一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用

技术特征：
1.一种抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统，其特征在于，含有两种筛药细胞株，一种筛药细胞株为稳定过表达人il-21cns序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的两种筛药细胞株均为hek293t细胞。4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的人il-21cns序列及启动子序列包括：人il-21cns2，cns49和promoter的序列，序列分别如seq id no：1-3所示；所述的人foxp3启动子序列如seq id no：4所示。5.权利要求1-4任一项所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建稳定表达内参海肾荧光素酶报告基因的293t细胞：将海肾荧光素酶表达慢病毒载体包装成慢病毒，转染293t细胞，进行阳性细胞筛选，得到整合有rluci的293t细胞；2)筛药细胞株il-21cns produal luci 293t细胞的构建a)将人il-21cns2，cns49及promoter基因克隆进plv-pro-luci的慢病毒基因过表达载体luciferase基因的上游，从而获得重组载体plv-cns2-cns49-il-21-pro luci；人il-21cns2，cns49及promoter基因序列分别如seq id no：1-3所示；b)将重组载体plv-cns2-cns49-il-21-pro luci包装成慢病毒，转染步骤1)中的整合有rluci的293t细胞；进行阳性细胞筛选，得到il-21cns produal luci 293t的稳转细胞；3)筛药细胞株foxp3 produal luci 293t细胞的构建a)将人foxp3 promoter基因克隆进plv-pro-luci的慢病毒基因过表达载体luciferase基因的上游，从而获得重组载体plv-foxp3-promoter-luci；所述人foxp3 promoter基因的序列如seq id no：4所示；b)将重组载体plv-foxp3-promoter-luci包装成慢病毒，转染步骤1)中的整合有rluci的293t细胞；进行阳性细胞筛选，得到foxp3 produal luci 293t的稳转细胞。6.权利要求1-4任一项所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统的应用方法，其特征在于，被筛药物和il-21cns pro dual luci 293t细胞共同培养后，通过测定该细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平，即以萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光强度比值反映被筛药物对il-21cns和promoter表达的影响；被筛药物和foxp3 pro dual luci 293t细胞共同培养后，通过测定该细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平，即以萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光强度比值反映被筛药物对foxp3 promoter表达的影响。7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别将筛药系统的两种细胞分别种于96孔平底细胞培养板；单孔细胞量为6000～12000个，每孔含10％fbs的rpmi-1640培养基100～200μl；放于37℃，5％co2培养箱中培养12～24h；2)在细胞培养液中加入待筛选的药物，放于37℃，5％co2培养箱中继续培养24-72h；3)去除孔内培养液，pbs洗涤后测定两种荧光素酶的活性，评估药效。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，细胞培养板使用侧壁不透明而底部透明的平底96孔细胞培养板，优选使用侧壁白色而底部透明的细胞培养板；每孔含10％fbs的rpmi-1640培养基200μl；加入待筛药物后继续培养48h。9.两种筛药细胞株在制备权利要求1-4任一项所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统中的应用，其特征在于，所述的两种筛药细胞株中：一种筛药细胞株为稳定过表达人il-21cns序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因；所述的两种筛药细胞株均为hek293t细胞。所述的人il-21cns序列及启动子序列包括：人il-21cns2，cns49和promoter的序列，序列分别如seq id no：1-3所示；所述的人foxp3启动子序列如seq id no：4所示。

技术总结
本发明建立了一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用。本发明建立的药物筛选系统是运用分子克隆技术，基于外源重组质粒，将IL-21的保守非编码序列(Conservative noncoding sequences，CNS)和启动子(Promoter，下文以Pro简称)的部分基因，Foxp3启动子的部分基因分别导入HEK293T细胞内，构建成含有双荧光素酶报告系统的细胞靶标筛药体系。通过测定被筛选化合物抑制导入IL-21CNS Pro 293T细胞(IL-21CNS Produal Luci 293T)luciferase表达并促进导入Foxp3Pro的293T(Foxp3ProdualLuci 293T)细胞luciferase表达的程度来筛选抗自身免疫药物。本发明所建立的药物筛选体系是一种灵敏、高效、可靠、适于高通量抗自身免疫药物筛选的细胞体系。高通量抗自身免疫药物筛选的细胞体系。高通量抗自身免疫药物筛选的细胞体系。


技术研发人员：陆前进 赵明 何谢玲
受保护的技术使用者：中南大学湘雅二医院
技术研发日：2022.06.29
技术公布日：2022/12/16