一种硝唑尼特药物中残留基因毒性杂质氯乙醛的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，更具体地说，涉及一种硝唑尼特药物中残留氯乙醛的检测方法。


背景技术：

2.硝唑尼特，化学名为：邻[n-(5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰]苯酚乙酸酯，化合物结构为：
[0003][0004]
硝唑尼特是一种酰胺类的抗厌氧生物的药品，具有广谱抗原生动物,蠕虫和细菌的特性，尤其用于治疗aids病人的隐孢子虫病感染。硝唑尼特经国外临床的反复试验，对隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫等引起的儿童腹泻有特效。同时对于乙肝、丙肝以及痢疾、腹泻等肠胃的病毒感染也有治疗作用。
[0005]
氯乙醛为2-氨基噻唑生产中的中间体，2-氨基噻唑是合成硝唑尼特的关键起始原料；氯乙醛由起始原料引入，为ichm7分类为1类基因毒性杂质，可能成为引发癌症的诱因，因此，能够检测硝唑尼特中残留氯乙醛的方法对于控制临床用药的安全性具有非常重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种硝唑尼特中基因毒性杂质氯乙醛的检测方法，所述的检测方法采用梯度洗脱的衍生化的高效液相色谱法。该检测方法可以客观、全面、准确的评价硝唑尼特的质量，对控制硝唑尼特的质量和临床用药安全性具有重要意义。
[0007]
本发明提供了一种硝唑尼特药物中残留基因毒性杂质氯乙醛的检测方法，所述的检测方法采用高效液相色谱法，并按照如下检测条件和操作进行检测：
[0008]
检测条件包括：
[0009]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，如inertsilods-3， (4.6
×
250mm
×
5.0μm)、或ymc-packods-aq(4.6
×
250mm
×
5.0μm)
[0010]
流速：0.5ml/min～1.5ml/min；优选地，1.0ml/min
[0011]
检测波长：350nm～370nm；优选地，360nm
[0012]
柱温：15℃～35℃；优选地，25℃
[0013]
进样体积：50μl～100μl；优选地，75μl
[0014]
进样盘温度：0℃-室温，优选地，4℃控温
[0015]
流动相按线性梯度洗脱：
[0016]
供试品溶液的制备：取所述硝唑尼特药物，置15ml锥形瓶中，加入5.0ml纯化水，封口，置调速振荡器上振荡(200rpm)10分钟，用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40分钟，放冷后再用 0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；所述的衍生剂为：称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml；
[0017]
对照品溶液的制备：取氯乙醛，用水定量稀释至每1ml中约含氯乙醛0.36ug的溶液，作为储备液，移取储备液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40min，放冷后再用 0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为对照品溶液；所述的衍生剂为：称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml；
[0018]
取对照品溶液进样，记录色谱图；再取供试品溶液和对照品溶液进样，记录色谱图。
[0019]
在本发明的一些实施方案中，所述检测条件包括：
[0020]
色谱柱：inertsilods-3，(4.6
×
250mm
×
5.0μm)
[0021]
流速：每分钟1.0ml
[0022]
检测波长：360nm
[0023]
柱温：25℃
[0024]
进样体积：75μl
[0025]
进样盘：4℃控温
[0026]
流动相按下表进行线性梯度洗脱：
[0027][0028]
(1)供试品溶液配制：取所述硝唑尼特药物约50mg，精密称定，置15ml锥形瓶中，加入5.0ml纯化水，封口，置调速振荡器上振荡 (200rpm)10min，用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过
滤，取续滤液2.0ml 置10ml量瓶中，加入2.0ml70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40min，放冷后再用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；所述的衍生剂为：称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml；
[0029]
(2)对照品溶液的配制：用水定量稀释至每1ml中约含氯乙醛 0.36ug的溶液，作为储备液，移取储备液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40min，放冷后再用 0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为对照品溶液；所述的衍生剂为：称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml；
[0030]
(3)取对照品溶液进样，记录色谱图；再取供试品溶液进样，记录色谱图；记录色谱图，按外标法以峰面积计算，氯乙醛不得过 0.0036％。
[0031]
在本发明的一些实施方案中，所述的硝唑尼特药物为硝唑尼特制剂或原料药，优选地，为硝唑尼特原料药。
[0032]
在本发明的一些实施方案中，所述的供试品溶液配制为：取硝唑尼特约50mg，精密称定，置15ml锥形瓶中，加入5.0ml纯化水，封口，置调速振荡器上振荡(200rpm)10分钟，用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂(称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml)，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40分钟，放冷后再用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
[0033]
在本发明的一些实施方案中，其中，对照品溶液的配制为：取氯乙醛适量，精密称定，用水定量稀释至每1ml中约含氯乙醛0.36μg 的溶液，作为储备液，移取储备液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml 70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂(称取2,4-二硝基苯肼2.4g，用30％高氯酸水溶液溶解并稀释至100ml)，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40分钟，放冷后再用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为对照品溶液。
[0034]
在本发明的一些实施方案中，其中，所述流动相按下表进行线性梯度洗脱：
[0035][0036]
优选地，
[0037][0038]
在本发明的一些实施方案中，所述的高效液相色谱仪为安捷伦 1260型液相色谱仪dad检测器(qc121、qc128)。
[0039]
有益效果：本发明提供的硝唑尼特中氯乙醛的质量控制方法具有以下优点：
[0040]
本发明根据硝唑尼特中杂质成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的衍生剂配样方式、衍生条件、样品提取方式等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的硝唑尼特中氯乙醛质量控制方法的专属性、灵敏度、线性、精密度、溶液稳定性、重复性、加标回收率、耐用性均符合规定，色谱条件适宜，分离效果较佳，能够满足定性定量检测要求。
因此，本发明提供的硝唑尼特中氯乙醛的质量控制方法可以客观、全面、准确的评价硝唑尼特的质量，对控制硝唑尼特的质量和保证临床用药安全具有重要意义。
附图说明
[0041]
图1表示的是涡旋提取样品的高效液相色谱图；
[0042]
图2表示的是振荡提取样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0043]
实施例1
[0044]
一种硝唑尼特药物中残留基因毒性杂质氯乙醛的检测方法，所述的检测方法采用高效液相色谱法，并按照如下检测条件和操作进行检测：
[0045]
检测条件包括：
[0046]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，如inertsil ods-3， (4.6
×
250mm
×
5.0μm)、或ymc-pack ods-aq(4.6
×
250mm
×
5.0μm)
[0047]
流速：0.5ml/min～1.5ml/min；优选地，1.0ml/min
[0048]
检测波长：350nm～370nm；优选地，360nm
[0049]
柱温：15℃～35℃；优选地，25℃
[0050]
进样体积：50μl～100μl；优选地，75μl
[0051]
进样盘温度：0℃-室温，优选地，4℃控温
[0052]
流动相按线性梯度洗脱：
[0053]
供试品溶液的制备：取所述硝唑尼特原料药，置15ml锥形瓶中，加入5.0ml纯化水，封口，置调速振荡器上振荡(200rpm)10分钟，用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml 70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40分钟，放冷后再用 0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
[0054]
对照品溶液的制备：取氯乙醛，用水定量稀释至每1ml中约含氯乙醛0.36ug的溶液，作为储备液，移取储备液2.0ml置10ml量瓶中，加入2.0ml 70％乙腈-水溶液，混匀，加入0.2ml衍生剂，迅速混匀，用封口膜及保鲜膜封口，1min内放入60℃水浴40min，放冷后再用 0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，作为对照品溶液；
[0055]
取对照品溶液进样，记录色谱图；再取供试品溶液和对照品溶液进样，记录色谱图。
[0056]
为了严格控制好硝唑尼特的质量，能高灵敏的检测硝唑尼特中氯乙醛的残留量，本发明经过大量实验对衍生剂配样方式、衍生条件、样品提取方式、流动相梯度进行筛选、进样时控温：
[0057]
1.本发明对衍生剂配样方式进行了筛选，分别考察将衍生剂(2， 4-二硝基苯肼)配制成3g/l乙腈溶液或称取2，4-二硝基苯肼2.4g，加30％高氯酸溶液，溶解成100ml的方式配制。结果表明，氯乙醛在衍生剂加入30％高氯酸溶液溶解的方式下配制灵敏度较高，且因为衍生剂中为水溶液，硝唑尼特api在水中溶解度小，而氯乙醛与水以任意比例混溶，故用水提取排除了样品中羰基的干扰，使得方法可行。因此，选择衍生剂的配样方式为：称取2，
4-二硝基苯肼2.4g，加30％高氯酸水溶液，溶解并稀释成100ml。
[0058]
2.本发明对衍生条件分别考察了水浴时间20分钟(水浴温度分别为40℃、50℃、60℃、80℃)、水浴温度40℃(水浴时间分别为30分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟)、水浴温度50℃(水浴时间分别为30分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟)、水浴温度60℃(水浴时间分别为30分钟、40分钟、60分钟、90分钟、 120分钟)。结果表明，水浴温度60℃时，水浴时间30分钟～60分钟，衍生产物响应无明显差异，基本到达衍生平台期，故选择水浴温度 60℃，水浴时间为40分钟进行衍生，此时灵敏度符合检测要求。
[0059]
3.本发明对样品提取方式进行了筛选，分别考察了涡旋5分钟和振荡器上200rpm振荡10分钟。涡旋5分钟的提取方式中由于涡旋强度剧烈，有大部分样品溶于水，导致样品参与衍生反应(硝唑尼特中含有羰基，可与衍生剂2,4-二硝基苯肼反应生成相应苯腙)，对目标物氯乙醛衍生物存在干扰；振荡器上200rpm振荡10分钟的提取方式中，振荡强度时间可控性和重现性较好，并且参与衍生的样品较少，对氯乙醛的检测无干扰，并且回收率均符合检测要求，因此选择振荡器上200rpm振荡10分钟对样品进行提取。
[0060][0061]
4.本发明对流动相梯度进行了优化，分别按下表进行
[0062]
流动相梯度1：
[0063]
时间(min)a(％)b(％)06040106040128020188020
206040256040
[0064]
流动相梯度2：
[0065]
时间(min)a(％)b(％)06040106040127525167525188020238020256040306040
[0066]
取空白溶剂水适量，置进样小瓶中，照拟定的色谱条件进样，记录色谱图；再取66b-0、66b-1、66b-2a、66b-2c、66b-2d、66b-2e、 66b-2f、66b-2g、66m0-0、66m1-0、66m1-0a适量，分别用70％乙腈-水溶液溶解稀释后，再用水稀释成储备溶液，分别在拟定条件下衍生过滤，各取续滤液适量，分别置进样小瓶中，照拟定的色谱条件分别单独进样，记录色谱图；再取66b-2b、供试品各50mg，分别置 15ml锥形瓶中，加入5ml水，封口后置振荡器(200rpm)10min，再用0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液适量在拟定条件下衍生过滤，各取续滤液适量，分别置进样小瓶中，照拟定的色谱条件分别单独进样，记录色谱图；
[0067]
按流动相梯度2进行洗脱专属性试验结果如下：
[0068]
名称保留时间tr(min)最小分离度66b-0//66b-1//66b-2a9.191/11.887/66b-2c//66b-2d3.905/66b-2e//66b-2f//66b-2g//66m1-0a//66b-2b//66m1-03.268/66m0-0//氯乙醛14.87611.066api11.796/
[0069]
结果表明，按梯度1和梯度2进行，氯乙醛衍生产物与空白溶剂及硝唑尼特中可能存在的杂质66b-0、66b-1、66b-2a、66b-2c、 66b-2d、66b-2e、66m1-0a、2-氨基噻唑、2-氨基-5-硝基噻唑、66b-2b 等均互不干扰，专属性良好；按梯度2进行洗脱时，梯度峰有明显改善，选择按流动相梯度2进行洗脱更优。
[0070]
5、本发明对进样盘控温进行了筛选，考察对照溶液室温放置稳定性及4℃控温对照溶液稳定性，记录峰面积，结果见下表。
[0071]
室温对照溶液稳定性试验结果
[0072][0073]
4℃控温溶液稳定性试验结果
[0074][0075]
结果表明，对照溶液在4℃条件下放置20小时溶液稳定性良好，选择按4℃控温更优。