AChE/AgNPs@PVA/RGO/SPE传感器及其制备与应用

ache/agnps@pva/rgo/spe传感器及其制备与应用
技术领域
1.本发明涉及甲基对硫磷检测技术领域，尤其是涉及ache/agnps@pva/rgo/spe传感器及其制备与应用。


背景技术：

2.有机磷(ops)因其高毒理学特性而被广泛用作杀虫剂。不幸的是，这种毒性并不局限于要消除的独特物种。由于其对乙酰胆碱酯酶(ache)的高毒性，它们对人类和动物的毒性特别大。事实上，杀虫剂对ache活性的抑制可能导致记忆丧失和神经肌肉功能受损，最终可能导致死亡。ache是大脑中的一种重要酶。它将神经递质乙酰胆碱(atc)水解为胆碱和乙酸。因此，ache活性可作为该农药暴露的生物标记物。
3.已经有检测ache抑制剂的技术，包括气相或液相色谱法和质谱法。然而，所报道的技术涉及精细和复杂的样品预处理过程。此外，大多数污染物都是特定于每种污染物的，通常需要较长时间的分析。还设计了基于ache活性的各种生物传感技术和不同的转导技术(电化学、荧光、比色探针等)，为环境、农业、食品或军事应用中的毒性监测提供快速、简单和选择性技术。在这项开创性工作之，许多基于ache活性的各种检测方法已经研究出来。然而，这些技术存在一些缺点，由于单一的检测方法，使得检测过程中缺乏了检测结果的可靠性与准确性，同时制备复杂、耗时，稳定性差，这限制了它们的应用。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明的目的是提供ache/agnps@pva/rgo/spe传感器及其制备与应用。本发明基于甲基对硫磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，制备了一种用于甲基对硫磷检测的传感器。该传感器对酶促硫代胆碱的氧化具有良好的电催化能力，而且对甲基对硫磷表现出优异的吸附能力和较高的表面增强拉曼散射(sers)活性；甲基对硫磷对ache的抑制作用与其浓度成正比。将该传感器用于电化学检测和拉曼光谱检测甲基对硫磷，得到甲基对硫磷浓度分别与电流信号强度和拉曼信号强度之间的线性关系。与现有现场快速检测方法比较，本发明具有良好的稳定性、有较多的sers活性热点、高灵敏度和易于携带，为有机磷农药的检测提供了新方法。
5.本发明中，ache/agnps@pva/rgo/spe传感器也即乙酰胆碱酯酶/银粒子@聚乙烯醇微球/石墨烯修饰丝网印刷电极传感器。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.本发明的第一个目的是提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的制备方法，包括下述步骤：
8.(1)rgo/spe电极的制备：将spe电极置于go电沉积液中，经循环伏安法还原得到rgo/spe电极；
9.(2)agnps@pva复合材料的制备：通过微流控制备得到pva微凝胶球，然后将硝酸银在pva微凝胶球上通过柠檬酸钠原位还原为agnps胶体溶液，后处理得到agnps@pva复合材
料；
10.(3)agnps@pva/rgo/spe复合工作电极的制备：将步骤(2)制备得到的agnps@pva复合材料滴加至步骤(1)制备得到的rgo/spe电极表面，干燥得到agnps@pva/rgo/spe复合工作电极；
11.(4)ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的制备：在步骤(3)制备得到的agnps@pva/rgo/spe复合工作电极表面滴加ache溶液，干燥得到ache/agnps@pva/rgo/spe传感器。
12.在本发明的一个实施方式中，go电沉积液的具体制备为：将氧化石墨烯粉末与磷酸盐缓冲溶液混匀后孵育以活化氧化石墨烯上的羧基基团，离心后用tris-hcl分散，得到go电沉积液。
13.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，循环伏安法过程中，电位范围为-1.4～ 0.6v，扫描速度为50mv/s。
14.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，pva微凝胶球的具体制备方法如下：
15.(2.1)将pva与过硫酸钾溶液、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠混匀制备得到得水相；
16.(2.2)将二氯甲烷和乙酸正丁酯混匀得到含有temed的连续油相；
17.(2.3)微流控体系下使用注射泵将步骤(1)得到的水相和步骤(2)得到的油相按体积流量分别注入垂直通道，形成pva微凝胶。
18.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，pva微凝胶球、硝酸银和柠檬酸钠的用量比为0.1g：2μmol：200μmol。
19.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，后处理为利用去离子水进行洗涤、离心。
20.在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，干燥过程中，干燥温度为15-40℃，干燥时间为2-4h。
21.在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，干燥过程中，干燥温度为4℃，干燥时间为2-4h。
22.本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器。
23.本发明的第三个目的是提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器利用电化学检测农药中甲基对硫磷的方法，包括以下步骤：
24.(1)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入含有乙酰硫代氯化胆碱(atcl)的碱性溶液中，利用循环伏安法测定初始响应电流信号强度；
25.(2)配制不同浓度甲基对硫磷标准溶液作为实验组，以含有atcl的碱性溶液作为对照组，将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入上述对照组及实验组中，利用循环伏安法测定响应电流信号强度以获得响应电流信号强度变化值；
26.(3)以甲基对硫磷标准溶液浓度为横坐标，以响应电流信号强度变化值为纵坐标，绘制标准曲线；
27.(4)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入农药中，利用循环伏安法测定响应电流信号强度以获得响应电流信号强度变化值，代入步骤(3)得到的标准曲线中，得到农药中甲基对硫磷的浓度。
28.本发明的第四个目的是提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器利用便携式拉曼光谱仪检测农药中甲基对硫磷的方法，包括以下步骤：
29.(1)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入含有atcl的碱性溶液中，避光反应后采用便携式拉曼光谱仪测量初始拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号；
30.(2)配制不同浓度甲基对硫磷标准溶液作为实验组，以含有atcl的碱性溶液作为对照组，将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入上述对照组及实验组中，避光反应后采用便携式拉曼光谱仪测量拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号以获得光谱信号变化值；
31.(3)以甲基对硫磷标准溶液浓度为横坐标，以光谱信号变化值为纵坐标，绘制标准曲线；
32.(4)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入农药中，采用便携式拉曼光谱仪测量拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号以获得光谱信号变化值，代入步骤(3)得到的标准曲线中，得到农药中甲基对硫磷的浓度。
33.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
34.(1)本发明成功构建了一种基于agnps@pva/rgo纳米复合材料的用于甲基对硫磷检测的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器，该传感器结合了电化学和sers双模策略对水体中痕量甲基对硫磷农药进行可靠、循环、高灵敏度检测；
35.(2)ache/agnps@pva/rgo/spe传感器中的agnps@pva具有优良导电性、大表面积和较高的粘度，能够将ache固定在agnps@pva/rgo/spe复合工作电极上。同时agnps@pva微凝胶具有优异的sers活性，还能通过吸水膨胀，吸附富集水中痕量分析物，使得制备的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器具有良好的稳定性、电化学-sers高灵敏度和易于携带。
36.(3)ache/agnps@pva/rgo/spe传感器中的agnps@pva/rgo提高了电子转移速率，扩大了比表面积，对atcl具有良好的电催化活性。
37.(4)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器中的浸入含有atcl溶液中，在ache的催化下，atcl水解产生更多的硫代胆碱，导致电流信号强度增加；当添加甲基对硫磷时，甲基对硫磷对ache活性的抑制，降低了ache对atcl的催化作用，从而减少了电活性物质的产生，电流信号强度再次下降。
38.(5)该ache/agnps@pva/rgo/spe传感器能够对水中的甲基对硫磷进行电化学测定和sers痕量检测，具有良好的灵敏度、可接受的稳定性和重复性；可实现对水体中甲基对硫磷的现场快速定量检测和降解，甲基对硫磷的电化学检测限为3ng
·
l-1
，sers检测限为5ng
·
l-1
。该传感器有望成为现场检测高性能有机磷农药的一种新的有效方法。
附图说明
39.图1是本发明实施例1制备得到的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的实物图和局部放大图；
40.图2是传感器在乙酰硫代氯化胆碱溶液、乙酰硫代氯化胆碱溶液 甲基对硫磷溶液中孵育后的电化学信号强度图；
41.图3是传感器在乙酰硫代氯化胆碱溶液与不同浓度的的甲基对硫磷的混合溶液孵育后的电化学信号强度变化图；
42.图4是传感器在乙酰硫代氯化胆碱溶液、乙酰硫代氯化胆碱溶液 甲基对硫磷溶液中孵育后的sers光谱图；
43.图5是传感器在乙酰硫代氯化胆碱溶液与不同浓度的的甲基对硫磷的混合溶液孵
育后的sers光谱图。
具体实施方式
44.本发明提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的制备方法，包括下述步骤：
45.(1)rgo/spe电极的制备：将spe电极置于go电沉积液中，经循环伏安法还原得到rgo/spe电极；
46.(2)agnps@pva复合材料的制备：通过微流控制备得到pva微凝胶球，然后将硝酸银在pva微凝胶球上通过柠檬酸钠原位还原为agnps胶体溶液，后处理得到agnps@pva复合材料；
47.(3)agnps@pva/rgo/spe复合工作电极的制备：将步骤(2)制备得到的agnps@pva复合材料滴加至步骤(1)制备得到的rgo/spe电极表面，干燥得到agnps@pva/rgo/spe复合工作电极；
48.(4)ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的制备：在步骤(3)制备得到的agnps@pva/rgo/spe复合工作电极表面滴加ache溶液，干燥得到ache/agnps@pva/rgo/spe传感器。
49.在本发明的一个实施方式中，go电沉积液的具体制备为：将氧化石墨烯粉末与磷酸盐缓冲溶液混匀后孵育以活化氧化石墨烯上的羧基基团，离心后用tris-hcl分散，得到go电沉积液。
50.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，循环伏安法过程中，电位范围为-1.4～ 0.6v，扫描速度为50mv/s。
51.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，pva微凝胶球的具体制备方法如下：
52.(2.1)将pva与过硫酸钾溶液、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠混匀制备得到得水相；
53.(2.2)将二氯甲烷和乙酸正丁酯混匀得到含有temed的连续油相；
54.(2.3)微流控体系下使用注射泵将步骤(1)得到的水相和步骤(2)得到的油相按体积流量分别注入垂直通道，形成pva微凝胶。
55.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，pva微凝胶球、硝酸银和柠檬酸钠的用量比为0.1g：2μmol：200μmol。
56.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，后处理为利用去离子水进行洗涤、离心。
57.在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，干燥过程中，干燥温度为15-40℃，干燥时间为2-4h。
58.在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，干燥过程中，干燥温度为4℃，干燥时间为2-4h。
59.本发明提供一种通过上述方法制备得到的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器。
60.本发明提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器利用电化学检测农药中甲基对硫磷的方法，包括以下步骤：
61.(1)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入含有atcl的碱性溶液中，利用循环伏安法测定初始响应电流信号强度；
62.(2)配制不同浓度甲基对硫磷标准溶液作为实验组，以含有atcl的碱性溶液作为对照组，将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入上述对照组及实验组中，利用循环伏安法测定响应电流信号强度以获得响应电流信号强度变化值；
63.(3)以甲基对硫磷标准溶液浓度为横坐标，以响应电流信号强度变化值为纵坐标，绘制标准曲线；
64.(4)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入农药中，利用循环伏安法测定响应电流信号强度以获得响应电流信号强度变化值，代入步骤(3)得到的标准曲线中，得到农药中甲基对硫磷的浓度。
65.本发明提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器利用便携式拉曼光谱仪检测农药中甲基对硫磷的方法，包括以下步骤：
66.(1)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入含有atcl的碱性溶液中，避光反应后采用便携式拉曼光谱仪测量初始拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号；
67.(2)配制不同浓度甲基对硫磷标准溶液作为实验组，以含有atcl的碱性溶液作为对照组，将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入上述对照组及实验组中，避光反应后采用便携式拉曼光谱仪测量拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号以获得光谱信号变化值；
68.(3)以甲基对硫磷标准溶液浓度为横坐标，以光谱信号变化值为纵坐标，绘制标准曲线；
69.(4)将ache/agnps@pva/rgo/spe传感器浸入农药中，采用便携式拉曼光谱仪测量拉曼光谱峰639cm-1
光谱信号以获得光谱信号变化值，代入步骤(3)得到的标准曲线中，得到农药中甲基对硫磷的浓度。
70.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
71.下述实施例中，如无特殊说明，所用试剂均为市售试剂；所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
72.实施例1
73.本实施提供一种ache/agnps@pva/rgo/spe传感器及其制备方法。
74.(1)rgo/spe电极的制备：在5mg氧化石墨烯(go)粉末中加入500μl ph 7.4磷酸盐缓冲溶液(包含0.15m edc和0.1m nhs)，孵育30min活化go上的羧基基团；然后用加入tris-hcl溶液，离心清洗三次(8000rpm，15min)后，在得到的沉积物中加入5ml tris-hcl，超声分散形成均匀的黑色悬浮液-go电沉积液；
75.将预处理好的spe电极浸入go电沉积溶液中，在-1.4～ 0.6v电位范围内运用循环伏安法处理20min(扫描速度：50mv/s)，此时go被电化学还原为rgo，得到rgo/spe电极；然后将其用超纯水冲洗并氮气吹干后，将传感器存储在4℃冰箱内备用。
76.(2)agnps@pva复合材料的制备：将10g pva置于干净的烧杯中，取0.16g的过硫酸钾，加3.5g的去离子水进行溶解，再倒入装有pva的烧杯当中，加入3g的2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠，搅拌20min，制得水相；二氯甲烷和乙酸正丁酯成比例配制含有temed的连续油相；使用注射泵将水相和油相按体积流量分别注入微流控芯片的交叉连接通道，形成pva微凝胶；将收集到的pva微凝胶球置于水浴锅中孵育，然后用乙酸乙酯/丙酮洗涤，在生理盐水中保存备用；
77.将40ml甘油和60ml去离子水在剧烈搅拌下回流直至沸腾，然后加入0.1gpva微凝胶和2ml 0.005m的agno3溶液，搅拌5min；等待pva微凝胶与agno3溶液充分接触后，再在剧烈搅拌下注入4ml 0.05m的柠檬酸钠溶液，回流60min，得到黄绿色agnps胶体溶液；将获得的agnps胶体溶液用去离子水进行洗涤、离心，得到黄绿色agnps@pva复合材料，在4℃冰箱中
保存备用。
78.(3)agnps@pva/rgo/spe复合工作电极的制备：向步骤(1)制备得到的go/spe电极表面滴加10μl的agnps@pva复合材料，并在室温下自然干燥2h，然后得到agnps@pva/rgo/spe复合工作电极。
79.(4)ache/agnps@pva/rgo/spe传感器的制备：向步骤(3)制备得到的agnps@pva/rgo/spe复合工作电极表面滴加5μl 0.02u ache，并在4℃干燥环境中静置干燥2h，得到ache/pva@ag/rgo/spe传感器，如图1所示。
80.实施例2
81.将制备的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器先浸入含有1.0matcl的碱性溶液(ph 7.5)中，并进行循环伏安法测定(电位扫描范围为0.6至0.2v；扫描速度为50mv/s；静态时间为2s)，获得初始响应电流信号强度，结果如图2所示。
82.配制不同浓度(分别为0.01、0.1、1、10、100μg
·
l-1)的甲基对硫磷标准溶液作为实验组，将传感器插入1.0m atcl的碱性溶液(对照组)和一系列浓度梯度的甲基对硫磷标准溶液的混合物中；反应12min后，用pbs缓冲液(ph 7.5)冲洗1min；最后，再次进行微分脉冲伏安法(dpv)测量以获得响应电流信号强度变化。参考图3a，显示了在优化条件下与不同浓度的甲基对硫磷孵育后，ache/agnps@pva/rgo/spe传感器在含1.0mm atcl的pbs溶液中的dpv效应。由于甲基对硫磷对ache的抑制作用，峰电流信号强度随着甲基对硫磷浓度的增加而急剧降低。图3b是对应的抑制率与甲基对硫磷浓度的关系，分析后的线性方程为y＝3.61x 16.89，r2＝0.99216，甲基对硫磷的检测限为3ng
·
l-1
。
83.对于sers测试，将制备的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器先浸入含有1.0matcl的碱性溶液(ph 7.5)的试管中，然后将试管避光并放入恒温水浴中反应10min；最后，移动传感器测量sers光谱。使用785nm的激光发生器作为入射检测光源，激光功率100％，激发时间5s；结果如图4所示。
84.配制不同浓度(分别为0.01、0.1、1、10、100μg
·
l-1)的甲基对硫磷标准溶液作为实验组，将传感器插入1.0m atcl的碱性溶液(对照组)和一系列浓度梯度的甲基对硫磷标准溶液的混合物中；反应12min后，用pbs缓冲液(ph 7.5)冲洗1min；最后，采用便携式拉曼光谱仪检测其光谱信号。采用拉曼光谱峰639cm-1
强度变化作为判定甲基对硫磷存在的特征峰。参考图5a，显示了在优化条件下与1.0mm atcl和不同浓度的甲基对硫磷孵育后，ache/agnps@pva/rgo/spe的拉曼光谱变化。由于甲基对硫磷对ache的抑制作用，特征拉曼峰信号强度随着甲基对硫磷浓度的增加而急剧降低。图5b是对应的拉曼强度变化与甲基对硫磷浓度的关系，分析后的线性方程为y＝-2.79x 5.69，r2＝0.97709，甲基对硫磷的检测限为5ng
·
l-1
。
85.实施例3
86.利用实施例1制备得到的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器检测水体中甲基对硫磷
87.(1)电化学检测甲基对硫磷；
88.将制备的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器先浸入含有1.0matcl的碱性溶液(ph 7.5)中，并进行循环伏安法测定(电位扫描范围为0.6至0.2v；扫描速度为50mv/s；静态时间为2s)，获得初始响应电流信号强度。
89.实验室所用的样本水取自学校的湖水，取2ml湖水与1.0m 2ml atcl混合；再将传
感器插入混合液中，反应12min后，用pbs缓冲液(ph 7.5)冲洗1min；最后，再进行dpv测量以获得响应电流信号强度，与甲基对硫磷的标准曲线对照，从而实现湖水中甲基对硫磷的检测。
90.(2)sers检测甲基对硫磷；
91.将制备的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器先浸入含有1.0matcl的碱性溶液(ph 7.5)中，然后将试管避光并放入恒温水浴中反应10min；最后，移动传感器测量sers光谱，使用785nm的激光发生器作为入射检测光源，激光功率100％，激发时间5s。
92.实验室所用的样本水取自学校的湖水，取2ml湖水与1.0m 2ml atcl混合。再将传感器插入混合液中，反应12min后，用pbs缓冲液(ph 7.5)冲洗1min；最后，采用便携式拉曼光谱仪检测其光谱信号，与甲基对硫磷的标准曲线对照，从而实现湖水中甲基对硫磷的检测。
93.甲基对硫磷的常用分析检测方法是液相色谱串联质谱法(gb/t229752008)，所用湖水同时采用液相色谱串联质谱法进行分析检测，检测结果如表1所示。从表1可见，将实施例1制备得到的ache/agnps@pva/rgo/spe传感器应用于检测水体中甲基对硫磷(电化学检测和sers检测)的检测准确度较好，也可以将两种方法可连用(电化学检测 sers检测)实现水体中甲基对硫磷检测；有望作为一种快速检测方法用于水体中甲基对硫磷的快速分析检测。
94.表1电化学和sers检测方法与高效液相色谱法的检测结果对比
[0095][0096]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。