基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法

基于dia标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法
技术领域
1.本发明属于乳品质量检测技术领域，具体涉及一种基于dia标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法。


背景技术：

2.大熊猫(ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀哺乳动物，出生时极不成熟，耳聋、失明、几乎赤裸，新生幼仔与母亲的体重比最小，约为1/1000，出生后需要充足的母乳和极高质量的营养供应。
3.大熊猫母乳的营养状况对其幼仔的生长发育至关重要。母乳可以为幼仔提供大量的蛋白质、氨基酸、脂肪酸和其他生物活性成分，这些成分与免疫系统相互作用，并对幼仔的健康状况产生终身影响。有研究认为，大熊猫从初乳到成熟乳的过渡时间约为30天。在许多物种中，初乳和成熟乳的营养成分差异已经明确。但是关于大熊猫初乳和成熟乳的详细营养成分的研究极其有限。且从未吃过大熊猫初乳的幼仔，其成活率非常低。
4.此外，值得注意的是，大熊猫乳汁极其珍贵。母亲的乳汁通常只够喂养一只幼仔，然而，随着人工授精的成功采用，大熊猫产下的双胞胎数量显著增加，但很少有双胞胎的大熊猫妈妈有能力同时喂养两只幼崽，且它们的乳汁量少很难同时满足两只幼崽的生长需求。在这种情况下，饲养员会用前期冷冻贮藏的大熊猫乳汁或人工乳喂养幼仔。因此，判定大熊猫乳汁为初乳或成熟乳对于圈养大熊猫的繁殖发育至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于dia标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案由下述步骤组成：
7.1.采集大熊猫初乳样品与成熟乳样品，分别提取乳中的蛋白。
8.2.将步骤1提取的蛋白混合，进行肽段酶解，并以数据依赖性采集(dda)模式质谱分析进行数据采集，构建谱图库。
9.3.将步骤1提取的蛋白分别进行肽段酶解，以数据非依赖性采集(dia)模式质谱分析进行数据采集。
10.4.对步骤3中获得的数据采用步骤2构建的谱图库进行定性定量分析，以定性后的肽段在初乳样品与成熟乳样品中的相对定量值之比的对数值作为判断蛋白丰度水平变化的依据，该对数值大于1.5则为上调蛋白，该对数值小于2/3则为下调蛋白，该对数值处于1.5和2/3之间则该蛋白丰度在初乳和成熟乳样品中无显著变化。
11.5.将步骤4获得的初乳样品与成熟乳样品中上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别取上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，如果标记蛋白包含正相关的标记蛋白：含肽酶s1结构域的蛋白质(elane)、排序nexin-2蛋白、ef-hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1，则说明待测大熊猫乳样品为初乳；如果标记蛋白包含负相关的标记蛋白：atp-柠檬酸裂解酶、atp合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40s核糖体
蛋白s25(rps25)、延伸率tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含tgc结构域蛋白、ribosomal_l18e/l15p结构域蛋白、ethylmalonyl-coa脱羧酶1(echdc1)，则说明待大熊猫乳样品为成熟乳。
12.上述步骤1中，大熊猫初乳和成熟乳的采集要由专业饲养人员进行，采集后立即在-76～-80℃冰箱中冷冻保存。
13.上述步骤2中，优选将步骤1提取的蛋白等质量混合。
14.上述步骤2中，酶解后的肽段先在c18色谱柱上脱盐，然后使用thermo scientific
tm pierce
tm
高ph值反相多肽分馏试剂盒分馏成10个馏分，每个馏分掺入irt标准肽段溶液后，先采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离，色谱柱为c18色谱柱，流动相：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液，其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的a液平衡，流速为300nl/min，分离梯度如下：0～40分钟，b液线性梯度从8％～30％；40～50分钟，b液线性梯度从30％～100％；50～65分钟，b液维持100％；纳升级高效液相色谱分离后用q-exactive hfx质谱仪进行dda质谱分析，分析时长65分钟，检测模式正离子，一级质谱扫描范围300～1800m/z，质谱分辨率60000@m/z 200，自动增益控制目标3e6，最大注入时间为25ms；每次一级质谱全扫描后根据包含列表采集20个自动触发二级扫描，分离窗口1.6th，质谱分辨率15000@m/z 200，自动增益控制目标5e4，最大注入时间为25ms，ms2激活类型hcd，归一化碰撞能量30ev。
15.上述步骤2中，以dda模式采集的数据采用spectronaut软件(spectronaut
tm 14.4.200727.47784)进行数据处理，检索参数设置如下：酶为胰蛋白酶，最大漏裂数为1，固定修饰为碳酰胺甲基，动态修饰为氧化和乙酰基(蛋白质n端)。数据库检索鉴定到的蛋白必须通过设定的过滤参数fdr《1％。
16.上述步骤3中，酶解后的肽段掺入irt标准肽段溶液后，采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离，色谱柱为c18色谱柱，流动相：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液，其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的a液平衡，流速为300nl/min，分离梯度如下：0～40分钟，b液线性梯度从8％～30％；40～50分钟，b液线性梯度从30％～100％；50～65分钟，b液维持100％；纳升级高效液相色谱分离后用q-exactive hfx谱仪进行dia质谱分析，检测模式正离子，一级质谱扫描范围350～1650m/z，质谱分辨率60000@m/z 200，自动增益控制的目标3e6，最大注入时间为50ms；二级质谱设置30个dia采集窗口，质谱分辨率30000@m/z 200，自动增益控制的目标3e6，最大注入时间为自动，ms2激活类型hcd，归一化的碰撞能量30ev，光谱数据类型为轮廓。
17.上述步骤4中，以dia模式采集的数据采用spectronaut软件(spectronauttm 14.4.200727.47784)进行数据处理，软件参数设置如下：保留时间预测类型设置为动态irt，ms2水平校正设置为允许，交叉运行规范化设置为允许，所有结果必须通过设定的过滤参数fdr《1％。
18.本发明通过dia蛋白质组学技术，对大熊猫初乳和成熟乳中蛋白进行定量和定性，并对上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别选择上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，从而判断大熊猫初乳或成熟乳。与现有鉴定方法相比，本发明具有如下有益效果：
19.1.本发明首次鉴定了大熊猫乳汁中的蛋白质，为了解大熊猫乳汁的详细营养成分
14.4.200727.47784)与fasta序列数据库进行比对，构建dda谱图库(spectral library)。检索参数设置如下：酶为胰蛋白酶，最大漏裂数为1，固定修饰为碳酰胺甲基，动态修饰为氧化和乙酰基(蛋白质n端)。数据库检索鉴定到的蛋白必须通过设定的过滤参数fdr《1％。
29.3、分别取100μg初乳蛋白和100μg成熟乳蛋白，分别向蛋白中加入30μl sdt缓冲液(4％sds，100mm dtt，150mm tris-hcl ph 8.0)，用ua缓冲液(8m尿素，150mm tris-hcl ph 8.0)重复超滤(microcon units，10kd)后，先用100μl碘乙酰胺(100mm iaa在ua缓冲液中)暗孵育30min，再用100μl ua缓冲液洗涤3次，用100μl 25mm nh4hco3洗涤2次，所得蛋白悬液用4μg胰蛋白酶在40μl 25mm nh4hco3缓冲液中37℃消化过夜，收集滤液作为肽段。取2μg成熟乳肽段和2μg初乳肽段，分别用10μl 0.1％(v/v)甲酸水溶液复溶，并掺入30μl irt标准肽段溶液，所得混合肽段分别进行1次dia模式质谱测试。
30.dia模式数据采集：混合肽段采用纳升级高效液相色谱系统easy nlc-1200进行梯度在线色谱分离。色谱柱为easy-spraytm c18 lc analytical柱(thermo scientific，es802，2μm，75μm*25cm)，流动相：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的a液平衡，流速为300nl/min，分离梯度如下：0～40分钟，b液线性梯度从8％～30％；40～50分钟，b液线性梯度从30％～100％；50～65分钟，b液维持100％。纳升级高效液相色谱分离后的样品用q-exactive hfx谱仪(thermo scientific)进行dia质谱分析，检测模式正离子，一级质谱扫描范围350～1650m/z，质谱分辨率60000@m/z 200，agc(自动增益控制)的目标3e6，最大注入时间为50ms。ms2采用dia数据采集模式，设置30个dia采集窗口，质谱分辨率30000@m/z 200，agc(自动增益控制)的目标3e6，最大注入时间为自动，ms2激活类型hcd，归一化的碰撞能量30ev，光谱数据类型为轮廓。
31.4.将步骤3采集的dia数据采用spectronaut软件(spectronaut
tm 14.4.200727.47784)与步骤2所建的dda数据库进行比对。spectronaut软件参数设置如下：保留时间预测类型设置为动态irt，ms2水平校正设置为允许，交叉运行规范化设置为允许，所有结果必须通过设定的过滤参数fdr《1％。
32.总共鉴定到的蛋白数为1887，鉴定到的肽段数为9106。以定性后的肽段在初乳样品与成熟乳样品中的相对定量值之比的对数值作为判断蛋白丰度水平变化的依据，该对数值大于1.5则为上调蛋白，该对数值小于2/3则为下调蛋白，该对数值处于1.5和2/3之间则该蛋白丰度在初乳和成熟乳样品中无显著变化。对初乳和成熟乳样品中的差异蛋白进行分析，确定了273个差异蛋白，其中上调蛋白75个，下调蛋白198个。
33.5.将步骤4获得的初乳样品与成熟乳样品中上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别取上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，其中上调蛋白中前5％分别为：含肽酶s1结构域的蛋白质(elane)、排序nexin-2蛋白、ef-hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1，下调蛋白中后5％分别为：atp-柠檬酸裂解酶、atp合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40s核糖体蛋白s25(rps25)、延伸率tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含tgc结构域蛋白、ribosomal_l18e/l15p结构域蛋白、ethylmalonyl-coa脱羧酶1(echdc1)，如表1和表2所示。因此，本发明以含肽酶s1结构域的蛋白质(elane)、排序nexin-2蛋白、ef-hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1、atp-柠檬酸裂解酶、atp合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40s核糖体蛋白s25(rps25)、延伸率tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含tgc结构域蛋白、ribosomal_l18e/l15p结构域蛋白、ethylmalonyl-coa脱羧酶1(echdc1)
作为标记蛋白，其中含肽酶s1结构域的蛋白质(elane)、排序nexin-2蛋白、ef-hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1为正相关的标记蛋白，atp-柠檬酸裂解酶、atp合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40s核糖体蛋白s25(rps25)、延伸率tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含tgc结构域蛋白，ribosomal_l18e/l15p结构域蛋白、ethylmalonyl-coa脱羧酶1(echdc1)为负相关的标记蛋白。如果标记蛋白包含正相关的标记蛋白，则说明待测大熊猫乳样品为初乳；如果标记蛋白包含负相关的标记蛋白，则说明待大熊猫乳样品为成熟乳。
34.表1上调蛋白中对数值占前5％标记蛋白
[0035][0036][0037]
表2下调蛋白中对数值占后5％的标记蛋白
[0038][0039]
为了更好考察标记蛋白的差异通路显著性，通过kegg通路数据库对标记蛋白分开上下调进行kegg通路及通路富集分析，如图1所示，大熊猫初乳中丰富的蛋白质与免疫功能和反应相关，包括矿物质吸收、肿瘤坏死因子(tnf)信号通路、免疫球蛋白a(iga)产生的肠道免疫网络以及补体和凝血级联等途径；大熊猫成熟乳中富含的蛋白质主要参与核糖体、脂肪酸降解和氨基酸代谢。