含有Zn-N-C活性中心的纳米材料在去除细菌生物膜中的应用

含有zn-n-c活性中心的纳米材料在去除细菌生物膜中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及含有zn-n-c活性中心的纳米材料在去除细菌生物膜中的应用。


背景技术：

2.细菌生物膜是由一种或多种微生物自发形成的复杂被膜结构，由细胞外多糖、蛋白质、dna等生物分子及多种微生物群落构成，形成肉眼可见的粘膜状物质。生物膜的形成有四个阶段：
①
游离细菌的定植阶段，少量微生物附着在生物或非生物表面；
②
菌群的不可逆粘附阶段，细菌在物体表面开始大量增殖，合成及分泌多糖、蛋白质和dna等，形成一定的空间结构；
③
生物膜的成熟阶段，此时足够数量的细菌间开始建立群体感应(quorum sensing,qs)通讯，通过外泌信号分子(autoinducers,ais)，调控生物膜形成具有结构异质性的稳定空间结构，大量产生细胞外基质成分，共同进化抵御外界环境刺激；
④
生物膜的扩散阶段，随着生物膜的成熟，游离的细菌被分离释放出来，在新的表面上附着，形成完整的生物膜循环。在此过程中，菌群通讯调控的生物膜成熟过程是影响生物膜形成的关键阶段。
3.已有研究表明，形成生物膜结构的微生物其环境适应性强，耐受性好，抗剪切力强，对抗生素的耐受可提高至10倍-1000倍，已成为困扰食品工业、海运业及公共健康等领域的持久性顽疾。例如，全球每年因海运船体上的生物污染所产生的额外经济消耗超过287亿英镑，其中超过100亿英镑用于生物附着船体产生的额外能源消耗。此外，据美国国立卫生研究院(nih)统计，80％因细菌感染引发的疾病均与生物膜结构的形成有关，例如心内膜炎、囊性纤维化、牙周炎、鼻窦炎、骨髓炎、脑膜炎、肾脏感染、移植物引发的感染等。美国疾病控制中心(cdc)在2020年的数据显示，每年因水源及运输管线中细菌生物膜的形成而造成的疾病案例超过700万例，其中6000例因感染而死亡，造成直接的经济开销超过30亿美元。如何防治细菌生物膜的形成，是公共健康、生命科学等领域的科学难题。目前防治生物膜的策略可分为物理法、化学法和生物法三大类。
4.物理法：利用机械剪切、超声、紫外及磁场等物理方式，去除物体表面生物膜。例如，在距离链球菌生物膜表面2mm的位置，利用超声产生的气穴，可以在2s内完全分解生物膜结构；li等人在旋转磁场中引入磁性纳米颗粒，通过纳米粒在磁场中旋转产生的机械应力破坏金黄色葡萄球菌产生的生物膜结构，可使菌群数量下降5个数量级。然而，物理方法虽然在短时间内去除效率高，但难以对微生物彻底清除，少量残留的微生物仍然有再次形成生物膜的潜力。
5.化学法：利用抗菌剂(抗生素、抗菌肽、金属离子等)直接杀伤微生物，以实现生物膜结构的去除。近年来，从人体宿主防御系统、牛中性粒细胞、昆虫及天然代谢产物中发现了多种天然的抗菌多肽如ll-37，cecropins等。这些多肽也被广泛报道同样具有抗生物膜形成的特性。此外，以金属银、钯、铜等进行表面修饰，通过金属离子的缓慢释放，也有良好的抗生物膜效果。vaidya等人发现，通过铂、钯和金三种金属离子联用可以显著抑制粪肠球菌，克雷伯肺炎链球菌和鲍氏不动杆菌生物膜的形成。然而，抗菌剂的大量实施会加速耐药
性的广泛传播。
6.生物法：基于天然蛋白酶降解生物膜中重要的骨架结构，实现对生物膜的去除。例如，在噬菌体中发现的裂解酶lysgh15，可以水解革兰氏阳性菌的肽聚糖结构，不但对金黄色葡萄球菌、表皮链球菌和溶血性链球菌有显著的杀伤效果，同样也可以去除这些菌株的生物膜结构。dominguez等人发现，将甘露糖苷酶、葡聚糖酶和水解酶联用，可以有效降解生物膜细胞外基质，实现生物膜的高效去除。此外，针对生物膜骨架结构中另一类重要基质——细胞外dna(edna)，通过引入dna水解酶可以去除由大肠杆菌、枯草芽孢杆菌形成的生物膜结构。然而，蛋白酶的环境稳定性差，易降解失活，应用场景受限。
7.综上所述，目前生物膜的去除主要是针对已经形成的生物膜，从外部破坏其骨架结构进而进行去除的方法。该类方法普遍存在效率低、防控性差、无法彻底根除、易产生耐药性等缺点。因此，亟需一种从内部瓦解生物膜形成过程的新方法。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明提出了含有zn-n-c活性中心的纳米材料在去除细菌生物膜中的应用。本发明含有zn-n-c活性中心的纳米材料可以模拟天然内酯酶的活性，特异性的催化降解ahl类信号分子，阻断菌群通讯，抑制细菌生物膜的形成。该含有zn-n-c活性中心的纳米材料可用于环境中的生物膜防治，可长时间防止生物膜的形成，减轻生物膜带来的危害。
9.本发明的技术方案如下：
10.本发明的第一个目的在于提供含有zn-n-c活性中心的纳米材料在去除细菌生物膜中的应用。
11.在本发明的一个实施例中，所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料为介孔球形或二维片层结构；所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料的尺寸为50nm-800nm；所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料的表面电荷为-25ev到 25ev。
12.在本发明的一个实施例中，所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料通过以下方法制备得到：将金属有机框架化合物在惰性氛围中煅烧后，得到所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料。
13.在本发明的一个实施例中，所述惰性氛围中的气体选自氮气和/或氩气。
14.在本发明的一个实施例中，所述金属有机框架化合物选自zif-8、mil-101和pcn-222中的一种或多种。
15.在本发明的一个实施例中，所述煅烧的温度为600℃-1000℃；所述煅烧时间为1h-24h。
16.在本发明的一个实施例中，所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料具有类酯酶活性，可以催化酯类化合物的水解反应。
17.在本发明的一个实施例中，所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料的浓度为50μg/ml-1000μg/ml。
18.在本发明的一个实施例中，所述细菌为革兰氏阴性菌。
19.在本发明的一个实施例中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、哈氏弧菌、费氏弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、根瘤土壤杆菌、恶臭假单胞菌和沙雷氏菌中的一种或多种。
20.本发明的第二个目的在于提供了一种去除细菌生物膜的制剂，包括所述含有zn-n-c活性中心的纳米材料。
21.本发明的机理如下：
22.本发明基于菌群通讯是细菌生物膜形成的核心关键步骤这一原理，仿生天然蛋白酶(内酯酶，降解通讯信号分子)的zn原子活性中心，设计合成zn-n-c活性位点的纳米类酶。该材料可模拟天然内酯酶的活性，首先，水分子被zn-n活性位点吸附活化；随后，被活化的水分子去质子化形成氢氧根，进攻酯键上的羰基，导致电子转移，酯键断裂；最后被水解的产物从zn-n活性位点脱附下来。该反应可以特异性的催化降解ahl类信号分子，阻断菌群通讯，从而抑制细菌生物膜的形成。
23.本发明的技术方案具有以下优点：
24.(1)本发明显著区别于传统的以杀死微生物为主要目的的生物膜防治策略，不以抵抗力强、易产生耐药性的微生物细胞为靶点，转而针对生物膜形成过程的关键步骤-菌群通讯。通过含有zn-n-c活性中心的纳米材料的内酯酶作用，特异性的降解ahl信号分子，从根本上阻断生物膜的形成过程。
25.(2)本发明与抗生素类等杀菌药物不同，因不与细菌直接相互作用，不会引发细菌耐药性的产生。
26.(3)本发明可用于环境中的生物膜防治，将纳米涂层涂敷在如船舶、医疗器械等固体表面，可长时间防止生物膜的形成，减轻生物膜带来的危害。
附图说明
27.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
28.图1为本发明中含有zn-n-c活性中心的纳米材料的催化过程机理图；
29.图2为本发明实施例1中lc-ms法检测ahl信号分子的水解产物图；
30.图3为本发明实施例2中zn-n-c系列材料的催化活性图；其中图3-a为类酯酶在zn-n-c系列材料催化后的相对转化率图；图3-b为含有zn-n-c活性中心的纳米材料、zif-8与介孔碳材料cnps的催化活性图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料；
31.图4为本发明实施例3中zn-n-c纳米材料的类酶动力学图；其中图4-a为米氏方程图；图4-b为双倒数图；
32.图5为本发明实施例4中含有zn-n-c活性中心的纳米材料的环境稳定性图；其中5-a为含有zn-n-c活性中心的纳米材料在不同温度下的催化活性图；图5-b为含有zn-n-c活性中心的纳米材料在不同浓度乙醇溶剂下的催化活性图；图5-c为含有zn-n-c活性中心的纳米材料在不同离子强度下的催化活性图；图5-d为含有zn-n-c活性中心的纳米材料在不同ph值下的催化活性图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料；
33.图6为本发明实施例5中含有zn-n-c活性中心的纳米材料的底物选择性图；
34.图7为本发明实施例6中pao1生物膜的去除效果评价图；其中图7-a为含有zn-n-c活性中心的纳米材料对ahl信号分子的降解效果图；图7-b为影响生物膜形成的关键通路中的标志基因；图7-c为lasi，lasr，pqsh三种基因的相对表达量图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料；
35.图8为本发明实施例7中含有zn-n-c活性中心的纳米材料对铜绿假单胞菌生物膜的清除能力图；其中图8-a为铜绿假单胞菌生物膜的电子显微镜成像和荧光活死染色共聚焦显微镜成像；图8-b为野生型和处理后的铜绿假单胞菌生物膜pao1的形成对比图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料；
36.图9为本发明实施例8中含有zn-n-c活性中心的纳米材料降解生物膜的广谱性图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料；
37.图10为本发明实施例9中含有zn-n-c活性中心的纳米材料涂覆抑制环境细菌生物膜的形成图；其中图10-a为两组金属片表面的生物量分析表征图；图10-b为两组金属片表面的生物膜的相对荧光强度图；其中图中的zn-n-c纳米材料为zn-n-c-2纳米材料。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
39.实施例1 lc-ms法检测ahl的水解产物
40.以铜绿假单胞菌pao1的信号分子3-oxo-c12-hsl作为底物分子(100um)，将zn-n-c纳米材料(200μg/ml)添加到0.5ml底物分子溶液中，于37℃、200rpm的条件下孵育2h，然后以8000rpm的转速离心5h，取上清经3000da超滤膜过滤，得到ahl的水解产物。
41.利用lc-ms法检测ahl的水解产物，以蛋白内酯酶(200μg/ml)为阳性对照。在lc-ms检测前检测样品用0.22μm超滤膜过滤(金标公司，中国苏州)。检测仪器为安捷伦1100系列lc系统(agilent technologies,santa clara,ca,usa)和质谱仪(ltqxl,thermo fisher scientific,usa)
42.色谱柱：c18反相柱(150mm
×
2.1mm，5μm)，进样量5μl；流动相a-0.1％甲酸水溶液，b-乙腈，梯度洗脱：1min，80％a；2min-15min，40％a。在正电离模式下获得全扫描ms检测，以收集100m/z-500m/z数据。详细的ms参数设置如下：3.5kv电源电压；4μa源电流；25arb鞘气流量；8arb辅助气体流量；350℃毛细管温度；120v管透镜电压和1.5m/z隔离宽度。使用xcalibur软件分析ms数据。
43.通过lc-ms法检测ahl信号分子的水解产物结果如图2所示，从图2可以看出zn-n-c纳米材料具有类天然内酯酶活性，可以将分子量为298( h)或320( na)的底物分子水解生成分子量为316( h)或338( na)的水解产物(分子量加一个水分子，18da)。
44.实施例2含有zn-n-c活性中心的纳米材料的制备
45.将2-甲基咪唑(5.5g)和zn(no3)2·
6h2o(4.76g)分别溶解在300ml和200ml甲醇中。然后，将这两种溶液在室温下混合并以100rpm的速度搅拌2h制备zif-8前体化合物。通过7500rpm离心10min收集zif-8的白色沉淀，并用甲醇洗涤三次后，使用60℃的烘箱干燥，得到zif-8前体化合物。
46.在氮气气氛下，以5℃/min的加热程序，分别在不同温度(600℃、700℃、800℃、900℃和1000℃)下热解zif-8前体化合物2h，获得一系列含有zn-n-c活性中心的纳米材料，分别命名为zn-n-c-1、zn-n-c-2、zn-n-c-3、zn-n-c-4和zn-n-c-5。
47.以3-oxo-c12-hsl为底物分子，将材料按照200μg/ml的浓度在37℃条件下孵育2h后，通过lc-ms法定量水解的ahl分子的量，从而评价这一系列材料的催化活性差异，并用合
58.lasi基因的核苷酸序列为seq id no.2的反向引物：
[0059]5’‑
atctgggtcttggcattgagttcg-3’[0060]
lasr基因的核苷酸序列为seq id no.3的正向引物：
[0061]5’‑
gctggaacgctcaagtggaaaattg-3’[0062]
lasr基因的核苷酸序列为seq id no.4的反向引物：
[0063]5’‑
ttctcgtagtcctggctgtccttag-3’[0064]
pqsh基因的核苷酸序列为seq id no.5的正向引物：
[0065]5’‑
aacgagggtattcctcagccagac-3’[0066]
pqsh基因的核苷酸序列为seq id no.6的反向引物：
[0067]5’‑
cggatcgagttcatcaggaagcaatc-3’[0068]
实施例7含有zn-n-c活性中心的纳米材料对铜绿假单胞菌生物膜的清除能力
[0069]
在24孔板中底部放入圆形盖玻片，接种5
×
107cfu/ml的铜绿假单胞菌pao1，加入200μg/ml的zn-n-c-2纳米材料，2ml培养基，37℃静置培养48h后，将圆形盖玻片小心取出，通过扫描电子显微镜成像，荧光活死染色共聚焦显微镜成像及结晶紫染色法，评价生物膜形成的情况。如图8所示，zn-n-c-2纳米材料处理组显著减少了生物膜的致密度、厚度及生物量，证明含有zn-n-c活性中心的纳米材料具有清除细菌生物膜的能力。
[0070]
实施例8 zn-n-c纳米材料对生物膜去除的广谱性
[0071]
以大肠杆菌、费氏弧菌、哈氏弧菌、鼠伤寒沙门氏菌为模式菌株，考察含有zn-n-c活性中心的纳米材料对生物膜去除的广谱性，通过结晶紫染色法对生物膜进行定量。具体为将铜绿假单胞菌pao1、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌在37℃和200rpm的lb培养基中培养过夜。费氏弧菌、哈氏弧菌在30℃和200rpm的ab培养基中增殖12h。将od为0.5的细菌细胞(20μl)与200μg/ml的zn-n-c-2纳米材料在2ml培养基中孵育24h。随后，分别在8000rpm离心后收集上清液和细菌细胞，通过结晶紫染色法对生物膜进行定量。测试结果图9所示，含有zn-n-c活性中心的纳米材料可以显著的降低多种革兰氏阴性菌生物膜的形成，证明材料的生物膜去除能力具有普适性。
[0072]
实施例9含有zn-n-c活性中心的纳米材料在防治船舶表面生物膜形成中的应用
[0073]
将zn-n-c-2纳米材料以1.59mg/cm2的密度涂覆在金属片表面，模拟船体表面的纳米涂层结构。将未经过纳米涂覆的金属片和涂有zn-n-c-2纳米材料的金属片分别浸没于苏州河水域中，30天后回收，通过ivis技术对两组金属片表面的生物量进行分析表征，具体结果如图10所示。通过图10可以看出未经过纳米涂覆的金属片表面形成了大量黄色的致密的生物膜结构，而经由zn-n-c-2纳米材料涂覆的金属片表面则相对干净。利用微生物分泌的多糖物质普遍具有自发荧光的特点，通过荧光成像可以显著看到，含有zn-n-c活性中心的纳米材料涂覆的金属表面几乎没有生物膜形成。由此可以证明含有zn-n-c活性中心的纳米材料涂覆可以长效(30天)抑制真实环境中细菌生物膜的形成。
[0074]
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。