一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法与流程

1.本发明涉及一种药物分析技术领域，尤其涉及一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法。


背景技术：

2.奥拉帕利（olaparib）是英国阿斯利康公司和德国艾伯维公司合作生产一种口服多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（parp）抑制剂，利用肿瘤dna损伤反应（ddr）途径的缺陷，优先杀死癌细胞。该药于2014年12月在美国获fda批准，用于治疗既往接受过两次以上治疗且携带种系brca突变的晚期卵巢癌患者，成为全球首个获批的parp抑制剂。随后欧盟、日本等多地获批，且适应症不断扩大，目前已经覆盖乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和胰腺癌。2018年8月23日，国家药品监督管理局正式批准卵巢癌靶向药物奥拉帕利在中国上市，成为在我国国内上市的首款parp抑制剂。奥拉帕利更是被纳入我国2019医保目录。
3.目前国内外未见有对奥拉帕利中潜在基因毒性杂质3-溴苯酞分析方法的研究，因此，研发出一种能够有效检测出遗传毒性杂质3-溴苯酞，且符合操作简单、试剂易得、重现性、线性和回收率好，环境污染小的方法非常有意义。
4.遗传毒性杂质的化学结构如下：杂质名称3-溴苯酞化学结构式：分子式c8h5bro2分子量213.03化学文摘号6940-49-4目前，国内外文献尚未见到奥拉帕利一水合物中遗传毒性杂质3-溴苯酞检测方法报道。


技术实现要素：

5.本发明为了解决上述技术问题，提供一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法。
6.本发明采用的技术方案如下：一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法，包括以下步骤：
步骤s1：将哌啶溶解于甲醇中进行稀释、混合均匀，得到衍生溶剂，并将衍生溶剂溶解于甲醇中作为空白溶液；步骤s2：将奥拉帕利一水合物溶于甲醇形成奥拉帕利溶液，并将衍生溶剂与奥拉帕利溶液按照体积比为1:10-1:200的比例进行均匀混合，作为供试品溶液；步骤s3：将3-溴苯酞溶解于甲醇得到浓度为2.5ng/ml的3-溴苯酞溶液，并将衍生溶剂与3-溴苯酞溶液按照体积比为1:5-1:50的比例进行均匀混合，作为对照品溶液；步骤s4：依次将空白溶液、供试品溶液、对照品溶液注入lc-ms系统，记录对照品溶液主峰峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液保留时间一致的峰面积，采用外标法计算供试品中的3-溴苯酞含量。
7.进一步地，所述步骤s1中衍生溶剂的哌啶的体积与甲醇的体积比为1:5-1:50。
8.进一步地，所述lc-ms系统所使用的色谱柱为反相c18柱，流动相由0.1%甲酸水溶液和甲醇组成。
9.进一步地，所述lc-ms系统中采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的流速为0.3ml/min、柱温为30℃、样品盘温度为4℃、狭缝宽为1.2nm。
10.进一步地，所述梯度洗脱的程序以体积比计，0至3分钟，流动相a为95%，流动相b为5%；3至11分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；11至12.5分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；12.5至12.51分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%；12.51至15分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%。
11.进一步地，所述lc-ms系统的质谱条件为：离子源为ajs-esi，离子模式为正离子，采集模式为多反应监测mrm。
12.本发明的有益效果是：本发明通过选取特定的衍生溶剂将供试品衍生化后，采用lc-ms/ms方法，在本发明开发的色谱和质谱条件下，实现奥拉帕利一水合物中遗传毒性杂质3-溴苯酞的有效检测，该方法的准确度、精密度、重现性、线性、溶液稳定性均符合要求。能降低遗传毒性杂质对人体的危害，为安全用药提供保障。首次采用高效液相色谱质谱联用技术检测洛奥拉帕利一水合物中遗传毒性杂质3-溴苯酞，检测限达到低于0.2ppm。
附图说明
13.图1为本发明一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法的流程示意图；图2为本发明一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法原理示意图；图3为本发明实施例衍生产物扫描离子eic图；图4为本发明实施例的对照品溶液离子色谱图；图5为本发明实施例的供试品溶液色谱图；图6为本发明实施例的精密度溶液的离子色谱图；图7为本发明实施例的线性拟合图。
具体实施方式
14.以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.参见图1，一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法，包括以下步骤：步骤s1：将哌啶溶解于甲醇中进行稀释、混合均匀，得到衍生溶剂，并将衍生溶剂溶解于甲醇中作为空白溶液；可选地，衍生溶剂的哌啶的体积与甲醇的体积比为1:20；可选地，哌啶的体积与甲醇的体积比为1:5；可选地，哌啶的体积与甲醇的体积比为1:30；可选地，哌啶的体积与甲醇的体积比为1:50；步骤s2：将奥拉帕利一水合物溶于甲醇形成奥拉帕利溶液，并将衍生溶剂与奥拉帕利溶液按照体积比为1:20的比例进行均匀混合，作为供试品溶液；可选地，衍生溶剂与奥拉帕利溶液的体积比为1:10；可选地，衍生溶剂与奥拉帕利溶液的体积比为1:30；可选地，衍生溶剂与奥拉帕利溶液的体积比为1:50；可选地，衍生溶剂与奥拉帕利溶液的体积比为1:100；可选地，衍生溶剂与奥拉帕利溶液的体积比为1:200；步骤s3：将3-溴苯酞溶解于甲醇得到浓度为2.5ng/ml的3-溴苯酞溶液，并将衍生溶剂与3-溴苯酞溶液按照体积比为1:5-1:50的比例进行均匀混合，作为对照品溶液；可选地，衍生溶剂与3-溴苯酞溶液的体积比为1:5；可选地，衍生溶剂与3-溴苯酞溶液的体积比为1:30；可选地，衍生溶剂与3-溴苯酞溶液的体积比为1:50；步骤s4：依次将空白溶液、供试品溶液、对照品溶液注入lc-ms系统，记录对照品溶液主峰峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液保留时间一致的峰面积，采用外标法计算供试品中的3-溴苯酞含量；所述lc-ms系统所使用的色谱柱为反相c18柱，流动相由0.1%甲酸水溶液和甲醇组成；所述lc-ms系统中采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的流速为0.3ml/min、柱温为30℃、样品盘温度为4℃、狭缝宽为1.2nm；所述梯度洗脱的程序以体积比计，0至3分钟，流动相a为95%，流动相b为5%；3至11分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；11至12.5分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；12.5至12.51分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%；12.51至15分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%；所述lc-ms系统的质谱条件为：离子源为ajs-esi，离子模式为正离子，采集模式为多反应监测mrm。
16.本发明所检测的遗传毒性杂质3-溴苯酞是奥拉帕利生产工艺过程所使用的反应剂，其可能在原料药和制剂中残留，为安全用药带来潜在风险，因此，使得检测出这种杂质的意义很大。
17.参见图2，因杂质3-溴苯酞为溴代物，其在电喷雾软电离中难产生[m h] 准分子离子，ei电离源分析其稳定性较差，现有的hplc的检测方法无法达到ppm痕量的检测限，本发明通过加入衍生溶剂使杂质3-溴苯酞均转化为衍生物，通过检测衍生物的含量，确定产品中3-溴苯酞的总量。在hplc的检测方法中常有加入衍生剂辅助检测的，衍生溶剂的种类繁
多，本发明通过大量实验发现哌啶可作为杂质3-溴苯酞和杂质b的衍生溶剂，其衍生原理如下：反应机理：3-溴苯酞中卤素的α碳上带有苯环，活动的π电子可以于碳正离子的空轨道发生共轭效应，体系由于共轭而比较稳定，卤素易带着一对电子离去，既可以进行sn1反应，又可以进行sn2反应；常见亲核试剂为胺类化合物，由于环状胺中的氮原子的亲核能力要比链状胺强，为缩短反应时间，选择环状胺。
[0018]
实施例：一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法，包括以下步骤：1.1仪器、试剂、对照品及供试品仪器：百万分之一电子天平，十万分之一电子天平，液相-三重四级杆质谱联用仪（lc-ms/ms）；试剂：甲醇（lc梯度级）、甲酸（色谱级）、纯净水（娃哈哈瓶装596ml）、杂质3-溴苯酞（96.7%）、哌啶（ar）；供试品：奥拉帕利1.2溶液配制（1）衍生剂：取哌啶至容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，哌啶与甲醇比例为1:20摇匀即得衍生溶剂，参见图3为衍生产物扫描离子eic图，218.1为衍生产物的母离子加氢峰；（2）空白溶液：取衍生溶剂至量瓶，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得；（3）对照品储备液：取杂质3-溴苯酞容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；移取0.5ml至20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；移取1ml至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；（4）对照品溶液（2.5ng/ml）：精密移取1.0ml对照品储备液至20ml量瓶中，按衍生溶剂与3-溴苯酞溶液按照体积比为1:20的比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得，参见图4为对照品溶液离子色谱图，218.1》133.0为衍生产物的定量离子对，218.1》77.0为衍生产物的定性离子对；（5）检测限溶液（0.2ng/ml）：精密移取0.08ml对照品储备液至20ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀；精密移取1.0ml至20ml量瓶中，按体积比为1:20的比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得；（6）线性考察溶液：分别精密移取对照品储备液0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml至20ml量瓶中，按比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得。（对应浓度0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、3.75ng/ml、5ng/ml）（7）供试品溶液：取供试品约20.8mg（含奥拉帕利约20mg），精密称定，至20ml量瓶中，加入适量甲醇溶解，再按体积比为1:20的比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得，平行配制2份，参见图5为供试品溶液色谱图，图中显示供试品中检出衍生产物，峰面积小于lod样品的峰面积，含量小于0.2 ppm。
[0019]
（8）精密度溶液：取供试品约20.8mg（含奥拉帕利约20mg），精密称定，至20ml量瓶中，精密加入1.0ml对照品储备液，加入适量甲醇溶解，再按比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得，平行配制6份，参见图6为精密度溶液的离子色谱图，显示加标后可准确定量供试品中的三溴苯酞杂质。
[0020]
（9）准确度溶液：取供试品约20.8mg（含奥拉帕利约20mg），精密称定，至20ml量瓶
中，分别精密加入0.5ml、1.0ml、1.5ml对照品储备液，加入适量甲醇溶解，再按体积比为1:20的比例加入衍生溶剂，甲醇稀释至刻度，振摇2min即得，每个浓度加标平行配制3份。
[0021]
（10）分别取一份对照品溶液和精密度溶液用作溶液稳定性考察。
[0022]
（11）依次将空白溶液、对照品溶液（6次）、灵敏度溶液、线性考察溶液、供试品溶液、精密度溶液、准确度溶液、稳定性溶液注入lc-ms/ms系统，参见图7线性拟合图，线性相关系数r2=0.9994，提示在线性范围0.5~5 ng/ml范围内线性良好，记录对照品溶液主峰峰面积（as1、as2、as3、as4、as5、as6，平均值为as）、供试品溶液中与对照品溶液保留时间保留时间一致的峰面积（at），采用外标法计算供试品中的杂质3-溴苯酞的含量；记录精密度和准确度溶液中与对照品溶液保留时间保留时间一致的峰面积（at），采用外标法计算加标溶液回收率；记录稳定性溶液中各个时间点与对照品溶液保留时间保留时间一致的峰面积（at），计算不同时间点峰面积同0小时峰面积相对偏差；记录灵敏度溶液主峰信噪比；记录线性考察溶液拟合曲线。
[0023]
采用液相色谱质谱联用技术，色谱条件如下，色谱柱选自色谱柱选自waters acquity uplc hss pfp c18（2.1mm
×
100mm，1.8μm）；流动相由a相和b相组成，a相为0.1%甲酸水溶液；b相为甲醇；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：以体积比计，0至3分钟，流动相a为95%，流动相b为5%；3至11分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；11至12.5分钟，流动相a相为10%，流动相b相为90%；12.5至12.51分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%；12.51至15分钟，流动相a相为95%，流动相b相为5%。
[0024]
或者表示为如下表1所示形式：表1 梯度洗脱程序本发明的质谱条件如下：离子源为ajs-esi，离子模式为正离子，采集模式为多反应监测（mrm）见表2：表2 采集模式
*为定量离子1.3测定结果计算将色谱数据代入计算公式如下：ω：供试品中杂质3-溴苯酞含量（ppm）at：供试品溶液中与对照品溶液保留时间一致的峰面积as：对照品溶液主峰峰面积（6次平均值）ws：供试品奥拉帕利的称样量（mg），通过奥拉帕利一水合物称样量折算，折算系数为0.9604wt：对照品杂质3-溴苯酞的称样量（mg）表3-1 测试结果表3-2 测试结果
采用本发明的方法可以检测出奥拉帕利一水合物中遗传毒性杂质3-溴苯酞的含量，本发明实施例表明本实验中的奥拉帕利一水合物药中检出遗传毒性杂质3-溴苯酞小于检测限。
[0025]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。