一种雷公藤红素的应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种雷公藤红素的应用。


背景技术：

2.核受体是后生动物中含量最丰富的转录调节因子之一，而固醇类受体(steroid receptor，sr)在人体多种生理病理过程中发挥着重要的功能。
3.在前列腺癌的进展中，雄激素受体(androgen receptor，ar)、雄激素受体剪切变异体7(androgen receptor variant 7，ar-v7)以及糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，gr)等固醇类受体都能够促进前列腺癌的进展。
4.现有研究认为雷公藤红素(celastrol)通过其甲基醌基团(quinone methide moiety)与靶标蛋白质中的半胱氨酸形成可逆的共价键，可以影响多个靶标蛋白质的稳定性、发挥抗肿瘤、抗炎等效果(参示pmid：20226165；doi：10.1016/j.bbrc.2010.03.050)；另有研究指出，雷公藤红素能够阻止热稳定蛋白质hsp90复合物的组装，进而促进雄激素受体降解、抑制前列腺癌进展(参示pmid：17010675；doi：10.1016/j.ccr.2006.09.005)；然而，在雄激素受体功能受到抑制后，前列腺癌细胞依然能够通过雄激素受体剪切变异体7或糖皮质激素受体维持细胞增殖的能力。
5.因此，同时靶向并降解多种核受体的小分子化合物将为前列腺癌的治疗提供新的策略。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种雷公藤红素的应用。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.本发明的第一方面是提供雷公藤红素或其衍生物在制备结合固醇类受体中dna结合结构域(dna binding domain，dbd)的制剂中的应用，所述雷公藤红素的结构如式(i)所示：
[0009][0010]
本发明的第二方面是提供雷公藤红素衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗
前列腺癌的药物中的应用，所述雷公藤红素衍生物的结构如式(ii)所示：
[0011][0012]
优选地，结合固醇类受体中dna结合结构域的制剂或治疗前列腺癌的药物为固醇类受体降解剂。
[0013]
优选地，所述固醇类受体降解剂包括：雄激素受体降解剂、雄激素受体剪切变异体7降解剂、糖皮质激素受体降解剂、黄体酮受体降解剂或盐皮质激素受体降解剂中的至少一种。
[0014]
优选地，所述固醇类受体降解剂还包括：药学上可接受的辅料。
[0015]
优选地，所述药学上可接受的辅料包括：药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的辅助剂或药学上可接受的载体中的至少一种。
[0016]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0017]
本发明的雷公藤红素以及雷公藤红素衍生物通过结合固醇类受体中dna结合结构域以降解固醇类受体，从而抑制前列腺癌的进展，为前列腺癌的治疗提供了小分子药物。
附图说明
[0018]
图1a为本发明实施例中雷公藤红素降解前列腺癌细胞系lncap内源雄激素受体的结果图；
[0019]
图1b为本发明实施例中雷公藤红素结合雄激素受体的结果图；
[0020]
图1c-1f为本发明实施例中雷公藤红素对雄激素受体不同结构域降解效果的结果图；
[0021]
图1g-1h为本发明实施例中雷公藤红素结合雄激素受体dna结合结构域的分子模型图；
[0022]
图1i-1j为本发明实施例中雷公藤红素结合雄激素受体配体结合域分子模型图；
[0023]
图2a-2e为本发明实施例中雷公藤红素结合多种固醇类受体的结果图；
[0024]
图2f-2j为本发明实施例中雷公藤红素结合多种固醇类受体中dna结合结构域的结果图；
[0025]
图3a为本发明实施例中雷公藤红素降解雄激素受体及雄激素受体剪切变异体7的结果图；
[0026]
图3b为本发明实施例中雷公藤红素抑制细胞株22rv1生长的结果图；
[0027]
图3c为本发明实施例中雷公藤红素抑制细胞株lapc4-enz中雄激素受体及糖皮质
激素受体的结果图；
[0028]
图3d-3e为本发明实施例中雷公藤红素抑制细胞株lapc4-enz中雄激素受体靶基因及糖皮质激素受体靶基因的结果图；
[0029]
图3f为本发明实施例中雷公藤红素抑制由dht或皮质醇引发细胞生长的结果图；
[0030]
图3g为本发明实施例中雷公藤红素抑制肿瘤生长的结果图；
[0031]
图4a为本发明实施例中双氢雷公藤红素降解雄激素受体及雄激素受体剪切变异体7的结果图；
[0032]
图4b为本发明实施例中双氢雷公藤红素降解糖皮质激素受体的结果图；
[0033]
图4c为本发明实施例中双氢雷公藤红素抑制雄激素受体功能的结果图。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0036]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
[0037]
实施例
[0038]
按照每毫升培养液中含有20万个细胞的密度，将前列腺癌细胞系lncap接种到6cm培养皿，24小时后用无酚红的1640加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入100μm的放线菌酮(cycloheximide，chx；medchem express；#hy-12320)和1.0μm的雷公藤红素(foreversyn；cas#34157-83-0)处理细胞(对照组仅加入100μm的放线菌酮处理细胞)，在处理不同时间后(包括0小时、3小时、8小时、24小时四个时间点)收集并裂解细胞，检测细胞内雄激素受体的含量，如图1a所示，细胞内源的雄激素受体丰度明显降低。
[0039]
合成生物素交联的雷公藤红素探针，如式(iii)所示：
[0040][0041]
使用pei转染2.0μg pcdna3.1-3
×
flag-ar质粒至293t细胞，24小时后，用300μl 50mm tris ph7.4、150mm nacl、0.3％np40以及1％cocktail裂解细胞，不加入雷公藤红素或雷公藤红素探针孵育6小时，或仅加入50μm雷公藤红素探针孵育6小时，或加入50μm雷公
藤红素孵育3小时后加入50μm雷公藤红素探针继续孵育3小时，使用35μl flag肽段封闭的neutravidin agarose resins(thermo；#29202)4℃结合1小时，清洗后用蛋白上样缓冲液洗脱，最后用免疫印迹法检测蛋白含量，如图1b所示，雷公藤红素探针能够富集flag-ar；并且雷公藤红素能够与雷公藤红素探针竞争，减少雷公藤红素探针对flag-ar的富集，这说明了雷公藤红素能够直接结合雄激素受体。
[0042]
使用pei转染2.0μg表达雄激素受体不同结构域的质粒至293t细胞，24小时后用无酚红的dmem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时(对照组不加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时)，收集并裂解细胞，检测相应蛋白的含量，如图1c-1f所示，雷公藤红素能够降解全长雄激素受体、雄激素受体dna结合结构域和雄激素受体配体结合域(ligand binding domain，lbd)，但是雷公藤红素对雄激素受体n端结构域(n terminal domain，ntd)降解效果不明显。
[0043]
结合已经报道的蛋白质结构信息进行分子对接，如图1g-1j所示，雷公藤红素能够与雄激素受体配体结合域和雄激素受体dna结合结构域结合。
[0044]
核受体的dna结合结构域高度保守；使用pei转染2.0μg表达不同核受体【包括：糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，gr)、黄体酮受体(progesterone receptor，pr)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，mr)以及雌激素受体(estrogen receptor 1，esr1或estrogen receptor 2，esr2)】的质粒至293t细胞，24小时后用无酚红的dmem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时(对照组不加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时)，收集并裂解细胞，检测相应蛋白的含量，如图2a-2e所示，细胞内核受体蛋白质丰度在雷公藤红素处理后明显下降。
[0045]
使用pei转染2.0μg表达不同核受体(同上)dna结合结构域的质粒至293t细胞，24小时后用无酚红的dmem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时(对照组不加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时)，收集并裂解细胞，检测相应蛋白的含量，如图2f-2j所示，细胞中核受体dna结合结构域相应的蛋白质丰度在雷公藤红素处理后也明显下降。
[0046]
按照每毫升培养液中含有20万个细胞的密度，将前列腺癌细胞系22rv1接种到6cm培养皿，24小时后用无酚红的1640加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入100μm的放线菌酮和1.0μm的雷公藤红素处理细胞(对照组仅加入100μm的放线菌酮处理细胞)，在处理不同时间后(包括0小时、3小时、8小时、24小时四个时间点)收集并裂解细胞，检测细胞内雄激素受体及雄激素受体剪切变异体7的含量，如图3a所示，雷公藤红素能够有效地促进细胞22rv1中内源雄激素受体及雄激素受体剪切变异体7的降解。
[0047]
按照每孔10000个细胞的密度，将前列腺癌细胞系22rv1接种到96孔板，24小时后用无酚红的1640加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后加入0.5μm的雷公藤红素处理细胞(对照组不加入0.5μm的雷公藤红素)。分别在加药后第0天，第1天和第3天加至cck8(碧云天；#c0038)试剂盒，用酶标仪(biotek)测量450nm和600nm处的吸光度，计算细胞的增殖速率，如图3b所示，雷公藤红素能够有效地抑制细胞22rv1的生长。
[0048]
前列腺癌细胞系lapc4同时表达雄激素受体和糖皮质激素受体；利用10μm药物恩杂鲁胺(enzalutamide，enz)处理细胞lapc4一个月后，所得细胞株lapc4-enz中雄激素受体和糖皮质激素受体的丰度比乙醇处理一个月所得对照细胞株(lapc4-ctrl)有明显升高；按
照每毫升培养液中含有20万个细胞的密度，将细胞株lapc4-enz和对照细胞株lapc4-ctrl分别接种至6cm培养皿，24小时后加入1.0μm的雷公藤红素处理细胞6小时，收集并裂解细胞，检测相应蛋白的含量，如图3c所示，雷公藤红素能够有效地导致lapc4-ctrl和lapc4-enz中雄激素受体和糖皮质激素受体蛋白质丰度降低。
[0049]
在lapc4细胞中，500nm皮质醇(cortisol)能够激活糖皮质激素受体信号通路，提高糖皮质激素受体靶基因psa和c9orf152的表达；1nm的双氢睾酮(dihydrotestosterone，dht)能够激活雄激素受体信号通路，提高雄激素受体靶基因psa的表达，但是不影响糖皮质激素受体靶基因c9orf152的表达；按照每毫升培养液中含有20万个细胞的密度，将细胞株lapc4-enz接种到24孔板，24小时后用无酚红的imem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后分别不加入、加入1.0nm的dht、或加入200nm的皮质醇以及不加入、加入1.0μm的雷公藤红素、或加入1.0μm的恩杂鲁胺(foreversyn；cas#915087-33-1)处理细胞24小时，去除培基后采用细胞到cdna一步法试剂盒(ezbioscience；#b0003)获得cdna样品，之后使用实时荧光定量pcr的方法检测相应基因的表达量，如图3d-3e所示，雷公藤红素处理lapc4-enz后，雄激素受体靶基因和糖皮质激素受体靶基因的表达都能够受到雷公藤红素的抑制。
[0050]
按照每孔10000个细胞的密度，将细胞株lapc4-enz接种到96孔板，24小时后用无酚红的imem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后分别不加入、加入1.0nm的dht、或加入200nm的cortisol以及不加入、加入1.0μm的雷公藤红素、或加入1.0μm的恩杂鲁胺处理细胞。分别在加药后第0天和第3天加至cck8(碧云天；#c0038)，用酶标仪(美国biotek)测量450nm和600nm处的吸光度，计算细胞的增殖速率，如图3f所示，雷公藤红素能够抑制由dht或者皮质醇引发的细胞生长。
[0051]
采用matrigel(corning；#354234)和细胞悬液1：2混合的方式，将10m细胞株lapc4-enz皮下接种到6-8周龄的雄性nod-scid小鼠的右侧腋窝处，当肿瘤长至150mm3大小时以150μg/kg的剂量开始腹腔给药(对照组不给药)，同时游标卡尺测量肿瘤的体积，计算肿瘤的生长速率，如图3g所示，雷公藤红素能够抑制该肿瘤的生长。
[0052]
若根据现有研究所认为的雷公藤红素是通过其甲基醌基团与靶标蛋白质中的半胱氨酸形成共价键来调节蛋白质功能，则其还原态的小分子化合物双氢雷公藤红素(dihydrocelastrol，dhc)由于不含有甲基醌基团而无法与半胱氨酸形成可逆的共价键；按照每毫升培养液中含有20万个细胞的密度，将前列腺癌细胞系22rv1接种到6cm培养皿，24小时后用无酚红的1640加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后不加入、仅加入100μm的放线菌酮、加入100μm的放线菌酮以及1.0μm的雷公藤红素、或加入100μm的放线菌酮以及1.0μm的双氢雷公藤红素(gaia chemical corporation；cas#193957-88-9)处理细胞，8小时后收集并裂解细胞，检测细胞内雄激素受体及雄激素受体剪切变异体7的含量，如图4a所示，双氢雷公藤红素仍能发挥降解核受体的功能。
[0053]
按照每毫升培养液中含有15万个细胞的密度，将前列腺癌细胞系pc3接种到6cm培养皿，24小时后用无酚红的1640加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后不加入、或加入100μm的放线菌酮以及不加入、加入1.0μm的雷公藤红素、或加入1.0μm的双氢雷公藤红素处理细胞，8小时后收集并裂解细胞，检测细胞内糖皮质激素受体的含量，如图4b所示，双氢雷公藤红素仍能发挥降解核受体的功能。
[0054]
按照每孔10000个细胞的密度，将前列腺癌细胞系lapc4接种到24孔板，24小时后用无酚红的imem加5％活性炭吸附的胎牛血清饥饿细胞24小时，之后分别不加入或加入1.0nm的dht以及不加入、加入1.0μm的雷公藤红素、或加入1.0μm的双氢雷公藤红素处理细胞24小时。去除培基后采用细胞到cdna一步法试剂盒(ezbioscience；#b0003)获得cdna样品，之后使用实时荧光定量pcr的方法检测相应基因的表达量，如图4c所示，双氢雷公藤红素同样能够在前列腺癌细胞lapc4中抑制雄激素受体下游靶基因psa的表达。
[0055]
综上所述，本发明的雷公藤红素以及雷公藤红素衍生物通过结合固醇类受体中dna结合结构域以降解固醇类受体，从而抑制前列腺癌的进展，为前列腺癌的治疗提供了小分子药物。
[0056]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。