多靶标的群体感应淬灭酶制剂及其制备方法与应用

1.本发明属于群体感应淬灭酶制剂技术领域，具体涉及多靶标的群体感应淬灭酶制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.群体感应是指微生物分泌特定的信号分子并感知其浓度变化，从而对细胞密度的变化做出应答的现象。群体感应系统及分泌的信号分子能够参与调控致病菌多种毒力因子及生物膜的形成，与其毒力和致病性密切相关。目前已发现革兰氏阴性病原菌中存在多种群体感应系统，其对应的信号分子主要为酰基高丝氨酸内酯类(n-acyl homoserine lactones,ahls)、喹诺酮类(quinolones)等，不同群体感应系统和信号分子能够调控不同毒力因子。目前的群体感应淬灭酶制剂中所含的群体感应淬灭酶成分或功能单一，只能降解一类信号分子(ahls)来抑制群体感应，无法有效抑制复杂群体感应系统和其调控的多种毒力因子；此外，病原菌致病存在着共存现象，如在细菌性呼吸道感染病灶中，往往存在着多种病原菌共存，病原菌之间存在种群内和种群间群体感应和信息交流，可能通过信号分子诱导共生菌发挥其致病性，针对病原菌中单一种类的群体感应系统进行抑制可能无法达到较好的治疗效果。
3.铜绿假单胞菌是引起烧创伤、免疫缺陷或肺纤维化等病人感染最主要的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌可以通过分泌多种毒力因子如绿脓菌素、绿色荧光素、胞外蛋白酶及生物膜形成等方式，引起宿主致病。如弹性蛋白酶能够引起组织损伤和炎症，促进病原体的入侵和定殖。绿脓菌素破坏宿主的防御机制，引发肺囊性纤维化疾病。绿色荧光素是铜绿假单胞菌重要的铁载体，调节毒素的分泌产生，破坏宿主的铁环境。目前，由于广谱抗生素的广泛使用以及铜绿假单胞菌极易产生耐药性，为临床上控制铜绿假单胞菌感染带来极大困难。因此，开发针对铜绿假单胞菌及其共存菌群的新型抑菌剂对临床上铜绿假单胞菌及其共存菌群感染的预防与控制具有重要意义。铜绿假单胞菌具有复杂的群体感应级联调控系统，铜绿假单胞菌的las群体感应系统、rhl群体感应系统分别受ahl类信号分子3-oxo-c12-hsl、c4-hsl调控，pqs群体感应系统受信号分子pqs调控，las、rhl群体感应系统主要调控蛋白酶、绿脓菌素等毒力因子合成，pqs群体感应系统主要调控绿色荧光素等毒力因子形成。抑制铜绿假单胞菌复杂群体感应系统是实现多种毒力因子综合抑制的有效途径。此外，由于铁是致病菌所需的重要营养物质，限制可利用的铁离子浓度也可以抑制生物膜合成，作为抗生素治疗的替代策略。
4.现有专利、成果中仅包含单一类别的群体感应淬灭酶，例如：
5.(1)成果“靶向特异性ahl内酯酶对肺部铜绿假单胞菌感染的干预研究”采用对氧磷酶降解铜绿假单胞菌信号分子3-oxo-c12-hsl，抑制该菌群体感应系统和致病性。
6.(2)专利“一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其药物”采用单一酰基高丝氨酸内酯酶aiik抑制铜绿假单胞菌的生物膜、毒力因子胞外蛋白酶和绿脓菌素。
7.(3)专利“一种群体感应淬灭酶olb-26及其编码基因和应用”主要提供了一种融合
群体感应淬灭酶的氨基酸序列并测定了其酶活特性，该融合蛋白将两种降解不同ahl信号分子的群体感应淬灭酶aiio和aiia编码基因融合。
8.(4)中文文献“群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响”利用单一n-酰基高丝氨酸内酯酶aiia作用于铜绿假单胞菌，抑制其生物膜合成、毒力因子绿脓菌素和总蛋白酶形成。


技术实现要素：

9.为弥补现有技术的不足，本发明的构思如下：
10.本发明提供了两种群体感应淬灭酶，包括酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶和3-羟基-4-氧代喹诺酮2，4-双加氧酶。本发明采用的酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶能够降解铜绿假单胞菌las群体感应系统、rhl群体感应系统的信号分子3-oxo-c12-hsl、c4-hsl以及其它致病菌中ahl类信号分子(酰基侧链长度为4-14的ahl，酰基侧链可以有或无3-氧或3-羟基取代)，双加氧酶能够降解pqs系统的信号分子pqs。本发明通过制备高产量和较高稳定性的双加氧酶，进而通过两种酶的用量调控及联用，有效抑制了毒力因子合成，并通过亚抑菌浓度去铁酮的用量调控及辅助添加，有效抑制了铜绿假单胞菌生物膜的形成。该制剂能够有效抑制铜绿假单胞菌复杂群体感应系统调控的致病性，避免其产生耐药性，也能够抑制引起呼吸道感染及烧伤感染的、能合成ahl或能应答ahl后促进毒力和生物膜的铜绿假单胞菌共存革兰氏阴性菌群。
11.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
12.多靶标的群体感应淬灭酶制剂，主要用于对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制，包括酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶aiio蛋白和3-羟基-4-氧代喹诺酮2，4-双加氧酶aqdc蛋白，两者的质量比为20：(1-25)；主要用于对铜绿假单胞菌毒力因子和生物膜合成的抑制，还包括去铁酮(dfp)，aiio蛋白、aqdc蛋白和去铁酮的质量比为20：(1-25)：(0.695-2.78)。
13.进一步的，所述aqdc蛋白由iptg诱导表达制备而成，包括如下步骤：
14.将质粒pet28b( )::his8-aqdci化学转化或电转化大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)，利用重组工程菌e.coli bl21(de3)-pet28b( )::his8-aqdci对群体感应淬灭酶aqdc进行iptg诱导表达，将重组工程菌1％接种至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，180rpm条件下活化10h，活化后的菌液1％转接至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，180rpm条件下培养至菌体密度值od
600
达到0.6-0.8时，添加终浓度为0.2mm的iptg诱导目的蛋白表达，16℃，180rpm条件下培养20-24h，进行目的蛋白的纯化；
15.蛋白纯化：收集菌体，将菌液4℃条件下离心10min，弃去上清液，菌体沉淀用bindingbuffer充分悬浮，binding buffer：20mm tris-hcl(ph 8.0)、150mm nacl、2mmβ-巯基乙醇；使用超声波破碎仪对菌悬液进行破碎，破碎后的菌液4℃高速离心40min，将破碎离心后的上清液转移至结合镍离子的亲和层析柱中，层析柱于冰浴条件下振荡40min后，弃去过柱液体，在层析柱中分两次共加入上样体积2-3倍的washing buffer(wb)，弃去过柱液体，再向层析柱中加入15ml elution buffer(eb)，收集过柱液体，washing buffer(wb)：20mmol/l tris-hcl(ph 8.0)、150mmol/l nacl、50mmol/l咪唑，elution buffer(eb)：20mmol/l tris-hcl(ph 8.0)、150mmol/l nacl、300mmol/l咪唑。将elution buffer洗脱下
的目的蛋白超滤浓缩，利用凝胶层析柱脱盐纯化，流速为2ml/min，压强为0.4mpa，收集目的蛋白出峰位置的流出液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，测定纯化后的目的蛋白浓度，蛋白溶液超滤浓缩，加入10％灭菌后的甘油，分装冻存。
16.进一步的，所述群体感应淬灭酶aqdc蛋白由乳糖自诱导方法制备而成，包括如下步骤：
17.将e.coli bl21(de3)-pet28b( )::his8-aqdci在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的10ml高密度增殖液体培养基中活化后，按3
‰
接种量转接至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的200ml乳糖自诱导培养基中，刻度为1l的挡板摇瓶中，乳糖自诱导培养基的装液量为200ml，37℃，180rpm条件下培养至菌体密度od
600
达到0.6-0.8，降温至20-25℃，250rpm条件下利用挡板摇瓶培养24h，蛋白纯化方法与上述纯化方法相同。
18.多靶标的群体感应淬灭酶制剂的应用，可以用于抑制引起呼吸道感染及烧伤感染的多种革兰氏阴性病原菌，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等能合成ahl或能应答ahl后促进毒力和生物膜的共存菌群。
19.进一步的，所述共存菌群为铜绿假单胞菌菌群，具体的，在抑制铜绿假单胞菌复杂群体感应系统及其所调控毒力因子和生物膜合成的抑制方面的应用。
20.aqdc和aiio蛋白联用对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制，具体操作方法为：
21.铜绿假单胞菌于12孔板中培养8h后，向孔板中添加纯化的aqdc和aiio蛋白溶液，每ml培养液中添加10-250μgaqdc蛋白与200μgaiio蛋白进行联用，培养至24h。
22.aqdc、aiio蛋白和去铁酮联用对铜绿假单胞菌毒力因子和生物膜合成的抑制，具体操作方法为：
23.铜绿假单胞菌于12孔板中培养8h后，向孔板中添加纯化的aqdc和aiio蛋白溶液以及去铁酮溶液，每ml培养液中添加10-250μgaqdc蛋白、200μgaiio蛋白与50-200μm去铁酮溶液进行联用，培养至24h。
24.与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
25.现有技术采用单一类别群体感应淬灭酶，无法针对铜绿假单胞菌复杂的群体感应系统进行抑制，从而较为全面地抑制毒力因子合成。本发明提出的多靶标群体感应淬灭酶制剂能够靶向性抑制铜绿假单胞菌的las群体感应系统、rhl群体感应系统和pqs群体感应系统，其中，制备得到的aqdc蛋白产量和稳定性均较高，两类酶调控用量后联用，能够有效抑制铜绿假单胞菌中不同群体感应途径所调控的毒力因子，包括胞外总蛋白酶、绿脓菌素、绿色荧光素等；去铁酮调控用量并与两类群体感应淬灭酶联用，能够有效避免铁释放引起的生物膜增加，有效抑制铜绿假单胞菌生物膜形成，从而综合有效地抑制铜绿假单胞菌毒力和生物膜，也能够有效抑制铜绿假单胞菌及其共存的革兰氏阴性病原菌群。
附图说明：
26.图1(a)为aqdc蛋白乳糖自诱导表达及纯化结果，其中m：blue plusⅱ蛋白marker；1：未诱导全蛋白；2：诱导全蛋白；3：发酵液离心后上清；4：菌体破碎后胞内上清；5：菌体破碎后胞内沉淀；6：亲和层析纯化后蛋白；7：脱盐后浓缩蛋白；
27.图1(b)为群体感应淬灭酶aqdc比活力稳定性；
28.图2为群体感应淬灭酶aqdc对铜绿假单胞菌毒力因子的影响；
29.图3为群体感应淬灭酶aiio对铜绿假单胞菌毒力因子的影响；
30.图4为群体感应淬灭酶aiio和aqdc联用对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制作用；
31.图5为群体感应淬灭酶单独应用和联合应用方式对铜绿假单胞菌毒力因子抑制作用的比较；
32.图6为群体感应淬灭酶aqdc、aiio与去铁酮联用对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制作用；
33.图7为群体感应淬灭酶aqdc、aiio与去铁酮联用对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用。
具体实施方式
34.为了更好地理解本发明的内容，下面将结合具体实施案例来进一步阐述本发明。以下实施例以本发明的技术为基础实施，结合了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述实施例。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
35.实施例1群体感应淬灭酶aqdc的表达纯化及比活力稳定性测定
36.利用重组工程菌e.coli bl21(de3)-pet28b( )::his8-aqdci对群体感应淬灭酶aqdc进行iptg诱导表达。将重组工程菌1％接种至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，180rpm条件下活化10h，活化后的菌液1％转接至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，180rpm条件下培养至菌体密度值od
600
达到0.6-0.8时，添加终浓度为0.2mm的iptg诱导目的蛋白表达，16℃，180rpm条件下培养20-24h，进行目的蛋白的纯化。
37.蛋白纯化：收集菌体，将菌液4℃条件下离心10min，弃去上清液，菌体沉淀用bindingbuffer充分悬浮。binding buffer：20mm tris-hcl(ph 8.0)、150mm nacl、2mmβ-巯基乙醇；使用超声波破碎仪对菌悬液进行破碎。破碎后的菌液4℃高速离心40min，将破碎离心后的上清液转移至结合镍离子的亲和层析柱中，层析柱于冰浴条件下振荡40min后，弃去过柱液体。在层析柱中分两次共加入上样体积2-3倍的washing buffer(wb)，弃去过柱液体。再向层析柱中加入15ml elution buffer(eb)，收集过柱液体。washing buffer(wb)：20mmol/l tris-hcl(ph 8.0)、150mmol/l nacl、50mmol/l咪唑。elution buffer(eb)：20mmol/l tris-hcl(ph 8.0)、150mmol/l nacl、300mmol/l咪唑。将elution buffer洗脱下的目的蛋白超滤浓缩，利用凝胶层析柱脱盐纯化，收集出峰位置的流出液，对目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，测定纯化后的目的蛋白浓度。纯化后的蛋白溶液进行超滤浓缩，加入10％灭菌后的甘油，分装冻存。
38.除通过上述iptg诱导方法诱导蛋白表达外，还可以用乳糖自诱导方法诱导蛋白表达。将e.coli bl21(de3)-pet28b( )::his8-aqdci在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的10ml高密度增殖液体培养基中活化后，按3
‰
接种量转接至含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的200ml乳糖自诱导培养基中，刻度为1l的挡板摇瓶中，乳糖自诱导培养基的装液量为200ml。37℃，180rpm条件下培养至菌体密度od
600
达到0.6-0.8，降温至20-25℃，250rpm条件下利用挡板摇瓶培养24h，蛋白纯化方法与上述纯化方法相同。
39.高密度增殖培养基(1l)：葡萄糖5g、磷酸氢二钠3.55g、磷酸二氢钾3.4g、氯化铵
2.68g、硫酸钠0.71g、七水合硫酸镁0.5g、柠檬酸三钠0.3g、六水合琥珀酸钠2.5g、三氯化铁(0.1m)1ml，加去离子水定容，ph 7.0，120℃湿热灭菌20min。
40.乳糖自诱导培养基(1l)：蛋白胨10g、酵母粉5g、磷酸氢二钠3.56g、磷酸二氢钾3.4g、氯化铵2.68g、硫酸钠0.71g、七水合硫酸镁0.5g、甘油20ml、葡萄糖0.5g、乳糖2g、柠檬酸盐0.3g、琥珀酸盐5.4g、三氯化铁(0.1m)1ml，加去离子水定容，ph 7.0，120℃湿热灭菌20min。
41.aqdc蛋白比活力及其稳定性测定方法如下：在tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中，pqs的终浓度为45μm，添加终浓度1.7μm的aqdc蛋白，反应体系总体积为2ml，通过酶标仪测定反应混合物od
377
的变化，计算体系中pqs的剩余量，以表征aqdc催化降解pqs的酶活力。pqs浓度计算方法：a＝εbc，其中a(吸光度)、ε＝10.89
×
103m-1
cm-1
、b(光程，cm)、c(浓度)。aqdc蛋白的酶活力定义：在30℃下，1min分解1μmol pqs所需的酶量定义为一个酶活力单位(u)。aqdc蛋白的比活力定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力，以u/mg表示。aqdc蛋白放置在37℃恒温培养箱中孵育，定时取样，测定aqdc蛋白的比活力及其稳定性。
42.结果表明，iptg诱导aqdc蛋白表达，每升发酵液可得到9.3mg纯化aqdc蛋白。采用乳糖自诱导技术诱导aqdc蛋白表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1(a)所示。乳糖自诱导后目的蛋白aqdc的表达量显著增多，每升发酵液可得到20.1mg纯化aqdc蛋白，是iptg诱导表达的两倍左右。图1(b)为纯化后的aqdc在37℃孵育后的比活力及其稳定性，该蛋白在16h内的比活力具有较好的稳定性。
43.实施例2群体感应淬灭酶aiio的表达纯化
44.利用构建的大肠埃希氏菌escherichia coli bl21(de3)-pet28a( )-aiio表达重组蛋白aiio，蛋白表达与分离纯化方法同实施例1。
45.实施例3群体感应淬灭酶aqdc和aiio联用对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制
46.铜绿假单胞菌在37℃、180rpm条件下过夜培养，过夜培养物用无菌lb培养基稀释至od
600
为1，再将稀释菌液1％转接至12孔板中无菌lb培养基，37℃恒温培养箱中培养8h后，向孔板中添加纯化的aqdc和aiio蛋白溶液。蛋白单独应用实验中，实验组每ml培养液添加aqdc蛋白质量为10、100、250μg；实验组每ml培养液添加aiio蛋白质量为10、100、200μg；aqdc和aiio联合应用实验中，实验组每ml培养液添加10、100、250μgaqdc蛋白和200μgaiio蛋白。对照组中加入含有10％甘油的无菌tris-hcl缓冲液，对照组添加的缓冲液体积和实验组蛋白溶液体积保持一致，每组设置3个重复。培养至24h测定毒力因子。
47.绿脓菌素测定：吸取孔板中培养液至2ml离心管中，4℃高速离心5min，取离心后上清液，加入1ml氯仿，震荡混匀后，4℃条件下高速离心5min。弃去上层清液，保留下层有机相，向有机相中加入250μl 0.2m hcl，震荡混匀后，4℃条件下高速离心5min。吸取上层无机相150μl于96孔板中，使用酶标仪测定od
520
，以表征绿脓菌素含量。
48.绿色荧光素测定：吸取孔板中培养液至2ml离心管中，4℃高速离心5min，吸取100μl上清液于2ml离心管中，加入900μl 50mm tris-hcl(ph 7.4)稀释。吸取100μl稀释液于白色不透明96孔板中，使用酶标仪测定在400nm激发光下460nm的荧光强度，以表征绿色荧光素含量。
49.胞外总蛋白酶测定：吸取孔板中培养液至2ml离心管中，4℃高速离心5min，吸取50μl上清于2ml离心管中，加入400μl 1.25％脱脂牛奶，37℃反应7min。吸取150μl反应后的溶
液于96孔板中，测定od
600
，为脱脂牛奶中剩余蛋白比浊结果，以1/剩余蛋白测定值表征胞外总蛋白酶活力。
50.利用spss软件对数据进行统计学分析，数据代表了来自三个独立的生物重复实验的平均值
±
标准偏差，采用anova分析和tukey hsd检验对数据进行分析(*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001)。对照组绿脓菌素、绿色荧光素测定值水平设置为1，对照组胞外总蛋白酶活力水平设置为1，用黑线表示，实验组测得数据进行归一化处理。
51.对培养24h后铜绿假单胞菌毒力因子进行测定，结果如图2所示。分析发现，aqdc添加量达到250μg/ml时，总蛋白酶和绿脓菌素被显著抑制；aqdc对绿色荧光素的抑制效果好，添加量为10-250μg/ml时对绿色荧光素均有极显著抑制作用。添加aqdc蛋白后，3种毒力因子的表达与对照组相比均有所下降。aqdc添加量250μg/ml时，绿脓菌素水平为对照组的74.89％，绿色荧光素水平为对照组的23.53％，胞外总蛋白酶水平为对照组的95.21％。
52.结合图3发现，在aiio蛋白的添加量为200μg/ml时，绿脓菌素的表达被抑制。aiio蛋白对胞外总蛋白酶的抑制效果极显著，随aiio蛋白浓度的增加对胞外总蛋白酶的抑制作用逐渐增强。100、200μg/ml的aiio蛋白对绿色荧光素的抑制效果非常显著。aiio添加量200μg/ml时，绿脓菌素水平为对照组的76.31％，绿色荧光素水平为对照组的55.58％，胞外总蛋白酶水平为对照组的60.40％。
53.将10-250μg/ml的aqdc和200μg/ml的aiio进行联用，结合图4，发现几种不同浓度的联合方式均能使3种毒力因子全部得到抑制。蛋白添加组合为aiio 200μg/ml aqdc 250μg/ml时3种毒力因子的抑制效果非常显著，此种蛋白添加组合方式下，绿脓菌素水平为对照组的40.73％，绿色荧光素水平为对照组的8.96％，胞外总蛋白酶水平为对照组的55.95％。明显优于两种群体感应淬灭酶单独使用时对毒力因子的抑制效果。
54.比较上述几种添加方式对毒力因子抑制效果，可以发现，aiio等于200μg/ml aqdc 10-250μg/ml或大于该范围，是两类群体感应淬灭酶较优的联用方式。联合添加两类群体感应淬灭酶有利于综合抑制铜绿假单胞菌中两类群体感应系统，相较于单独添加仅能抑制一类信号分子的群体感应淬灭酶，对多种毒力因子有更明显的抑制作用(图5)。
55.实施例4群体感应淬灭酶与去铁酮联用对铜绿假单胞菌毒力因子和生物膜的抑制
56.将去铁酮(dfp)用无菌水配置成12.8mm的储液，利用0.2μm无菌滤膜除菌备用。铜绿假单胞菌于12孔板中培养8h后，孔板中每ml铜绿假单胞菌培养液添加纯化的aqdc蛋白250μg、aiio蛋白200μg和亚抑菌浓度的去铁酮溶液(终浓度为100μm)。对照组添加的缓冲液体积和实验组添加溶液体积保持一致，每组设置3个重复。培养至24h测定毒力因子和生物膜。毒力因子测定方法及数据分析方法与实施例3中相同。
57.生物膜测定：弃去培养后孔板中的悬浮细胞，使用pbs轻轻清洗孔板内壁直至无残留悬浮细胞。每孔添加等培养液体积的冰甲醇固定30min。吸弃甲醇，待孔板中甲醇完全挥发后，每孔添加等培养液体积的0.2％结晶紫溶液，染色30min。吸弃结晶紫溶液，用去离子水轻轻清洗孔板内壁纸直至无残余结晶紫，待孔板干燥后，每孔添加等培养液体积的33％冰醋酸，使用酶标仪测定od
595
，以表征生物膜含量。
58.数据代表了来自三个独立的生物重复实验的平均值
±
标准偏差。对照组生物膜测定值水平设置为1，用黑线表示，实验组测得数据进行归一化处理。
59.选择组合aqdc 250μg/ml aiio 200μg/ml与亚抑菌浓度的100μm去铁酮联用，对毒
力因子和生物膜的形成进行测定。图6、7发现，三者联用后，同样对毒力因子有较好抑制效果，此外，生物膜的抑制效果明显提高，生物膜为对照组的70.04％。
60.两种群体感应淬灭酶联用过程中，可以如本发明所述分别添加两种群体感应淬灭酶，也可以添加利用重组菌表达并纯化的融合蛋白。融合蛋白获得方法：通过pcr扩增分别制备两种群体感应淬灭酶aqdc和aiio基因片段，以纯化后的上述两种pcr产物为模板进行重叠pcr，制备aqdc和aiio编码基因的融合基因，两种编码基因片段之间可以用一定长度的连接肽基因进行连接。进而将纯化后的融合基因片段插入载体pet28a( )或pet28b( )的多克隆位点得到重组质粒，将所述重组质粒化学转化或电转化大肠杆菌得到重组菌，所述大肠杆菌可为大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)。按本发明中重组菌株培养方法及蛋白表达纯化方法，可以对融合蛋白进行表达纯化。
61.以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。