脂类物质和基质效应会严重影响uplc-ms/ms的检测数据，目前已有的研究方法均不能很好的解决此类问题。


技术实现要素：

5.针对以上技术问题，本发明公开了一种乳制品中四种全氟化合物的快速检测方法，大幅提高了检测的精密度和重现性。
6.对此，本发明采用的技术方案为：
7.一种乳制品中四种全氟化合物的快速检测方法，包括如下步骤：
8.步骤s1，对待测样品进行离心处理，取上清液，加入处理剂，混匀后通过去磷脂板净化，得到净化后样品，其中，所述处理剂为1～5％(体积百分比)甲酸甲醇溶液；
9.步骤s2，通过液相色谱-质谱法测定净化后样品中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、全氟壬酸、全氟癸酸的含量。
10.此技术方案采用去磷脂法，使得乳制品中蛋白磷脂可以有效的被消除，从而大幅提高方法的精密度和重现性。
11.作为本发明的进一步改进，步骤s1中，所述处理剂为1％(体积百分比)甲酸甲醇溶液。
12.作为本发明的进一步改进，步骤s2中，所述液相色谱-质谱法的色谱条件为：色谱柱采用c18柱；流动相由a相和b相组成，a相为甲醇或乙腈，b相为添加了1～50mmol/ml乙酸铵的0～0.1％(体积百分比)甲酸水溶液；采用梯度洗脱；
13.所述液相色谱-质谱法的质谱条件为：采用负离子电喷雾(esi-)模式电离，多反应
监测(mrm)模式，毛细管电压2800v，cid气体1.5mtorr，干燥气温度为350℃，离子传输管温度为350℃，鞘气流量为55arb，辅助气流量为12arb。
14.作为本发明的进一步改进，步骤s2中，所述色谱柱采用acquity uplc beh c
18
。
15.作为本发明的进一步改进，步骤s2中，a相为甲醇，b相为添加了1mmol/ml乙酸铵的0.1％(体积百分比)甲酸水溶液。
16.离子传输管温度为350℃，鞘气流量为55arb，辅助气流量为12arb。
17.作为本发明的进一步改进，所述梯度洗脱的程序为：0-0.5min，a相10％；0.5-10min，a相递增至95％；10-13min，a相10％。其中百分比为体积百分比。
18.作为本发明的进一步改进，步骤s2中，质谱参数如下：
[0019][0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0021]
本发明的技术方案采用去磷脂板萃取-超高效液质联用法检测乳制品中pfcs的浓度水平，与c18吸附剂分离固相萃取法相比，该方法显著提高了乳制品中pfcs检测的精密度、回收率和样本处理效率，有效节省了实验耗时。而且该方法重现性佳、灵敏度强、回收率高、操作简单，适用于乳制品中四种pfcs的快速测定。
附图说明
[0022]
图1是本发明实施例的4种pfcs混合标准溶液色谱图。
具体实施方式
[0023]
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0024]
实施例1
[0025]
一种母乳中四种全氟化合物的快速检测方法，包括如下步骤：
[0026]
步骤s1，对待测样品进行离心处理，取上清液，加入处理剂1％(体积百分比，下同)甲酸甲醇溶液，混匀后通过去磷脂板净化，得到净化后样品；
[0027]
步骤s2，通过液相色谱-质谱法测定净化后样品中四种全氟化合物的含量。
[0028]
步骤s2中，所述液相色谱-质谱法的色谱条件为：色谱柱采用acquity uplc beh c
18
柱；流动相由a相和b相组成，a相为甲醇，b相为添加了1mmol/ml乙酸铵的0.1％(体积百分
比，下同)甲酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0-0.5min，a相10％；0.5-10min，a相递增至95％；10-13min，a相10％。
[0029]
所述液相色谱-质谱法的质谱条件为：采用负离子电喷雾(esi-)模式电离，多反应监测(mrm)模式，毛细管电压2800v，cid气体1.5mtorr，干燥气温度为350℃，离子传输管温度为350℃，鞘气流量为55arb，辅助气流量为12arb。
[0030]
下面结合具体的实施例进行说明。
[0031]
(1)样本：
[0032]
样本采用志愿捐献的方式，捐献者均在深圳居住5年以上，年龄为22～30岁，且居住期间未有化工厂、油漆厂等重污染企业的工作经历(无职业暴露)，共收集15份母乳样本。母乳样本均手工采集，每份母乳收集50ml，放入甲醇清洗过的玻璃容器内，立即将样本储存在-20℃的冰箱内。全部捐献者均被告知研究目的，并签署知情同意书。
[0033]
(2)仪器和试剂：
[0034]
采用三重四级杆质谱仪tsq-quantum ultra(美国thermo fisher公司)，液相色谱系统为dionex u3000液相色谱配备自动进样器，液相由chromeleon工作站控制。分析柱为hypersil gold(100mm
×
2.1mm，3μm，美国thermo fisher公司)、acquity uplc beh c
18
(100mm
×
2.1mm，1.7μm，美国waters公司)、eclipse plus c
18 rrhd(50mm
×
2.1mm，1.8μm，美国agilent公司)、acquity uplc hss t3(50mm
×
2.1mm，1.8μm，美国waters公司)。
[0035]
所有实验用水均来自milli-q simplicity超纯水系统(美国millipore公司，18.2mω*cm)；100～1000μl和20～200μl移液器购自美国eppendorf公司，1～10ml瓶口分液器购自德国sartorius公司，96孔固相萃取装置购自美国waters公司，ostro 96孔去磷脂板购自美国waters公司，台式高速离心机1-14购自德国sigma公司，50ml聚丙烯离心管购自美国thermo fisher公司。
[0036]
100μg/ml全氟壬酸(pfna)、全氟癸酸(pfda)、全氟辛酸(pfoa)、全氟辛烷磺酸(pfos)标准品均购自美国sigma-aldrich公司，实验用甲醇(色谱纯)购自德国merck公司，乙酸铵、甲酸(色谱纯)购自美国tedia公司，无水mgso4(分析纯)和nacl(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司，c
18
吸附剂购自安捷伦科技有限公司。
[0037]
(3)标准溶液的配制
[0038]
准确吸取100μg/ml的标准液用流动相初始比例溶液配置成5个梯度标准浓度的混合标准溶液用于制作工作曲线，分别为0.05、0.1、1、10、50ng/ml，密封保存于4℃冰箱中。空白母乳中添加不同量的混合标准溶液，得到3个不同浓度的质控液，分别为0.5、5、50ng/ml作为低、中、高浓度质控，用于计算回收率、日内精密度和日间精密度。
[0039]
(4)前处理的控制
[0040]
采用4种pfcs含量极低(信噪比小于3)的样本作为空白母乳，并以此浓度用于空白控制的基线值。为避免前处理过程中引入干扰，实验中所使用的容器均为玻璃制品。
[0041]
(5)样品前处理
[0042]
1ml母乳样品经过高速离心后，取0.4ml上清液，加入0.6ml 1％(体积百分比)甲酸甲醇溶液，混匀过96孔去磷脂板，控制真空泵压力，使样品在4min流出。将净化后样品转移到2ml样品瓶中，供液质分析。
[0043]
(6)液相色谱条件
[0044]
超高效液相色谱分析柱：acquity uplc beh c
18
；柱温：40℃；流动相：a相为甲醇，b相为0.1％(体积百分比)甲酸水 1mmol/ml乙酸铵；梯度洗脱程序如表1所示；自动进样系统进样量10μl。
[0045]
表1 梯度洗脱程序
[0046][0047]
(7)质谱条件
[0048]
负离子电喷雾(esi-)模式电离，多反应监测(mrm)模式；毛细管电压2800v，cid气体1.5mtorr，干燥气温度为350℃，离子传输管温度为350℃，鞘气流量为55arb，辅助气流量为12arb。质谱参数如表2所示。
[0049]
表2 质谱参数
[0050][0051]
对比例1
[0052]
在实施例1的基础上，步骤s1中，本对比例采用c
18
吸附剂分离固相萃取法(详见lankova d，lacina o，pulkrabova j，et al.the determination of perfluoroalkyl substances,brominated flame retardants and their metabolites in human breast milk and infant formula[j].talanta，2013，117(complete):318-325.)对样品进行处理。
[0053]
也就是针对样品母乳中4种pfcs使用不同前处理方法，分别采用96孔去磷脂板与lankova等采用的c
18
吸附剂分离固相萃取法进行比较，测定结果如表3所示。
[0054]
通过表3的结果可见，母乳样本经96孔去磷脂板萃取后，4种pfcs的回收率优于经c18
吸附剂分离固相萃取。同时，96孔去磷脂板在大批量处理样本时大幅缩短了萃取时间，节约了前处理时间。
[0055]
表3 两种前处理方法加标回收率结果(n＝5)
[0056][0057]
实施例2
[0058]
在实施例1的基础上，本实施例中，步骤s1的处理剂分别采用纯甲醇溶液，以及5％甲酸甲醇溶液两种方案与实施例1进行比较，测定结果如表4所示。结果显示添加1％甲酸甲醇溶液、5％甲酸甲醇溶液进行处理的，回收率要明显优于纯甲醇溶液，以1％甲酸甲醇溶液处理的效果最好。
[0059]
表4 添加不同溶剂前处理方法加标回收率结果(n＝5)
[0060][0061]
实施例3
[0062]
在实施例1的基础上，本实施例中，步骤s2分别选取hypersil gold、、eclipse plus c
18 rrhd、acquity uplc hss t3这几种色谱柱与实施例1进行对比，流动相选择甲醇：
1mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水，4种pfcs浓度为10ng/ml的混标连续进样，再经过比较4种化合物在不同色谱柱中的丰度、半峰宽、峰形、信噪比等指标表现综合进行评定。
[0063]
经比较发现，相较于hypersil gold、eclipse plus c
18 rrhd、acquity uplc hss t3色谱柱，pfoa、pfna、pfda在acquity uplc beh c
18
柱上明显表现的更出色，3种物质的丰度要高于其他3种色谱柱，同时信噪比也是4种色谱柱中最高的，但是pfos在4种色谱柱上的色谱行为差别不大，4种pfcs混标色谱图见图1。
[0064]
实施例4
[0065]
在实施例1的基础上，本实施例步骤s2中采用acquity uplc beh c
18
色谱柱，采用几种不同的流动相体系与实施例1进行对比，几种流动体系的情况如表5所示。不同流动相中pfcs的色谱行为稍显不同，但基本都能满足检测要求。下面进行具体分析。有机相为甲醇时，4种pfcs在水相流动相为1mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水和50mmol/l乙酸铵溶液中丰度是最高的，在10mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水和50mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水中丰度略低。但是1mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水和50mmol/l乙酸铵溶液的信噪比略有不同，其中，pfoa在50mmol/l乙酸铵溶液的信噪比要略高于1mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水的信噪比，pfos在两种水相流动相中的信噪比差别不大，pfna和pfda在1mmol/l乙酸铵加入0.1％甲酸水的信噪比要明显高于50mmol/l乙酸铵溶液的信噪比，并且4种pfcs在低浓度乙酸铵中的重现性更好。以乙腈作为有机相的情况下，4种pfcs只是保留时间有所改变，对信噪比、峰型并没有改善，丰度均有所降低。
[0066]
表4 流动相体系优化
[0067][0068]
实施例5
[0069]
对实施例1的方法进行线性范围和检出限的实验，具体包括：
[0070]
配制质量浓度为0.05～50ng/ml的4种pfcs的系列混合标准溶液，每个浓度样品持续进样5次，取均值用以标准曲线的绘制，并最终得到相关系数、线性区间以及线性回归方程。以3倍信噪比为依据算出lod(检出限)，以10倍信噪比为依据算出loq(定量限)如表5所
示。
[0071]
表5 4种pfcs的线性回归方程、线性范围、lod及loq
[0072][0073]
对实施例1的方法进行方法回收率、日间及日内精密度的分析，具体包括：
[0074]
准确吸取100μg/ml的标准混合液添加至空白母乳中，分别配成浓度为0.5、5、50ng/ml 3个水平的样本待测，将配置好的待测样本分别经过96孔去磷脂板萃取，每种浓度的样品重复进行5次测定，进样后密封样品并将其储存于低温冰箱内，进样时间依次设定在第1、7、15、30、45天，得到日间及日内精密度。数据显示，低、中、高浓度pfcs的平均回收率在88.7％～110.1％，日内精密度为3.8％～8.9％，日间精密度为7.4％～10.8％，说明该方法具备良好的准确度和精密度。
[0075]
采用实施例1的方法对5份母乳样品进行检测，结果如表6所示，可见pfoa全部检出，pfos的检出率为80％，此2种pfcs检出率较高，pfna和pfda检出率分别为20％和0％，此两种pfcs检出率均较低。
[0076]
表6 5份母乳中4种pfcs的含量
[0077][0078]
通过上述实验结果可知，超高效液质联用法的精密度和重现性较易受到基质效应的影响，尤其对于母乳样品来说，磷脂类物质是干扰超高效液质联用法重现性、精密度的主因之一，去磷脂板前处理法能够使蛋白磷脂的影响被消除，一方面能够使测定法的重现性、精密度得到提高，另一方面还能够使测定法达到便捷、快速的效果。与c
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吸附剂固相萃取法相比，该方法所用的去磷脂板前处理法具有一定的优势，不仅减少了复杂繁琐的前处理过程，实现大规模样本的处理要求，减少前处理时间，极大的提高了回收率，并且由于该方法对母乳中的蛋白和磷脂成分有很好的消除效果，可以很好的降低背景噪音，显著提高信噪比，因此对于降低最低检出限和定量检出限有很好的帮助，为痕量pfcs的检测提供了更多的选择。
[0079]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。