一种Caspase-8荧光定量组合物、试剂盒及其应用

一种caspase-8荧光定量组合物、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种caspase-8荧光定量检测组合物、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.caspase-8(半胱氨酸蛋白酶-8)属于半胱氨酸蛋白酶家族的重要成员，作为外源性凋亡途径的启动因子引发凋亡级联反应，与凋亡途径的最终执行者caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)组成死亡受体转导途径中最为关键的两环，相互配合诱导细胞凋亡。caspase-8的功能不仅局限于执行细胞凋亡，而且还涉及其它方面，例如介导炎症反应、参与nf-κb活化、巨噬细胞分化、t和b细胞增殖、胚胎发育等。caspase-8的表达缺失与多种疾病的发生发展有关，包括肿瘤、病毒感染、神经退行性疾病、传染病等。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何高灵敏度、高特异性地定量检测caspase-8。
4.本发明首先提供一种检测或辅助检测caspase-8基因表达水平的组合物：所述组合物由特异于caspase-8的引物对和特异于caspase-8的探针组成，所述引物对是由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna组成的引物对；所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.上述组合物中，所述探针在seq id no.3所示的单链dna分子的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团；所述淬灭基团能淬灭所述荧光基团的荧光信号。
6.上述组合物中，所述荧光淬灭基团可选为bhq1；所述荧光报告基团可选为fam。
7.本发明的第二个目的是提供用于检测或辅助检测caspase-8基因表达水平的rt-pcr试剂。
8.本发明提供的用于检测或辅助检测caspase-8的rt-pcr试剂包括上述组合物。
9.所述rt-pcr试剂还包括进行rt-pcr扩增所需的非引物和探针的试剂。
10.所述非引物试剂可为rt-pcr反应缓冲液，和/或，聚合酶或含有聚合酶的溶液。
11.本发明的第三个目的是提供用于检测或辅助检测caspase-8基因表达水平的试剂盒。
12.所述试剂盒能用于检测或辅助检测caspase-8基因表达水平。
13.本发明提供的用于检测或辅助检测caspase-8基因表达水平的试剂盒包括上述组合物或上述rt-pcr试剂。
14.本发明的第四个目的是提供上述组合物或上述rt-pcr试剂或上述试剂盒的新用途。
15.本发明提供了上述组合物或上述组合物或上述rt-pcr试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测caspase-8基因表达水平的产品中的应用。
16.本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测caspase-8的方法。
17.本发明提供的检测或辅助检测caspase-8的方法，包括如下步骤：用上述组合物对待测样本进行rt-pcr扩增，得到rt-pcr扩增实时荧光结果；根据所述实时荧光结果确定待测样本是否为caspase-8阳性：若ct值≤35，并出现明显扩增曲线，则待测样本判定为阳性；若无ct值或ct值＞35，且未出现明显扩增曲线，则待测样本判定为阴性。
18.本发明拟基于探针法，建立caspase-8实时荧光定量qrt-pcr检测方法，并在此基础上制备针对caspase-8特异的荧光定量qrt-pcr的试剂盒，为caspase-8的检测提供技术支撑。
附图说明
19.图1为实施例1中采用本发明提供的caspase-8特异性引物对和探针进行caspase-8的实时荧光定量pcr检测结果。
20.图2为实施例2中采用本发明提供的caspase-8引物和探针进行caspase-8的实时荧光定量pcr检测方法灵敏度测试结果。
21.图3为实施例3中采用本发明提供的caspase-8引物和探针进行caspase-8实时荧光定量qrt-pcr标准曲线构建的结果图。
22.图4为实施例4中caspase-8实时荧光定量pcr方法在全血生物样品中的检测结果图。
具体实施方式
23.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
24.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.下述实施例中所用的puc57质粒(即不含caspase-8的puc57质粒)为武汉淼灵生物科技有限公司产品。
26.下述实施例中所用的含caspase-8基因的重组质粒，为将caspase-8基因(序列表序列4)克隆至puc57质粒的多克隆位点，保持puc57质粒的其它序列不变，得到含caspase-8基因(序列表序列4)的重组质粒，将其命名为puc57-caspase-8。
27.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
28.实施例1、检测caspase-8用的引物和探针，及试剂盒与检测方法
29.1、引物和探针
30.根据已发表的caspase-8基因序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，并将拟定的特异性引物对在genbank数据库中进行blast比对，确定引物的特异性。
31.最后选定的特异性引物对(由上游引物和下游引物组成)以及探针如下：
32.上游引物：5
′‑
ctggactacattccgcaaagg-3
′
(序列表中序列1)；
33.下游引物：5
′‑
gacagattgctttcctccaacatt-3
′
(序列表中序列2)；
34.探针：5'-fam-tgttattccagagactcc-bhq1-3'(核苷酸序列是序列表中序列3，其中，fam是5'端修饰的荧光报告基团，bhq1是3'端修饰的荧光淬灭基团)。
35.引物对应的目的片段的dna序列为序列表中序列4。
36.2、试剂盒
37.根据上述设计的特异性引物对和探针，制备了检测caspase-8的实时荧光定量qrt-pcr试剂盒，该试剂盒保存于-20℃条件下，其组成具体如下：
38.(1)rt-pcr反应混合液(rt-pcr reaction mix)；
39.(2)酶混合液(enzyme mix)；
40.(3)上游引物：序列如序列表中序列1所示的单链dna；
41.(4)下游引物：序列如序列表中序列2所示的单链dna；
42.(5)探针：序列如序列表中序列3所示的单链dna，其5'端修饰有荧光报告基团fam，3'端修饰有荧光淬灭基团bhq1；
43.(6)阳性对照：含caspase-8基因的重组质粒(puc57-caspase-8)；
44.(7)阴性对照：不含caspase-8的puc57质粒(puc57)；
45.(8)无酶无菌水(dnase/rnase-free h2o)。
46.3、caspase-8实时荧光定量qrt-pcr检测方法
47.caspase-8实时荧光定量qrt-pcr检测方法包括如下步骤：
48.(1)提取待检样品的rna，即模板rna，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取；
49.(2)用本发明设计的特异性引物对和探针，对待测样本进行免核酸提取实时荧光定量pcr扩增。其中，反应体系、反应条件以及结果判定方式如下：
50.反应体系：15μl rt-pcr reaction mix和1μl enzyme mix(来自卡尤迪生物科技(北京)有限公司，通用型免核酸提取qrt-pcr试剂盒)；1μl上游引物(序列如序列表中序列1所示的单链dna)；1μl下游引物(序列如序列表中序列2所示的单链dna)；1μl探针(序列如序列表中序列3所示的单链dna，其5'端修饰有荧光报告基团fam，3'端修饰有荧光淬灭基团bhq1)；根据不同生物样本类型加入不同用量的样品模板(见表1)，以加入puc57-caspase-8作为阳性对照，以加入puc57作为阴性对照；并用dnase&rnase-free h2o补齐25μl反应体积。
51.表1样本模板的建议用量
52.模板种类最佳用量咽拭子2.5μl2μledta抗凝全血样本 18μl样本稀释液2.5μl血浆2μl
53.反应条件：具体反应条件如表2所示：
54.表2反应条件
[0055][0056]
结果判定方式：如图1所示，若ct值≤35，并出现明显扩增曲线，则判定为阳性；若无ct值或ct值＞35，且未出现明显扩增曲线，则判定为阴性。
[0057]
实施例2、本发明试剂盒灵敏度的测试
[0058]
1、材料
[0059]
重组质粒puc57-caspase-8。
[0060]
2、方法
[0061]
用分光光度计测定puc57-caspase-8质粒浓度后对其进行倍比稀释，设置5个梯度(1
×
106copies/ul-1
×
102copies/ul)，即稀释后的5组待检测重组质粒浓度分别为1
×
106copies/ul、1
×
105copies/ul、1
×
104copies/ul、1
×
103copies/ul和1
×
102copies/ul，并以实施例1中的检测caspase-8的实时荧光定量qrt-pcr试剂盒对5组待检测重组质粒进行检测。检测pcr扩增最低检测浓度，以验证方法的灵敏度。
[0062]
3、结果
[0063]
如图2所示，显示pcr扩增最低检测浓度为1
×
102copies/ul，说明该试剂盒具有高灵敏性。
[0064]
实施例3、caspase-8实时荧光定量qrt-pcr标准曲线的构建
[0065]
1、材料
[0066]
采用实施例1提供的检测caspase-8的实时荧光定量qrt-pcr试剂盒对重组质粒puc57-caspase-8进行检测。
[0067]
2、方法
[0068]
以重组质粒puc57-caspase-8作为标准品，对其进行倍比稀释，设置5个梯度(1
×
106copies/ul
×
102copies/ul)，即稀释后的5组待检测重组质粒命名为puc57-caspase-8溶液的浓度分别为1
×
106copies/ul、1
×
105copies/ul、1
×
104copies/ul、1
×
103copies/ul、1
×
102copies/ul，并以本发明提供的实时荧光定量qrt-pcr检测试剂盒对caspase-8进行检测。以构建caspase-8实时荧光定量qrt-pcr标准曲线。
[0069]
3、结果
[0070]
结果如图3所示。caspase-8实时荧光定量qrt-pcr标准曲线为：y＝-3.5543x 26.731，r＝0.958(如图3所示)；其中，横坐标x轴代表加入模板拷贝数的对数，纵坐标y轴代表荧光阈值。
[0071]
实施例4、检测caspase-8的实时荧光定量qrt-pcr试剂盒在新型冠状病毒肺炎确
诊患者血清生物样品中的应用
[0072]
1、材料
[0073]
待检样品为采集的新型冠状病毒肺炎确诊患者血清样本(共95份)，来自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所。
[0074]
2、方法
[0075]
对采集的新型冠状病毒肺炎确诊患者血清样本，采用本发明实施例1提供的检测caspase-8的实时荧光定量qrt-pcr试剂盒和检测方法进行pcr扩增，以实现caspase-8的检测。
[0076]
3、结果
[0077]
结果如图4所示：95份新型冠状病毒肺炎确诊患者血清样本均为caspase-8阳性，检出率达到100％。
[0078]
综上所述，本发明提供的特异性引物对和探针，以及基于该特异性引物对和探针的试剂盒和检测方法，可实现caspase-8的准确检测，操作简单，灵敏度高、特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生。
[0079]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。