一种油茶皂苷和/或银杏提取物作为抑制稻黑孢菌的杀菌剂的应用

1.本发明涉及杀菌剂技术领域，尤其涉及一种油茶皂苷和/或银杏提取物作为抑制稻黑孢菌的杀菌剂的应用。


背景技术：

2.稻黑孢菌(nigrospora oryzae)是一种在全球范围内广泛分布的病原真菌，可侵染玉米、水稻、小麦、高粱、棉花、生姜、菩提榕树等多种植物，我国主要分布在黑龙江、江苏、四川、湖南、广东等主要稻区，会引发水稻穗腐病、水稻鞘枯病、木芙蓉黑斑病、鸭跖草叶斑病、水稻枝枯病、生姜叶斑病等病害。
3.针对该菌的防治报道目前相对较少。李戌清等人报道75％肟菌
·
戊唑醇水分散粒剂、325g
·
l-1
苯甲
·
嘧菌酯悬浮剂、250g
·
l-1
嘧菌酯悬浮剂对该菌的平板抑制效果较好(李戌清,傅鸿妃,李红斌.稻黑孢菌生物学特性及杀菌剂筛选[j].长江蔬菜,2016,(6):80-84.)。冯爱卿等检测了10种杀菌剂对该菌的抑制效果，结果显示苯醚甲环唑、咯菌腈、咪鲜胺锰盐以及苯甲
·
丙环唑等药剂可作为防治稻黑孢菌的候选药剂(冯爱卿,陈深,朱小源,等.10种杀菌剂对水稻稻叶褐条斑病菌的室内毒力[j].植物保护,2014,40(4):193-197.)。在生物防治方面，sempere等证明草酸青霉能抑制稻黑孢霉生长，但大田还没有试验验证及推广应用(sempere f,santamarina m p.suppression of nigrospora oryzae(berk.&broome)petch by an aggressive mycoparasite and competitor,penicillium oxalicum currie&thom[j].international journal of food microbiology,2008,122(1-2):35-43.)。因此，尽快开发对稻黑孢菌有防治效果的新药剂显得十分必要和迫切。
[0004]
油茶皂苷是一种性能优良的天然表面活性剂，有抗氧化等多种生物活性。针对这些活性，目前研发了基于油茶皂苷的洗涤剂、杀虫剂、各类工业乳化剂、啤酒发泡剂和食品工业乳化剂等。近年来，利用油茶皂苷防治植物致死型病原真菌的研究被广泛关注，黄继光等测试了12种植物病原菌发现，油茶皂苷对稻瘟病、柑橘青霉病、番茄小核病、荔枝霜疫霉、玉米小斑病的5种病原菌菌丝生长有显著抑制作用，但对香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、香蕉炭疽病菌等无抑制作用(黄继光,陈秀贤,徐汉虹,等.茶皂素对12种植物病原菌的抑菌活性[j].华中农业大学学报,2013,32(2):50-53.)。油茶皂苷对稻黑孢菌的抑制作用目前尚未见报道。
[0005]
银杏被称为植物活化石，在地球上生存了上亿年，其重要原因之一是其枝叶中所含的成分具有显著的抗虫、杀菌活性。有研究表明，银杏叶提取物在低浓度条件下能够抑制黑曲霉、新月弯孢菌、尖孢镰孢菌、立枯丝核菌对相关宿主的侵染(liu xg,lu x,gao w,et al.structure,synthesis,biosynthesis,and activity of the characteristic compounds from ginkgo biloba l.natural product reports,2022,39(3):474-511.)。但银杏叶提取物对稻黑孢菌的抑制作用目前尚未见报道。2mg
·
l-1
、9.45
×
10-2
mg
·
l-1
、8.40
×
10-2
mg
·
l-1
、7.35
×
10-2
mg
·
l-1
、6.30
×
10-2
mg
·
l-1
、5.25
×
10-2
mg
·
l-1
、4.20
×
10-2
mg
·
l-1
浓度，向培养皿加入1ml稀释液和9ml的pda培养基混匀，分别制成含10.5
×
10-3
mg
·
l-1
、9.45
×
10-3
mg
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l-1
、8.40
×
10-3
mg
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l-1
、7.35
×
10-3
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l-1
、6.30
×
10-3
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l-1
、5.25
×
10-3
mg
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l-1
、4.20
×
10-3
mg
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l-1
浓度的油茶皂苷pda平板，空白组加1ml的无菌水和9ml培养基，每个浓度三个重复，共24个平板。
[0021]
(2)银杏提取物浓度梯度培养基的配制：将银杏提取物加水稀释制成1.30
×
10-2
mg
·
l-1
、1.10
×
10-2
mg
·
l-1
、0.90
×
10-2
mg
·
l-1
、0.70
×
10-2
mg
·
l-1
、0.50
×
10-2
mg
·
l-1
浓度，向培养皿加入1ml稀释液和9ml的pda培养基混匀，分别制成含1.30
×
10-3
mg
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l-1
、1.10
×
10-3
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、0.90
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10-3
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、0.70
×
10-3
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、0.50
×
10-3
mg
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l-1
浓度的银杏提取物pda平板，空白组加1ml的无菌水和9ml培养基，每个浓度三个重复，共18个平板。
[0022]
(3)抑菌活性测定：用5mm打孔器打孔活化的稻黑孢菌菌饼，接种到含药pda平板中央，将带药及空白平板培养基置于28℃恒温培养。每24h观察一次，直至空白对照菌落直径达到培养皿的2/3时，每个菌落用十字交叉法测量菌落直径各一次，取其平均值。根据测得的结果计算菌丝生长抑制率。再由浓度、抑制率绘制毒力回归方程，计算有效中浓度ec
50
。
[0023]
菌落直径(cm)＝测量的菌落直径-0.5；
[0024]
菌丝生长抑制率(％)＝(空白对照菌落直径-处理菌落直径)/空白对照菌落直径
×
100％。
[0025]
采用菌落生长速率法，测定两种杀菌剂对稻黑孢菌菌丝生长抑制率，结果如表1所示。
[0026]
表1两种杀菌剂在不同浓度下对稻黑孢菌的抑制率
[0027]
[0028][0029]
注：抑菌率＝平均值
±
标准差(n＝3)。
[0030]
从表1中可以看出油茶皂苷和银杏提取物对稻黑孢菌均有抑制效果，而且抑制效果显著，两者均呈现出浓度依赖性。其中银杏提取物对稻黑孢菌的抑菌效果最明显。油茶皂苷抑制效果每增加10％，浓度增加1.0
×
10-3
mg
·
l-1
左右；银杏提取物抑制效果每增加20％，浓度增加0.20
×
10-3
mg
·
l-1
左右，也从侧面说明了银杏提取物抑菌效果比油茶皂苷好。
[0031]
稻黑孢菌菌丝生长状况也反映了油茶皂苷和银杏提取物的抑制效果(图1)，对照组(f和l)的菌丝饱满晶莹，内部结构充盈且连续，整体表现出健康的生长状态，而经过两种杀菌剂处理过后其他组(a-e，g-k)的菌丝发生了明显变化，菌丝出现严重褶皱，干瘪，且菌丝内部出现明显的断层现象。这两者对稻黑孢菌的具体杀伤机制还有待于进一步研究。
[0032]
单剂对稻黑孢菌的毒力测定结果如表2所示。油茶皂苷的ec
50
为6.3
×
10-3
mg
·
l-1
、银杏提取物的ec
50
为0.87
×
10-3
mg
·
l-1
，对稻黑孢菌的ec
50
均小于0.1mg
·
l-1
，毒力效果较理想。而且两者ec
50
都在95％置信限，两个卡方值均显著性水平大于0.150，在置信限度中未有任何异质性因子，说明数值可靠。就毒力大小而言，ec
50
值越小，其毒力越大，故油茶皂苷的毒力小于银杏提取物，后者的毒力是前者的10倍左右。可见银杏提取物在防治稻黑孢菌的效果远远好于油茶皂苷。
[0033]
表2单剂对稻黑孢菌的毒力测定
[0034][0035][0036]
实施例2
[0037]
混合药剂增效配方的筛选
[0038]
采用wadley法进行筛选。按油茶皂苷和银杏提取物的ec
50
值(表2)以0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0的进行混药配比，每个配比重复3次，再按相对应的浓度梯度顺序将两单剂混合，菌落生长速率法测定抑菌效果。不加药剂为空白对照。接种后置于28℃恒温培养。每24h观察一次，直至空白对照菌落直径达到培养皿的2/3时，用十字交
叉法测量菌落直径各一次，取其平均值，并计算抑菌率。由混合配比的预测值和实际值，计算毒力比(tr)：tr＝ec
50
理论值/ec
50
实际值
×
100。
[0039]
当tr显著为》1时两者的相互作用是协同的，当tr显著《1时为拮抗作用，当tr＝1时相互作用是可加的。结果如表3、4所示。
[0040]
表3混合药剂对稻黑孢菌的抑制效果
[0041][0042][0043]
注：抑菌率＝平均值
±
标准差(n＝3)。
[0044]
从表3的标准差可知，油茶皂苷单剂、银杏提取物单剂以及混剂的标准差大部分小于0.1，说明实验数据稳定性好，数据结果可靠。
[0045]
表4药剂混配对稻黑孢菌的增效作用
[0046][0047]
从表4的抗真菌指数来看，除3：7的比例外，观测值最高且高于预测值，其余配比预测值基本高于观测值，均有不同程度的拮抗作用，毒性比率均《1。3∶7比例混合的实际抑制率为88.07％，毒性比率2.84。因此，药剂混配的最佳配比为ec
50
剂量油茶皂苷：银杏提取物＝3∶7。
[0048]
根据tr显著值决定的最佳配比油茶皂苷：银杏提取物＝3∶7，以此配比进行稀释，得3个浓度梯度的1.956
×
10-3
、1.413
×
10-3
、0.87
×
10-3
mg
·
l-1
混合药剂，制备12个pda平板，培养菌饼，置于28℃恒温培养箱中培养3天，测量菌落直径各一次，取其平均值。绘制毒力回归方程，混剂毒力回归方程y＝ax b和r值，求ec
50
(a b)。再可求出共毒系数(ctc)。结果如表5所示。
[0049]
ctc＝[(ec
50
a/ec
50
(a b)]/[(ec
50
a/ec
50
a)
×
pa (ec
50
a/ec
50
b)
×
pb]
×
100。
[0050]
式中a、b分别代表油茶皂苷与银杏提取物2种药剂组分，a、b是油茶皂苷与银杏提取物2组分在混剂中含量的比值。当ctc为》100时，两者的相互作用具有协同作用；ctc显著《100时为拮抗作用；当ctc约为100时，相互作用是相加的。
[0051]
表5药剂混配对稻黑孢菌的毒力测定
[0052][0053]
由表5可知，油茶皂苷与银杏提取物混配对稻黑孢菌具有增效抑制作用。
[0054]
油茶皂苷和银杏提取物单独作用与微生物均有一些报道，但无抑制稻黑孢菌的报
道。且对于油茶皂苷和银杏提取物混合杀菌的作用方式、作用机理还有待进一步研究。
[0055]
由以上实施例可知，本发明中油茶皂苷和银杏提取物单剂对稻黑孢菌有较为显著的抑制效果，与目前已经上市的一些商品化农药的效果相当，因此这两者均具有防治稻黑孢菌引起的植物病害的潜力。且二者作为植物提取物在环境友好性方面更具有优势。本发明还筛选出了油茶皂苷和银杏提取物有增效作用的配比，既提高了杀菌效果，又提升了环境友好性，为稻黑孢菌的防控提供了新的药剂配方。
[0056]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。