一种不饱和铁结合力测定试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种不饱和铁结合力测定试剂盒及其应用。


背景技术：

2.铁是人体必须的微量元素，是合成红细胞中血红蛋白的主要原料。血清铁(fe)是与转铁蛋白(trf)结合的，每一分子trf可结合两个三价铁离子，但转铁蛋白分子中只有一部分被饱和，而另一部分未被饱和，称为不饱和铁结合力(uibc)，当血清转铁蛋白全部被饱和后，其结合铁的量就是总铁结合力，即血清铁与不饱和铁结合力的和为总铁结合力。血清铁的测定有利于对多种疾病的诊断，例如：溶血性贫血、再生障碍性贫血、巨幼红细胞性贫血、急性肝炎及铅中毒等会导致血清铁升高；而缺铁性贫血、慢性失血、月经过多、妊娠、感染性疾病、恶性肿瘤、肝硬化等则会导致血清铁降低。血清总铁结合力增高见于缺铁性贫血、急性肝炎等，降低见于肝硬化、肾病、尿毒症和血色素沉着症等；总铁结合力在缺铁性贫血，怀孕后期、口服避孕药与病毒性肝炎时会升高，在慢性感染、铁中毒、肾脏疾病、肾病变和地中海贫血时会下降。
3.目前，市场上的不饱和铁结合力测定试剂盒都是用的比色法，即在碱性条件下，先用过量的铁离子将血清中的转铁蛋白全部结合，然后剩余的铁离子再用还原剂将其还原成亚铁离子，并通过显色剂显色，比色测定得到不饱和铁结合力，例如，专利cn102323430a和cn104483494a，在试剂1中加入三价铁离子，并加入硫脲作为去干扰剂，去除铜离子的干扰。然而硫脲本身是具有还原性的，可以和试剂1中的三价铁离子发生氧化还原反应，导致三价铁离子被还原成亚铁离子，从而影响试剂的稳定性。专利cn104483494a中，在试剂1中加入了水溶性的碳酸盐或碳酸氢盐，这会与试剂中的铁离子发生双水解反应，试剂受热破坏容易生成沉淀而影响性能。
4.可见，由于不饱和铁结合力需在碱性条件下测定，而碱性缓冲液中，铁离子通常会生成氢氧化铁沉淀，或者水解产生氢氧化铁胶体，试剂在长期放置过程中，尤其是在热破坏过程中会逐渐析出明显的红棕色氢氧化铁胶体，从而影响试剂的稳定性，因此，解决碱性缓冲液中铁离子的稳定性问题至关重要。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒及其应用，稳定性好、准确度高、精密度好。
6.为达到上述技术目的，本技术采用以下技术方案：
7.第一方面，本技术提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒，包括试剂r1、试剂r2，其中试剂r1包括bicine缓冲液、铁盐、第一防腐剂，试剂r2包括kcl-hcl缓冲液、还原剂、显色剂、第二防腐剂。
8.优选的，bicine缓冲液的浓度为50mmol/l～150mmol/l。
9.优选的，bicine缓冲液的ph值为8.0-9.0。
10.优选的，铁盐的浓度为10μmol/l～20μmol/l。
11.优选的，铁盐包括硫酸铁、硫酸铁钾、硫酸铁铵、氯化铁中的一种或几种。
12.优选的，kcl-hcl缓冲液的浓度为150mmol/l～300mmol/l。
13.优选的，kcl-hcl缓冲液的ph值为1.5～2.5。
14.优选的，还原剂的浓度为50mmol/l～200mmol/l。
15.优选的，显色剂的浓度为1mmol/l～3mmol/l。
16.第二方面，本技术提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒在检测不饱和铁结合力中的应用，试剂r1、试剂r2与待测样品的体积比为10：2：1。
17.本技术的有益效果如下：
18.本方案中，试剂r1采用n,n-二羟乙基甘氨酸(binine)缓冲液，提高了r1的稳定性，而不需要额外的引入螯合剂，也不需要加入稳定剂就能保持试剂盒很好的稳定性；试剂r2采用kcl-hcl生物缓冲液，该缓冲液的缓冲能力不强，不会影响试剂r1和试剂r2混合之后的碱性环境，且kcl能维持体系的电解质平衡，即使不加稳定剂也能保持试剂很好的稳定性。
具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.如本领域技术人员所知，在有过量铁离子存在的碱性缓冲液中，样本中未与铁结合的转铁蛋白全部与铁离子结合，剩余的铁离子再被还原后与显色剂作用生成红色络合物，可通过计算缓冲液中铁离子的减少量就可以计算出样本中的不饱和铁结合力。
21.该实验原理决定了铁离子检测必须要存在于碱性缓冲液中，而在常规的碱性缓冲液中，铁离子不可避免是会发生水解或沉淀反应的，这就严重影响了检测结果的准确性，通常情况下，会选择在缓冲液中加入一定量能络合铁离子的螯合剂，但常规的螯合剂，如酒石酸盐、柠檬酸盐等，只有加入合适的量才能更好的发挥络合效果，络合剂加入太少，则铁离子还是会水解或沉淀，络合剂加入太多，则会使缓冲液的ph发生改变，不利于维持恒定的ph，而且可能会干扰铁离子的测定，往往螯合效果并不是特别理想。
22.基于以上，创立了本发明创造。
23.第一方面，本技术提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒，包括试剂r1、试剂r2，其中试剂r1包括bicine缓冲液、铁盐、第一防腐剂，试剂r2包括kcl-hcl缓冲液、还原剂、显色剂、第二防腐剂。
24.本技术的不饱和铁结合力测定试剂盒稳定性高的原因在于，试剂r1中bicine缓冲液是一种两性氨基酸缓冲液，同时具有氨基酸和氨基乙醇的性质，既可以作为稳定的生物缓冲液维持体系恒定的ph，又可以使铁离子形成稳定的甘氨酸类三价铁络合物，该络合物并不影响铁离子的测定，但却能使铁离子在碱性条件下很稳定的存在，即该缓冲液可以同时起到缓冲剂、螯合剂和稳定剂的作用，从而极大的提高了试剂的稳定性；试剂r2中采用一种生物缓冲液kcl-hcl缓冲液，该缓冲液的缓冲能力不强，不会影响试剂r1和试剂r2混合之后的碱性环境，对测值具有很好的改善作用，准确度好，而且kcl能维持体系的电解质平衡，
即使不加稳定剂也能保持试剂很好的稳定性。
25.bicine缓冲液的浓度为50mmol/l～150mmol/l，若浓度过低，则不足以将三价铁离子完全络合，而且试剂的稳定性不够好；若浓度太高，会增加试剂成本。
26.优选的，bicine缓冲液的ph值为8.0-9.0，当试剂ph低于8.0时，缓冲能力较弱，试剂的稳定性不够好。
27.要保证加到试剂中的铁离子过量，才能保证样本中的转铁蛋白全部被三价铁离子结合，才能有剩余的三价铁离子参与下一步的还原反应，但三价铁离子的浓度如果加的太多了，会造成试剂中bicine缓冲液的浓度也需要相应的增加，因此bicine缓冲液的浓度与三价铁盐的浓度要相对合适，本方案中，铁盐的浓度为10μmol/l～20μmol/l，铁盐包括硫酸铁、硫酸铁钾、硫酸铁铵、氯化铁中的一种或几种。
28.优选的，kcl-hcl缓冲液的浓度为150mmol/l～300mmol/l，该缓冲液在此范围内稳定性最好，另一方面，如果浓度太大了，造成试剂r1和试剂r2按比例混合后的ph达不到最佳，使得试剂的准确度性能有所下降。
29.kcl-hcl缓冲液的缓冲能力本身比较弱，当ph低于1.5时，缓冲能力太弱了，当ph高于2.5时，缓冲能力逐渐下降，造成试剂的稳定性不够好，kcl-hcl缓冲液的ph值为1.5～2.5。
30.优选的，还原剂的浓度为50mmol/l～200mmol/l，还原剂包括盐酸羟胺、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸中的一种或几种。
31.优选的，显色剂的浓度为1mmol/l～3mmol/l，显色剂为呋喃三嗪二钠盐(ferene)。
32.试剂r1中，第一防腐剂为浓度为0.1％～1.0％的叠氮化钠，试剂r2中，第二防腐剂的浓度为0.1％～1.0％，第二防腐剂包括苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾中的一种或几种。
33.本方案中，试剂r1的的制备过程为：配制50mmol/l～150mmol/l，ph为8.0～9.0的bicine缓冲液，向缓冲液中依次加入铁盐10μmol/l～20μmol/l，防腐剂0.1％-1.0％，定容后混匀，即得到试剂r1；
34.试剂r2的制备过程为：配制150mmol/l～300mmol/l，ph为1.5～2.5的kcl-hcl缓冲液，向缓冲液中依次加入还原剂50mmol/l～200mmol/l,显色剂1mmol/l～3mmol/l，防腐剂0.1％～1.0％，定容后混匀，即得到试剂r2。
35.本技术提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒在检测不饱和铁结合力中的应用，按照本领域技术人员常用的终点法使用本技术的不饱和铁结合力测定试剂盒检测样品中不饱和铁结合力，试剂r1、试剂r2与待测样品的体积比为10：2：1。
36.以下就具体的实施方式对本方案进行进一步说明。
37.实施例1
38.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，包括试剂r1、试剂r2，其中试剂r1包括bicine缓冲液、铁盐、第一防腐剂，bicine缓冲液的浓度为100mmol/l，ph值为8.0，铁盐为10μmol/l的硫酸铁，第一防腐剂为浓度为0.1％的叠氮化钠；试剂r2包括kcl-hcl缓冲液、还原剂、显色剂、第二防腐剂；kcl-hcl缓冲液的浓度为150mmol/l，ph值为1.5，还原剂为100mmol/l的抗坏血酸，显色剂的浓度为2mmol/l的呋喃三嗪二钠盐，第二防腐剂为0.1％的苯甲酸钠。
39.实施例2
40.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的浓度为50mmol/l。
41.实施例3
42.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的浓度为300mmol/l。
43.实施例4
44.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的ph值为9.0。
45.实施例5
46.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的ph值为2.5。
47.实施例6
48.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，硫酸铁的浓度为20μmol/l。
49.实施例7
50.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的ph值为8.5。
51.实施例8
52.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的浓度为150mmol/l。
53.实施例9
54.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的浓度为200mmol/l。
55.实施例10
56.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的ph值为2。
57.对比例1
58.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，将bicine缓冲液替换为tris缓冲液，并在试剂r1中增加50mmol/l硫脲。
59.对比例2
60.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，将kcl-hcl缓冲液替换为醋酸缓冲液，并在试剂r2中增加5mmol/l盐酸羟胺及10mmol/l硫代硫酸钠作为稳定剂。
61.对比例3
62.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，将bicine缓冲液替换为tris缓冲液，并在试剂r1中增加50mmol/l硫脲，将kcl-hcl缓冲液替换为醋酸缓冲液，并在试剂r2中增加5mmol/l盐酸羟胺及10mmol/l硫代硫酸钠作为稳定剂。
63.对比例4
64.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，将
bicine缓冲液替换为三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液。
65.对比例5
66.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，将kcl-hcl缓冲液替换为醋酸缓冲液。
67.对比例6
68.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的ph值为7.5。
69.对比例7
70.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，bicine缓冲液的浓度为30mmol/l。
71.对比例8
72.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的ph值为3。
73.对比例9
74.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，其他内容与实施例1相同，所不同的是，kcl-hcl缓冲液的浓度为400mmol/l。
75.评价测试
76.将实施例1-10及对比例6-9中的组分整理至表1，并结合对比例1-5中更改组分，得到不同的不饱和铁结合力测定试剂盒。
77.表1各试剂盒的组分情况
[0078][0079]
按照终点法，测定样本中不饱和铁结合力，操作参数如下：温度：37℃，主波长：
600nm，副波长：700nm，样本量：20μl，r1：200μl，r2：40μl，反应方向：正向，反应时间：10min，定标方式：两点定标；操作步骤为：将待测样本20μl与200μl试剂r1混匀，37℃孵育5分钟，空白管调零，600nm测定各管吸光度a1，再加入试剂40μl r2，混匀，37℃孵育5分钟测定各管吸光度a2。计算待测样本δa＝a2-a1，同理计算空白样本δa’，以及校准样本δa”，根据以上数值，对各试剂盒进行性能评价，试剂盒的评价标准如下：(1)空白吸光度：试剂在600nm波长处，试剂空白吸光度应≤0.8000；(2)准确度：检测质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，相对偏差应≤10％；(3)精密度：在重复性条件下，用试剂盒测试同一血清样本或控制物质，重复测试10次，比较变异系数(cv)，cv应≤6％；(4)分析灵敏度：试剂盒测试20.0μmol/l被测物时，吸光度差值(δa)应≥0.0200；(5)线性：在1.0μmol/l～100μmol/l范围内，线性相关系数r≥0.995。
[0080]
评价各试剂盒的热稳定性、开瓶稳定性，结果如表2和表3所示(其中表2为热稳定性性能评价和开瓶30天的性能评价。表3-1为实施例的开瓶过程中的偏差结果，表3-2为对比例的开瓶过程中的偏差结果)。评价方法如下，热稳定性：将试剂分别置于37℃恒温水箱中热破坏14天和42℃摇床上震荡5天后，评价试剂空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度和线性等方面的性能；开瓶稳定性：将试剂置于2℃～8℃开瓶，检测质控品，测值3次取平均值，每隔几天检测一次，并与第0天比较相对偏差。开瓶30天后，评价试剂空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度和线性等方面的性能。
[0081]
表2试剂盒性能测试结果
[0082]
[0083]
[0084][0085]
由表2可知，实施例1-10的试剂在37℃热破坏14天、42℃震荡5天以及开瓶30天后，与2-8℃储存未开瓶试剂相比，在空白吸光度和分析灵敏度方面的数值下降的都很少，在测试质控品的准确度、精密度、线性相关系数方面的数值变化都不大，说明bicine缓冲液浓度在50mmol/l～150mmol/l之间，ph在8～9之间，kcl-hcl缓冲液浓度在150mmol/l～300mmol/
l之间，ph在8～9之间，硫酸铁浓度在10μmol/l～20μmol/l之间无明显差异，稳定性都很好。
[0086]
对比例1-5与实施例相比，准确度不好，试剂在37℃热破坏14天、42℃震荡5天以及开瓶30天后的数据与2-8℃储存未开瓶试剂相比，在空白吸光度和分析灵敏度方面的数值下降的很明显，精密度和线性也变差了，因此稳定性较差。
[0087]
对比例6-9，相比对比例1-5来说，准确度有很明显的改善，但与实施例1-10相比，准确度和精密度都要稍微差一些，而且对比例6-9的试剂在37℃热破坏14天、42℃震荡5天以及开瓶30天后，与2-8℃储存未开瓶试剂相比，试剂空白吸光度、分析灵敏度和线性变差了，各方面性能总体上优于对比例1-5，但较实施例1-10的差，说明bicine缓冲液浓度在50mmol/l～150mmol/l之外，ph在8～9之外，kcl-hcl缓冲液浓度在150mmol/l～300mmol/l之外，ph在1.5～2.5之外，试剂的性能尤其是热稳定性和开瓶稳定性还不够好。
[0088]
表3-1各实施例试剂盒开瓶过程中的偏差结果
[0089][0090]
表3-2各对比例试剂盒开瓶过程中的偏差结果
[0091][0092]
从表3可以看出，对比例1-5的开瓶稳定性，基本上只能稳定14-18天，之后开瓶逐渐上升至超过10％，说明开瓶稳定性不好。对比例6-9，相对于对比例1-5，开瓶有明显的改善，但开瓶31天都超过了10％。实施例1-10，开瓶31天与第0天相比测值上升幅度仍控制在
8％以内，开瓶稳定性较对比例有很明显的优势，稳定性好。
[0093]
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。