一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法与流程

1.本发明涉及化妆品检验技术领域，尤其涉及一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法。


背景技术：

2.人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hegf，cas no:62253-63-8)是由53个氨基酸组成的、相对分子量为6224da的小分子多肽，其多肽链上n-端为天冬酰酸，c-端为精氨酸，等电点为4.6。hegf分子对酸、碱、热等均具有较高的稳定性。
3.近年来hegf被尝试用于化妆品，以改善皮肤问题，hegf在化妆品中的作用主要表现在护肤、修护、抗皱、防衰老、美白、祛斑、防晒及晒后修复、抑制粉刺和青春痘生长、去除斑痕，护发、养发等。正因为hegf对皮肤有显著的生物活性，市场上含hegf的化妆品也日益增多。
4.然而，hegf在护肤品中的应用却是有风险的，它会导致肌肤组织过度生长，贸然使用还有可能导致皮肤生长不可控，形成“肿瘤”样结节增生。
5.2019年1月10日，国家药品监督管理局发布的消费警示指出“不同于寡肽-1，人寡肽-1(hegf)不得作为化妆品原料使用。在配方中添加或者产品宣称含有人寡肽-1或hegf的，均属于违法产品”。然而，在日常化妆品监督抽检工作中发现市售宣称含有hegf，或以寡肽名义标注实际含有hegf的化妆品现象严重，而我国并没有出台相应化妆品中hegf的检测方法。
6.由于hegf分子量大、易溶于水，对其准确分析带来了极大的难度，增加了样品制备的难度，常规的检测方法也难以用于此物质的测定。
7.目前，国内外关于检测化妆品中人表皮生长因子的方法有少量报道，主要有吴震等运用酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子，在筛查36份化妆品中发现有6份为阳性，其中3份冻干粉、2份水剂和1份啫喱，其应用化妆品基质种类少、易受基质干扰、灵敏度低、假阳性率高，且不能测定具体数值；后来吴震等又通过hplc分离，在二极管阵列检测器检测建立了利用高效液相色谱法测定化妆品中非法使用人表皮生长因子的方法，该方法能测定具体值，且准确度较elisa法高，但抗干扰能力差、灵敏度低，容易产生假阳性结果。
8.因此，建立一种灵敏、准确、可靠的测定化妆品中人表皮生长因子的分析方法非常有必要。


技术实现要素：

9.针对上述问题，现提供一种快速、高效、灵敏的化妆品中人表皮生长因子的测定方法。
10.具体技术方案如下：
11.一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法，具有这样的特征，包括如下步骤：
12.1)样品前处理：称取样品，加入二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，再加入提取液，涡旋提取、离心，取上清液待净化；
13.2)标准储备液和中间液的配制：准确称取适量的hegf标准品，用50％乙腈水溶液溶解并定容成浓度为50μg/ml的标准储备液，于-20℃避光保存；将标准储备液用水逐级稀释浓度分别为1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的混合标准中间液；
14.3)基质匹配标准工作液的配制：移取标准中间液，用不含待测物的化妆品处理液稀释成浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的基质匹配标准工作液；
15.4)样品分析检测：利用高效液相色谱-三重四级杆质谱法对基质匹配标准工作液进行测定，绘制标准曲线；再在相同参数下待测溶液进行检测，获得试样中hegf的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以质量色谱图的峰面积和线性回归方程，计算得到待测物的浓度；
16.其中，液相色谱串联谱法中流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液；线性梯度洗脱中流动相a 流动相b＝100％，线性梯度洗脱条件为：0-1.5min，5.0％b；1.5-4.5min，5.0-40.0％b；4.5-6min，40.0-95.0％b；6-9min，95.0％；9.0-9.1min，95.0-5.0％b；9.1-11min，5.0％b。
17.上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤1)中样品前处理方法为：称重1.0g化妆品，置至10ml聚丙烯离心管中，添加1.0ml二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，添加5.0ml 5％氨水，再剧烈旋转10min后以3900rpm的转速离心3min，将上清液过以3.0ml甲醇和3.0ml水活化好的oasis max(60mg/3ml)固相萃取小柱，控制样品溶液滴落速度为1滴/s，分别用3.0ml、5％氨水和3.0ml、5％甲醇水溶液淋洗小柱，负压抽干，再用2
×
0.25ml的10％甲酸75％乙腈水溶液分两次洗脱并完全接收，涡旋混匀后过0.22μm尼龙滤膜于聚丙烯小瓶中，再取5μl滤液注入hplc
–
ms/ms系统。
18.上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤4)中标准曲线绘制方法为：以高效液相色谱-串联质谱仪对浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准工作溶液进行检测，获得标准溶液的质量色谱图，以峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
19.上述的测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为35psi；离子源气体为gs1、60psi；离子源气体为gs2、60psi；离子喷射电压为5500v；源温度为600℃；碰撞气体为氮气。
20.上述的测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：色谱柱为luna omega ps c18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)柱；进样体积为5μl；柱温为40℃；流速为0.4ml/min。
21.化妆品样品基质原料主要是油性原料，包括油脂类、蜡类、碳氢化合物以及组成这些成分的高级脂肪酸、高级醇类，上述基质会干扰分析物的测定。针对上述问题，本发明首次采用oasis max固相萃取小柱对化妆品样品进行净化，协同特定的前处理工艺，从而提供了一种操作简单且准确度高的快速测定方法。
22.本发明采用具有独特的硅胶表面正电荷修饰的色谱柱进行化妆品中人表皮生长因子的分离分析，在流动相添加适量甲酸，有利于提高质谱离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。本发明检出限为0.75μg/kg，定量限为2.5μg/kg，完全满足对化妆品中人表皮生长因子的测定。
附图说明
23.图1为本发明的实施例中提供的测定方法的流程示意图；
24.图2为化妆品中人表皮生长因子的色谱图和质谱图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
27.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
28.本发明的实施例中提供了一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法，其具体包括如下步骤：
29.1)样品前处理：称取样品，加入二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，再加入提取液，涡旋提取、离心，取上清液待净化；
30.2)标准储备液和中间液的配制：准确称取适量的hegf标准品，用50％乙腈水溶液溶解并定容成浓度为50μg/ml的标准储备液，于-20℃避光保存；将标准储备液用水逐级稀释浓度分别为1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的混合标准中间液；
31.3)基质匹配标准工作液的配制：移取混合标准中间液，用不含待测物的化妆品处理液稀释成浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的基质匹配标准工作液；
32.4)样品分析检测：利用高效液相色谱-三重四级杆质谱法对基质匹配标准工作液进行测定，绘制标准曲线；再在相同参数下待测溶液进行检测，获得试样中hegf的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以质量色谱图的峰面积和线性回归方程，计算得到待测物的浓度；
33.其中，液相色谱串联谱法中色谱柱为luna omega ps c18柱(100mm
×
2.1mm，1.6μm)；进样体积为5μl；柱温为40℃；流速为0.4ml/min；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液；线性梯度洗脱中流动相a 流动相b＝100％，线性梯度洗脱条件为：0-1.5min，5.0％b；1.5-4.5min，5.0-40.0％b；4.5-6min，40.0-95.0％b；6-9min，95.0％；9.0-9.1min，95.0-5.0％b；9.1-11min，5.0％b；
34.其中，步骤1)中样品前处理方法为：称重1.0g化妆品，置至10ml聚丙烯离心管中，添加1.0ml二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，添加5.0ml 5％氨水，再剧烈旋转10min后以3900rpm的转速离心3min，将上清液过以3.0ml甲醇和3.0ml水活化好的oasis max(60mg/3ml)固相萃取小柱，控制样品溶液滴落速度为1滴/s，分别用3.0ml、5％氨水和3.0ml、5％甲醇水溶液淋洗小柱，负压抽干，再用2
×
0.25ml、10％甲酸75％乙腈水溶液分两次洗脱并完全接收，涡旋混匀后过0.22μm尼龙滤膜于聚丙烯小瓶中，再取5μl滤液注入hplc
–
ms/ms系统；
35.其中，步骤4)中标准曲线绘制方法为：以高效液相色谱-串联质谱仪对浓度分别为
5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准工作溶液进行检测，获得标准溶液的质量色谱图，以峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
36.上述的测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为35psi；离子源气体为gs1、60psi；离子源气体为gs2、60psi；离子喷射电压为5500v；源温度为600℃；碰撞气体为氮气。
37.本发明中hegf的质谱参数如下表所示：
[0038][0039]
5)本发明分别考察了色谱柱waters xbridge c18柱(150mm
×
2.1mm，5μm)、waters hss t3(100mm
×
2.1mm，1.8μm)、waters cortecs c18(2.1mm
×
100mm，1.8μm)、phenomenex kinetex xb c18(50mm
×
3mm，2.6μm)、phenomenex luna omega ps c18(150mm
×
2.1mm，5μm)和phenomenex luna omega ps c18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)6种不同规格型号的色谱柱对hegf的分离效果。结果表明waters xbridge c18、waters hss t3、waters cortecs c18这3种色谱柱在50ng/ml以上浓度时，hegf色谱行为均表现良好，峰型尖锐对称，而在低于50ng/ml浓度时，hegf均表现出较差的色谱行为，峰型拖尾甚至有些不出峰，可能是因为hegf分子量较大，亲水性较好，在普通c18色谱柱分离度较差，同时还发现hegf在整个洗脱梯度程序下不能洗脱完全而存在色谱柱中有部分残留；kinetex xb c18、luna omega ps c18(150mm
×
2.1mm，5μm)、luna omega ps c18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)这3种色谱柱均因有独特的硅胶表面正电荷修饰而在低浓度时均能出峰，但hegf在kinetex xb c18色谱柱中出现拖尾和响应低等情况，在luna omega ps c18(150mm
×
2.1mm，5μm)色谱柱中响应较好，但峰型较宽》0.3min，luna omega ps c18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)色谱柱则表现出峰型尖锐对称、分离度好、响应高，对于大分子的碱性化合物具有优选性，同时其混合模式固定相，可通过离子交换提升酸性化合物的选择性，因此本发明选择luna omega ps c18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)色谱柱用于hegf的测定。
[0040]
6)样品前处理条件的优化
[0041]
6.1)提取溶剂的选择
[0042]
化妆品样品基质原料主要是油性原料，包括油脂类、蜡类、碳氢化合物以及组成这些成分的高级脂肪酸、高级醇类。极性低，本发明比较了甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷四种溶剂对化妆品中目标化合物的提取效果，结果发现甲醇、乙腈、丙酮均无法完全溶解样品，且hegf会发生蛋白沉淀，完全不适合提取；而二氯甲烷可以与样品完全融合，hegf也不会发生蛋白沉淀，但是离心后不分层。因hegf是小分子多肽，分子量大，但极易溶于水，本发明考虑使用水溶液进行提取，当直接提取时因化妆品含油性高、极性低，导致水溶液在下层样品在
上层，不利于分层提取，于是选择先加1ml二氯甲烷与样品充分溶解，并改变其极性，再用水溶液提取，结果离心后样品在下层水溶液在上层且能形成很好的分层，有助于hegf的提取。进一步使用含酸性、碱性水和纯水作为提取液进行比较发现，在酸性和碱性水溶液提取后离心分层的上清液较澄清，而纯水提取后离心分层的上清液较浑浊，故本发明考虑使用酸性或碱性水溶液作为提取液，二氯甲烷作为溶解剂。
[0043]
6.2)固相萃取方法的选择
[0044]
hegf是小分子多肽类化合物，亲水性强，含有多个氨基酸，属于两性离子化合物，因此难以预测哪种吸附剂的效果才是理想的。实验比较了弱阴离子交换柱(oasis wax)、混合阴离子交换柱(oasis max)、弱阳离子交换柱(oasis wcx)和混合阳离子交换柱(oasis mcx)，对化妆品提取液的净化效果，结果显示wax、wcx和max对于hegf的富集效果均不佳，虽然净化后的除杂效果明显，但是回收率极低；而max柱的回收率可以达到90.1％，且max柱能除去大部分油脂等干扰物，降低了基质效应，故本发明选择max柱对化妆品样品进行净化。
[0045]
本发明也进一步比较了三种不同品牌的混合阴离子交换柱oasis max、agilent pax、cnw max，结果发现agilent pax的过柱速度最快，但回收率仅为50％，而oasis max和cnw max回收率相当，且均满足实验要求，故本发明采用oasis max固相萃取小柱。
[0046]
进一步比较5％氨水水(ph＝11.79)、0.3mol/lk3po4(ph＝12.47)和1mol/lk2hpo4(ph＝9.4)三种不同碱性水溶液作为提取液，结果发现5％氨水水作为提取液是回收率较高，0.3mol/l k3po4和1mol/l k2hpo4的回收率均低于40％，可能是盐溶液降低了hegf的提取效率，导致回收率偏低。
[0047]
在洗脱步骤中采用10％甲酸75％乙腈水作为洗脱液，采用75％乙腈水以维持肽的溶解性，即使是疏水性最强的肽分子，溶解性也不受影响，而有机溶剂浓度过高会导致肽分子发生沉淀；加入10％甲酸有助于的hegf洗脱，以获得更出色的回收率和峰型。
[0048]
含有多肽的洗脱液进行浓缩过程中，应该避免蒸发或者挥干，因为这些操作会导致非特异性吸附(nsb)，从而会使回收率降低，于是本发明选择洗脱液不浓缩而直接过膜上机。为了保证目标物能完全洗脱，又能保证一定的灵敏度，本实验采用2
×
0.25ml、2
×
0.5ml、2
×
1.0ml三体积的10％甲酸75％乙腈水作为洗脱液，分两次进行洗脱，三种体积洗脱液的回收率均大于85％，均满足要求，于是本发明采用了能使灵敏度最高的2
×
0.25ml10％甲酸75％乙腈水作为洗脱液。
[0049]
同时本发明还对2
×
0.25ml10％甲酸75％乙腈水分两次洗脱和0.5ml10％甲酸75％乙腈水一次性洗脱对回收率的影响作为对比，实验发现0.5ml10％甲酸75％乙腈水一次性洗脱时的回收率为68％，低于2
×
0.25ml10％甲酸75％乙腈水分两次洗脱时的回收率，可能是一次性洗脱时部分目标物未完全洗脱下来导致回收率偏低。
[0050]
6.3)滤膜的选择
[0051]
由于前处理过程中未能除尽的杂质可能对实验结果产生干扰并污染色谱柱，因此在上机前需对待测液进行过滤处理，本发明对0.22μm尼龙滤膜、0.22μm聚四氟乙烯滤膜、0.22μm聚醚砜滤膜进行了比较，实验发现0.22μm尼龙滤膜对目标物无明显吸附，0.22μm聚四氟乙烯滤膜和0.22μm聚醚砜滤膜对目标物均有明显吸附，且0.22μm聚四氟乙烯滤膜吸附能力最强，可能是这两种滤膜亲水性较强导致的。因此实验选择0.22μm尼龙滤膜对待测液进行过滤。
[0052]
6.4)进样小瓶的选择
[0053]
因多肽分子粘性高，易被吸附，考虑到进样小瓶对目标物分析的影响，本发明对玻璃进样小瓶和聚丙烯进样小瓶进行了比较，实验发现聚丙烯进样小瓶对目标物没有明显的吸附，而玻璃进样小瓶对目标物有不同程度的吸附作用，可能是因为玻璃进样小瓶表面存在硅羟基，硅羟基易与多肽分子产生氢键作用，同时多肽分子粘性高，极易被吸附到玻璃进样小瓶的表面，进而导致分析物损失。因此本发明采用聚丙烯材料的进样小瓶，同时在整个实验其它步骤中也尽量避免使用玻璃制品的实验耗材。
[0054]
通过上述条件的优化得到本发明的方法，再采用如上测定方法测得化妆品中人表皮生长因子的线性范围、基质匹配标准曲线、lod、loq和me如下表所示：
[0055][0056]
基质效应是指在测定目标化合物时样品基质对目标化合物产生增强或抑制作用。me表示如下：me＝k1/k2，其中k1和k2分别是蜂蜜基质背景和溶剂背景下校准曲线的斜率。当me超过1.15时，说明有增强效应；但如果me低于0.85，则说明有抑制作用；当me在0.85和1.15之间时，me不显著。由上表可知，本发明中hegf的me为0.913，说明基质效应不明显，同时也表明本技术提供的前处理方法优、效率高。
[0057]
本发明中采用基质匹配外标法对在四种浓度(hegf浓度分别为2.5(loq)、5.0、10.0、20.0μg/kg)下加标的空白化妆品样品的分析物进行鉴定和量化，结果如下表所示：
[0058][0059]
由上表可知，本发明中均在线性范围5-80ng/ml内，相关线性系数(r)为0.9995；lod和loq的计算分别基于信噪比(s/n)的3倍和10倍；目标分析物的lod和loq分别为0.75和2.5μg/kg。为了获得准确的定量限，本发明中以定量限浓度添加的化妆品样品分六次重复测试，定量限的回收率在82.2-89.0％，rsd为5.07％，与elisa方法和hplc方法相比，elisa方法无法进行定量检测，而hplc方法的定量限(500μg/kg)是本方法(2.5μg/kg)的200倍，这足以证明本发明的灵敏度和可靠性。
[0060]
为了验证方法的可重复性，本发明中进行六次重复实验分析三种浓度水平(5.0μg/kg、10.0μg/kg和20.0μg/kg)的加标化妆品计算回收率，结果表明目标物的回收率在81.5-88.8％之间，rsd在2.91％到5.07％之间，说明本方法具有良好的准确度和精密度，完全满足实验要求。
[0061]
本发明中通过添加5.0μg/kg的空白样品评估日间和日内重复性；通过在六天内重复分析六个化妆品样品确定日间回收率和精密度；通过每天分析六个加标样品来确定日内回收率和精密度。结果表明，日间和日内试验的回收率分别为87.1-90.1％和88.0-91.3％；日间和日内分析精密度分别为1.53％和1.58％。由此说明，本发明提供的测定方法完全满
足化妆品中人表皮生长因子的快速、高效测定的要求。
[0062]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。