CDC20抑制剂在制备用于减轻肾脏纤维化的药物中的用途的制作方法

cdc20抑制剂在制备用于减轻肾脏纤维化的药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及一种医药领域，具体涉及cdc20抑制剂的在制备用于减轻肾脏纤维化的药物中的用途。


背景技术：

2.慢性肾脏病(ckd)已被公认为全球公共卫生的主要负担，估计全球患病率大于10％。它涉及肾脏功能或结构的不可逆变化，其特征是缓慢渐进的进展。许多因素可导致ckd进展，包括实质细胞丢失、慢性炎症、肾脏再生能力降低和肾脏纤维化。肾脏纤维化，特别是肾小管间质纤维化，是一个不可避免的渐进过程，几乎发生在每种类型的慢性肾脏疾病中，其特征是纤维细胞外基质(ecm)的重塑和过度生成/沉积。目前临床上ckd的治疗选择很少，只能延缓疾病的进展。事实上，几乎不存在专门针对肾纤维化的经批准的治疗方法。
3.细胞分裂周期蛋白20同源物(cdc20)是后期促进复合物高度保守的激活剂，通过靶向关键细胞周期调节因子进行降解，在控制有丝分裂进程中发挥关键作用。已有报道[1-5]cdc20在多种恶性肿瘤中高表达，它通过调节有丝分裂进程和凋亡参与肿瘤的发生和发展。除了在细胞周期调节中的典型作用外，最近的研究表明[6-8]，cdc20可能参与许多其他重要的细胞过程，包括胚胎植入、睫状体形成或dna损伤修复。在人类肿瘤中的综合分析表明，对于大多数癌症类型，cdc20表达与癌症相关成纤维细胞的浸润呈正相关。cdc20在肾脏纤维化中的作用尚不明确。
[0004]
apcin是一种结合cdc20并竞争性抑制含d-box底物泛素化的小分子，目前apcin作为cdc20特异性抑制剂被报道可以协同protame促进多发性骨髓瘤细胞凋亡[9]以及延长视网膜色素上皮细胞的有丝分裂时间。目前还没有使用cdc20抑制剂apcin来减轻肾脏纤维化的报道。
[0005]
参考文献如下：
[0006]
1.alfieri,c.,et al.,molecular basis of apc/c regulation by the spindle assembly checkpoint.nature,2016.536(7617):p.431-436；
[0007]
2.belur nagaraj,a.,et al.,mitotic exit dysfunction through the deregulation of apc/c characterizes cisplatin-resistant state in epithelial ovarian cancer.clin cancer res,2018.24(18):p.4588-4601；
[0008]
3.harley,m.e.,et al.,phosphorylation of mcl-1by cdk1-cyclin b1 initiates its cdc20-dependent destruction during mitotic arrest.embo j,2010.29(14):p.2407-20；
[0009]
4.li,b.,et al.,competitive binding between id1 and e2f1 to cdc20 regulates e2f1 degradation and thymidylate synthase expression to promote esophageal cancer chemoresistance.clin cancer res,2016.22(5):p.1243-55；
[0010]
5.wan,l.,et al.,apc(cdc20)suppresses apoptosis through targeting bim for ubiquitination and destruction.dev cell,2014.29(4):p.377-91；
[0011]
6.du,y.,et al.,cdc20 promotes bone formation via apc/c dependent ubiquitination and degradation of p65.embo rep,2021.22(9):p.e52576；
[0012]
7.guo,c.,et al.,cdc20 inhibitor apcin inhibits embryo implantation in vivo and in vitro.cell biochem funct,2020.38(6):p.810-816；
[0013]
8.shalom,o.,et al.,the mammalian nek1 kinase is involved in primary cilium formation.febs lett,2008.582(10):p.1465-70；
[0014]
9.lub,s.,et al.,inhibiting the anaphase promoting complex/cyclosome induces a metaphase arrest and cell death in multiple myeloma cells.oncotarget,2016.7(4):p.4062-76。


技术实现要素：

[0015]
发明目的：本发明意外的发现了cdc20抑制剂apcin在制备用于减轻肾脏纤维化的药物中的用途。
[0016]
为了研究cdc20对肾脏纤维化的而作用，我们检测了患有肾纤维化的人类患者和小鼠中cdc20的表达，用于检测cdc20沉默在肾纤维化中的作用。研究表明，apcin治疗显著减弱了梗阻肾组织和tgf-β1刺激肾小管细胞外基质的积累和成纤维细胞的激活，但cdc20过表达则加重tgf-β1刺激肾小管细胞外基质的积累和成纤维细胞的激活。数据表明，cdc20在肾纤维化的进展中起着重要作用，抑制cdc20是一种潜在的抗肾纤维化新疗法。
[0017]
具体地，本技术发现，apcin可以改善uuo诱导的肾脏纤维化，具体表现为apcin显著减少了肾间质中的胶原沉积和纤维化病变；apcin改善了uuo诱导的细胞外基质沉积，具体表现为apcin处理组中uuo诱导的fn1表达显著减少。apcin显著降低uuo损伤后升高的i型胶原和iii型胶原mrna；apcin抑制uuo诱导的成纤维细胞活化，具体表现为apcin治疗减弱了uuo模型中α-sma表达的增加，同时显著apcin降低了tgf-β1诱导的肾小管细胞fn1、i型胶原和iii型胶原的升高；apcin降低了nrk49f细胞中tgf-β1介导的成纤维细胞活化。
附图说明
[0018]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0019]
图1为cdc20抑制剂apcin改善uuo诱导的肾脏病理损伤结果图，其中，sham为假手术组，uuo为单侧输尿管阻塞模型组；
[0020]
图2为apcin对uuo诱导的细胞外基质沉积的影响图；
[0021]
图3为apcin对uuo诱导的成纤维细胞活化的影响图；
[0022]
图4为apcin对tgf-β1诱导的肾小管细胞外基质分泌的影响图；
[0023]
图5为apcin对gf-β1诱导的成纤维细胞活化的影响图；
[0024]
图6为过表达cdc20对tgf-β1诱导的肾小管细胞外基质分泌的影响图；
[0025]
图7为过表达cdc20对tgf-β1诱导的成纤维细胞活化的影响图。
具体实施方式
[0026]
下面通过具体的实施例详细说明本发明。除非另外指明，本发明中所使用的试剂
均为市售试剂。大鼠成纤维细胞(nrk-49f)和小鼠肾小管上皮细胞(mptc)均来自atcc(american type culture collection)。
[0027]
下述实施例中采用的实验方法和材料具体如下：
[0028]
动物模型制备：为了评估apcin对ckd的影响，建立了单侧输尿管阻塞(uuo)模型。来自南京医科大学实验动物中心的8周龄雄性c57bl/6j小鼠被随机分为4组(假手术组，n＝8；apcin组，n＝7；uuo组，n＝8；uu0 apcin小组，n＝8)。小鼠通过腹腔注射用apcin(5mg/kg/天)预处理1天。然后进行uuo手术如下：用异氟醚麻醉小鼠。通过肋下外侧切口打开腹膜后区域，将左肾外置，用4-0缝合丝结扎近端输尿管，替换肾脏，闭合切口并缝合。除输尿管结扎外，假手术组的其余步骤相同。在对动物实施安乐死之前，在接下来的7天内连续施用apcin。动物安乐死后，用于组织学分析的肾组织固定在4％多聚甲醛中，剩余的肾组织储存在-80℃下进行mrna和蛋白质分析。根据南京医科大学机构动物护理和使用委员会的程序，所有小鼠都被安置在不受限制的环境中，以获得食物和水。
[0029]
组织学分析：将肾组织固定在4％多聚甲醛中至少24小时，并包埋在石蜡中。石蜡切片(3μm)脱蜡和再水化。肾脏切片用马森三色染色以显示胶原结缔组织纤维。通过使用image pro plus的计算机分析定量评估纤维化面积(蓝色)与总面积。
[0030]
免疫组化染色：3μm厚的石蜡包埋肾切片在3％过氧化氢中孵育20分钟。在用柠檬酸盐抗原提取液(beyotime，上海，中国)在沸水中提取抗原20分钟后，用免疫染色阻断液(beyoutime，中国上海)封闭，并用cdc20(1:100)孵育，fn 1(1:200)和α-sma(1:300)抗体在4℃下过夜。用二氨基联苯胺(dab)进行显色反应，并用苏木精复染细胞核。使用image pro plus进行图像分析和量化。
[0031]
细胞培养：在含有10％fbs的dmem中维持肾成纤维细胞(nrk-49f)的培养。小鼠肾近端小管上皮细胞(mptc)在含有7％fbs和6mg/l胰岛素的dmem:f12中生长。细胞在37℃、5％的co2敷箱中生长，并在50
–
80％的汇合条件下使用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta(invitrogen)传代培养。在某些实验中，细胞用apcin(25或50nm)预处理0.5小时或用cdc20质粒转染6小时，然后用重组人tgf-β1处理(nrk-49f为10ng/ml或mptc为15ng/ml)。
[0032]
细胞增殖和细胞毒性测定：使用cck-8测定试剂盒测定细胞活力。将nrk-49f和mptc接种在96孔板中，并用不同浓度的apcin(0-200nm)处理。培养24小时后，向每个孔中添加10μl cck-8试剂，并培养1-2小时。用微孔板读取器测量450nm处的吸光度。
[0033]
实时定量pcr：用trizol分离来自组织或细胞的总rna。使用hiscript ii rt supermix从1μg rna合成cdna用于qpcr(vazyme，中国南京)。实时pcr使用sybr green pcr主混合物(vazyme，中国南京)在lightcycler 96仪器(德国罗氏)上进行。使用gapdh作为内参，使用δδct法计算相对值。
[0034]
western印迹分析：用含有蛋白酶抑制剂混合物(roche)的ripa缓冲液稀释细胞或组织裂解物，煮沸10分钟。在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质(20μg/泳道)，然后将其电印迹到pvdf膜上。用5％脱脂奶粉在tris缓冲盐水(20mm tris
·
hcl和0.5m nacl，ph 7.5)中封闭印迹1小时，然后与fn1(1:1000)、i型胶原(1:000)、iii型胶原(2:1000)、α-sma(1:2000)、cdc20(1:1000)和gapdh(1:10000)抗体一起孵育过夜。使用amersham biosciences ecl检测系统对条带进行可视化。用图像j进行密度测定分析。
[0035]
免疫荧光染色：将nrk-49f细胞培养在玻璃底细胞培养皿(nest，中国)上，用apcin
(50nm)预处理0.5小时，然后用重组人tgf-β1(10ng/ml)处理。然后，在用pbs多次洗涤后，将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟，用pbs广泛洗涤，用pbs 1％triton x-100渗透10分钟，用2％bsa封闭1小时。将一抗α-sma以1:100稀释度加入培养皿中，并在4℃的潮湿室内培养过夜；在用pbst洗涤后施用二级抗体。然后，在激光共聚焦扫描显微镜(蔡司)下观察细胞，拍照并记录。
[0036]
统计分析：结果以平均值
±
sem表示。使用双尾student t检验分析两组之间的差异，并将其纳入graphpad prism 6软件(graphpad软件)。单因素方差分析用于多组之间的比较。p值小于0.05被认为是显著的。
[0037]
实施例1apcin改善uuo诱导的肾脏纤维化。
[0038]
肾脏纤维化是ckd的最终共同途径和组织学表现。为了进一步阐明cdc20在肾脏纤维化中的作用，我们在c57bl/6j小鼠上建立了uuo手术以制备肾脏纤维化模型。用cdc20抑制剂apcin预处理小鼠，直到第7天将其安乐死。与假手术小鼠(sham组)相比，通过masson三色胶原染色检测到的肾纤维化显示，apcin显著减少了肾间质中的胶原沉积和纤维化病变，如图1所示。
[0039]
实施例2apcin改善了uuo诱导的细胞外基质沉积。
[0040]
为了进一步证实apcin治疗组中uuo引起的肾脏纤维化是否减少，我们检测了fn1、i型胶原和iii型胶原的表达。免疫组化染色结果显示，apcin处理组中uuo诱导的fn1表达显著减少(如图2，a和b)。apcin显著降低uuo损伤后升高的i型胶原(collagen i)和iii型胶原(collagen iii)mrna水平(图2，c和d)。蛋白质印迹结果进一步证实，在apcin uuo组中，i型胶原和iii型胶原均显著减弱(图2，e和f)。使用gapdh作为内参。这些数据提供了强有力的证据，证明apcin可以减轻uuo诱导的细胞外基质沉积。
[0041]
实施例3apcin抑制uuo诱导的成纤维细胞活化。
[0042]
成纤维细胞和肌成纤维细胞是肾脏纤维化的最终执行者。这些被激活的执行器能够产生大量的细胞外基质，导致纤维化。肌成纤维细胞是成纤维细胞的活化形式，其特征在于α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)的表达。如图3所示，通过q-pcr(图3a)和免疫组织化学染色(图3b和c)，uuo模型中α-sma的表达水平显著增加。而apcin治疗减弱了α-sma表达的增加。
[0043]
实施例4apcin治疗改善了mptc细胞(肾小管上皮细胞)中tgf-β1诱导的细胞外基质沉积。
[0044]
虽然成纤维细胞通常被认为是肾纤维化的重要因素，但最近的研究表明，肾小管上皮细胞在tgf-β1刺激下也能生成成熟的沉积细胞外基质。因此，我们想知道apcin是否能减少mptc细胞中tgf-β1诱导的细胞外基质沉积。首先，我们确定将mptc暴露于apcin不会导致细胞活力的显著浓度依赖性降低(图4a)。然后，在apcin治疗后0.5小时给予tgf-β1。在我们的实验中，25nm和50nm apcin给药均显著降低了tgf-β1诱导的fn1、i型胶原和iii型胶原的升高(图4b-d)。western印迹进一步证实，与tgf-β1刺激组相比，50nm apcin处理显著降低了fn1和iii型胶原的表达(图4e和f)。
[0045]
实施例5apcin降低了nrk49f细胞中tgf-β1介导的成纤维细胞活化。
[0046]
我们进一步研究了apcin在成纤维细胞激活中的作用。在nrk49f细胞(大鼠正常肾成纤维细胞)中，apcin处理在高浓度下仅导致细胞活力的小幅度降低(图5a)。这意味着apcin在生理条件下不影响成纤维细胞的生长。western blot和qpcr分析表明，在tgf-β1刺
激前给予apcin可显著降低fn1和iii型胶原的表达水平(图5，b和c，e和f)。免疫荧光染色显示，apcin还可以减弱tgf-β1诱导的a-sma表达(图5d)。这些数据证实，apcin可减少nrk49f细胞中tgf-β1诱导的成纤维细胞活化。
[0047]
实施例6过表达cdc20对tgf-β1诱导的mptc细胞外基质分泌和nrk-49f细胞活化的影响。
[0048]
尽管cdc20的抑制可能减少uuo和tgf-β1诱导的肾脏纤维化，但cdc20是否可能诱导肾脏纤维化尚不清楚。我们在mptc细胞中过表达cdc20，并观察到tgf-β1诱导的细胞外基质分泌显著增加。在用tgf-β1处理的细胞中，在cdc20过表达后，观察到fn1、α-sma和i型胶原的mrna水平显著增加(图6，a-c)。western印迹和半定量分析证实，在tgf-β1处理后，cdc20过度表达显著进一步诱导fn1、α-sma和iii型胶原的蛋白水平(图6，d和e)。
[0049]
为了进一步验证cdc20在成纤维细胞中的作用，我们在nrk49f细胞中过表达cdc20，然后使用tgf-β1刺激。在tgf-β1刺激后过度表达cdc20的细胞中，i型胶原和fn1 mrna水平显著升高(图7，a和b)，以及iii型胶原和fn1的蛋白水平(图7，c-e)。
[0050]
综上所述，本技术通过具体的实验数据验证了cdc20抑制剂apcin的治疗显著减弱了梗阻肾组织和tgf-β1刺激细胞中细胞外基质的积累和成纤维细胞的激活，表明cdc20在肾纤维化的进展中起着重要作用，抑制cdc20是一种潜在的抗肾纤维化新疗法。