一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂及其使用方法和应用与流程

1.本发明涉及提高西地那非单克隆抗体稳定性的技术领域，具体涉及一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂及其使用方法和应用。


背景技术：

2.西地那非(sildenafil，sd)是美国食品药品管理局(fda)于1998年批准用于治疗性功能障碍的一种5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5，pde5)抑制剂，是已批准的3个壮阳药之一，其副作用主要有头痛、背痛以及视力听力障碍，与硝酸酯类药物同时服用时会显著降低血压导致意识丧失甚至死亡等。然而，部分保健食品企业为了加强产品功效，向产品中非法添加那非类药物，其中以西地那非违禁添加问题最为突出，因此，建立保健食品中西地那非药物灵敏准确的检测方法，对食品安全监管具有重要实际意义。
3.目前常用的检测方法为免疫分析检测，其包括放射性免疫分析技术、酶免疫分析技术和金标免疫分析技术等。免疫分析方法均具有特异性强、灵敏度高、准确、快速、操作简便等优点。但是一般单克隆抗体在4℃可保存6个月至12个月左右，抗体的活性基本仍能保持90％以上。西地那非单克隆抗体在4℃保存4天就失活，极不稳定，严重影响相关的产品转化及保存，影响制备金标记西地那非单克隆抗体，从而影响检测效果。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，能有效保持西地那非单克隆抗体的活性，使其能在4℃下保存6个月以上；本发明的目的之二在于提供一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法；本发明的目的之三在于提供一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的应用。
5.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
6.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠2.1～4％、磷酸二氢钠0.2～0.35％、氯化钠1～4％、牛血清白蛋白5～20％、蔗糖1～3％、乙二胺四乙酸0.01～1.5％、山梨醇1～5％、聚乙二醇0.1～2％，余量为水。
7.进一步，所述聚乙二醇为聚乙二醇4000。
8.再进一步，所述试剂的ph为7.5～8.0。
9.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
10.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
11.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：(90～110)进行混合，得到混合物后放置在0～4℃下保存。
12.优选地，将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：100进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
13.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
14.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的应用，所述试剂用于保存西地那非单克隆抗体。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
16.本发明的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的主要成分为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、乙二胺四乙酸、山梨醇和聚乙二醇，加入该试剂后，西地那非单克隆抗体在4℃保存6个月后，抗体活性仍保持90％以上。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠作为平衡缓冲溶液，氯化钠提供离子强度。牛血清白蛋白作为可溶性蛋白，封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。蔗糖可以保护抗体活性，使抗体稳定。乙二胺四乙酸具有抗氧化、防腐作用，同时还能防止一些离子沉积。山梨醇能够保持抗体表面的滋润，不因失水而失活。聚乙二醇能形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏。
具体实施方式
17.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
18.实施例1
19.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠3％、磷酸二氢钠0.25％、氯化钠3％、牛血清白蛋白16％、蔗糖2％、乙二胺四乙酸1％、山梨醇3％、聚乙二醇4000 1％，余量为水。其中，所述试剂的ph为7.6。
20.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
21.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：100进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
22.实施例2
23.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠2.1％、磷酸二氢钠0.2％、氯化钠1％、牛血清白蛋白5％、蔗糖1％、乙二胺四乙酸0.01％、山梨醇1％、聚乙二醇4000 0.1％，余量为水。其中，所述试剂的ph为7.5。
24.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
25.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：110进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
26.实施例3
27.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠4％、磷酸二氢钠0.35％、氯化钠4％、牛血清白蛋白20％、蔗糖3％、乙二胺四乙酸1.5％、山梨醇5％、聚乙二醇4000 2％，余量为水。其中，所述试剂的ph为8.0。
28.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
29.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：90进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
30.实施例4
31.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠2.5％、磷酸二氢钠0.3％、氯化钠2％、牛血清白蛋白10％、蔗糖1.5％、乙二胺四乙酸0.05％、山梨醇2％、聚乙二醇4000 0.5％，余量为水。其中，所述试剂的ph为8.0。
32.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
33.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：100进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
34.实施例5
35.一种提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂，包括以下按重量百分比计的原料：磷酸氢二钠3.5％、磷酸二氢钠0.27％、氯化钠3％、牛血清白蛋白11％、蔗糖2.5％、乙二胺四乙酸1.2％、山梨醇4％、聚乙二醇4000 0.8％，余量为水。其中，所述试剂的ph为7.7。
36.上述的提高西地那非单克隆抗体稳定性的试剂的使用方法，包括以下步骤：
37.将所述试剂与西地那非单克隆抗体按照体积比1：100进行混合，得到混合物后放置在4℃下保存。
38.性能测试
39.检测对象：购自广东省药检所，批号20220224的西地那非单克隆抗体。
40.将西地那非单克隆抗体分别加入实施例1～5的试剂和采用对应的使用方法进行处理，设置五组实验组，并设置一组只加入纯水的空白对照组。六组西地那非单克隆抗体在4℃分别保存6个月，并在7d、1m、3m和6m后取出分别测试西地那非单克隆抗体的活性，具体数据如表1。
41.其中，测试活性使用酶联免疫抗原抗体直接竞争法，具体包括以下步骤：
42.①
抗原包被：西地那非抗原，用包被液l:2000稀释，100μl/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。
43.②
洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。
44.③
封闭：加200μl/孔封闭液，37℃恒温箱温育2h。
45.④
洗涤：用洗涤液洗3次。
46.⑤
加待测样品(一抗)：将不同条件处理的西地那非单克降抗体溶液在另一块板上用pbs连续稀释(按照1:2；1:4；1:8:；1:16；1:32；1:64；1:128)，100μl/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，pbs作为阴性对照，冷冻保存的样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1h。
47.⑥
洗涤：用洗涤液洗3次。
48.⑦
加酶标抗抗体：羊抗鼠igg-hrp，用封闭液l:5000稀释，50μl/孔，加盖37℃恒温箱温育1h。
49.⑧
洗涤：用洗涤液洗3次。
50.⑨
显色：加新鲜配制的底物溶液100μl/孔，室温暗处放置15min，显示蓝色。
51.⑩
终止反应、比色：加50μl/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的活性效价。产品活性计算方式：产品活性＝样品效价/第0天活性效价*100。
52.其中试剂为：
53.1.包被液：ph 9.6，na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，加水至1000ml。
54.2.洗涤液：含0.05％tween 20的pbs。
55.3.封闭液：含1％牛血清白蛋白，0.1％tween-20的pbs。
56.4.底物溶液：
①
磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/lph6.0)：称na2hpo4·
12h2o2.2g，
nah2po4·
2h2o 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500ml。
57.②
tmb贮液：称60mgtmb溶于10ml二甲基亚砜中，4℃避光保存。
58.③
底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10ml，tmb贮液10μl，30％h2o
2 15μl，混匀。
59.5.终止液：2mol/l h2so4。
60.表1各组西地那非单克隆抗体在6个月内储存活性数据
[0061][0062][0063]
由表1可知，不添加试剂的西地那非单克隆抗体在4℃下保存7天就已经完全失活，而加入了实施例1～5的试剂后的西地那非单克隆抗体在4℃下保存6个月，且活性均在90％以上，有利于西地那非单克隆抗体产品转化及保存。
[0064]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。